Аннотация результатов, полученных в 2021 году
За подотчетный период были выполнены все запланированные задачи. Были сформированы группы пациентов, вошедшие в исследование. В исследование были включены 38 мужчин и 24 женщины, в возрасте от 19 до 75 лет с морфологически подтвержденным диагнозом хронического гломерулонефрита. Критериями включения были активное течение нефрита с протеинурией более 1 г/сут со скоростью клубочковой фильтрации выше 15 мл/мин/1.73м2. Критериями исключения являлись: активная мочевая инфекция, сахарный диабет, морбидное ожирение, тяжелая артериальная гипертензия, заболевания печени, ревматические системные заболевания, хроническая болезнь почек 5 стадии, злокачественные заболевания системы крови. Всем участникам было проведено клинико-лабораторное обследование, включающее сбор анамнеза, объективный осмотр с измерением АД, лабораторные исследования на общий и биохимический анализ крови, общий анализ мочи и анализ мочи на суточную протеинурию. У 25 пациентов было выявлено нарушение функции почек (рСКФ CKD-EPI < 60 мл/мин/1,73м2). Инструментальные исследования показали, что 30 участников имели фокальный сегментарный гломерулосклероз (ФСГС), 12 – болезнь минимальных изменений (БМИ), 17 – мембранозную нефропатию (МН), 3 - IgA нефропатию. У всех участников были собраны и биобанкированы образцы сыворотки крови и мочи, а также парафинизирваны биоптаты почки. Согласно дизайну исследования пациенты были разделены на группы с активным течением нефрита и ремиссией заболевания. При проведении исследования предполагается сравнение результатов групп активного нефрита, ремиссии и здоровых контролей. Кроме того, пациенты с активным течением заболевания будут разделены по морфологическому варианту гломерулонефрита и по степени нарушения функции почек. С целью выбора оптимального способа пробоподготовки для последующего масс-спектрометрического (МС) анализа на образцах мочи с протеинурией были протестированы 3 ранее опубликованных метода концентрирования, очистки и гидролиза белков, из которых наиболее эффективным оказался метод осаждения белков ледяным ацетоном [Ding H, et al. (2020) J Proteome Res. 19(4):1857-1862. doi: 10.1021/acs.jproteome.9b00772]. Этот метод с небольшими модификациями был использован для дальнейших исследований. Кроме того была проведена оптимизация методики для получения пептидной фракции плазмы и сыворотки крови, пригодной для дальнейшего МС анализа. Были выбраны 60% ACN и 30 минутная температурная обработка при +50-70 °С как наиболее подходящие условия для удаления «тяжелой фракции» с максимальным сохранением пептидов. Хромато-масс-спектрометрический (ВЭЖХ-МС) анализ белков мочи из образцов пациентов с хронический гломерулонефритом (ХГН) проводили на ВЭЖХ-системе Dionex Ultimate 3000 (Thermo Fisher Scientific, США), соединенной с масс-спектрометром TIMS TOF Pro (Bruker Daltonics, США), с использованием метода сбора данных с помощью параллельного накопления и последовательной фрагментации (PASEF) в режиме DDA (сбор данных в зависимости от данных). Полученные данные анализировали с использованием программного обеспечения PEAKS Studio 8.5. Поиск проводили с использованием базы данных Swissprot белков человека. В результате исследования протеомной композиции образцов мочи пациентов с ФСГС были выявлены различия в протеомном составе внутри групп с сохраненной и нарушенной функцией почек. Из 222 белков, имевших высокую воспроизводимость в разных образцах, 34 имели почечное происхождение и были задействованы в SLC-опосредованном трансмембранном транспорте. Анализ протеомной композиции образцов мочи пациентов с МН выявил снижение уровня остеопонтина (OSTP) при нарушении функции почек. Кроме того, были выявлены белки ассоциированые с системными воспалительными процессами (F2, SERPINC1, APOA2, AHSG), а также с имунными процессами (APOA1, HPX, APOA2, RBP4, B2M). Сравнение между собой групп пациентов с ФСГС и МН позволило выявить различия по уровню 20 белков внеклеточного матрикса, принимающих участие в регуляции биологических процессов и ответах на внешние воздействия (APOH, LBP, VTN, HRG, APOA1, C3, SERPINF1, C9, C2, FGB, FGA, C8A, APOA2, CFB). Набор выявленных отличающихся белков можно рассматривать в качестве основы для создания маркерной панели дифференцирующей очень близкие по симптоматике нефропатии ФСГС и МН. Совместно с сотрудниками ЦКП «Протеом человека» ИБМХ РАН были выбраны наиболее перспективные белки-потенциальные маркеры и проведен синтез соответствующих уникальных триптических пептидов для дальнейшей валидации белков-мишеней на следующем этапе проекта. Также у 65 пациентов с хроническим гломерулонефритом уровни uPAR (рецептор активатора плазминогена урокиназного типа) и CLCF-1 (кардиотрофин-подобный цитокин-1) измеряли с помощью иммуноферментного метода в сыворотке крови. Полученные данные указывают на то, что сывороточный uPAR может рассматриваться как потенциальный биомаркер ФСГС независимо от активности заболевания, в то время как CLCF-1 отражает выраженность нефротического синдрома и липидных нарушений у больных с нефротическим синдромом. Для дальнейшего исследования протеома крови пациентов были проведены предварительные эксперименты на здоровых донорах с целью отработки оптимального протокола работы. По результатам проделанной работы опубликована статья: Kashirina D., et. al. PROTEOMIC CHARACTERIZATION OF DRY BLOOD SPOTS OF HEALTHY WOMEN DURING SIMULATION THE MICROGRAVITY EFFECTS USING DRY IMMERSION Frontiers in Physiology, 2021 (Q1, ИФ 4,566). По теме проекта проведен обширный анализ публикаций за период 2015-2021 гг. с целью анализа данных и выявления потенциальных белковых маркеров, которые могли бы дифференцировать различные хронические болезни почек, включая болезнь минимальных изменений (БМИ), фокальный сегментарный гломерулосклероз (ФСГС), мембранозную нефропатию (МН), IgA-нефропатию (IgA-Н), диабетическую нефропатию и волчаночный нефрит. По результатам анализа был сделан вывод, что протеомные исследования мочи имеют большой потенциал как для разработки высокоинформативных неинвазивных методов диагностики заболеваний почек, так и для выяснения ключевых патогенетических механизмов прогрессирования заболевания и определения терапевтических мишеней для подавления заболеваний. По результатам проделанной работы опубликована статья: Chebotareva, N., Vinogradov, A., McDonnell, V., Zakharova, N. V., Indeykina, M. I., Moiseev, S., Nikolaev, E.N., and Kononikhin, A. S. (2021). Urinary Protein and Peptide Markers in Chronic Kidney Disease. International Journal of Molecular Sciences, 22(22), 12123, https://doi.org/10.3390/ijms222212123 (Q1, ИФ 5,924).

Аннотация результатов, полученных в 2022 году
За подотчетный период были собраны дополнительные клинические образцы мочи и сыворотки крови 123 добровольцев, включающих 46 здоровых донора и 77 пациентов с различными хроническими гломерулонефритами. Было отмечено, что группа с фокально-сегментарным гломерулосклерозом (ФСГС) в целом показала высокую вариабельность между пациентами внутри группы. Таким образом, для комплексной оценки этой когорты был введен специальный индекс, учитывающий уровень расчетной скорости клубочковой фильтрации (рСКФ), выраженность протеинурии и наличие стероидорезистентности и нефротическиого синдрома. По этим показателям пациенты с ФСГС были разделены на две группы: легкий ФСГС (лФСГС), и выше - тяжелый ФСГС (тФСГС). Эти две подгруппы достоверно не различались по выраженности нефротического синдрома и почечной дисфункции в дебюте заболевания. Однако в катамнезе больные второй группы характеризовались более тяжелым течением ФСГС, что выражалось в нарушении функции почек и стероидорезистентности. Дополнительно были проведены исследования уровня антител к убиквитин С-концевой гидролазе L1 (UCHL1) в сыворотке крови больных. По результатам оценки уровня антител к убиквитин С-концевой гидролазе L1 (UCHL1) в сыворотке крови больных гломерулопатиями была выявлена корреляция с уровнем креатинина в сыворотке крови/рСКФ (Rs = –0,376, p = 0,001 и Rs = 0,318, p = 0,007 соответственно). Оказалось, что анти-UCHL1 антитела были значительно выше у пациентов с ФСГС, чем во всех других группах. Работы с сывороткой крови будут продолжены на следующем этапе. Основное внимание на данном этапе проекта уделялось протеомному анализу мочи пациенов с целью выявления и валидации потенциальных белков-мишеней в моче, участвующих в патогенезе хронического гломерулонефрита (ХГН). В связи с этим была проведена дополнительна доработка метода приготовления образцов мочи для для таргетного количественного MRM (multiple reaction monitoring) анализа. Пробоподготовку проводили в два этапа в соответствие с адаптированными методами, выбранными на предыдущем этапе проекта. Для таргетного количественного MRM анализа в каждый образец добавляли смесь изотопно-меченных пептидов SIS (stable isotope standard) с последующим обессоливанием путем твердофазной экстракции с использованием планшетов (96-луночный планшет Oasis HLB Microelution, Waters, США). Элюат лиофилизировали и растворяли в 0,1% муравьиной кислоте до концентрации 0,5 мг/мл для дальнейшего анализа ЖХ-МС/МС. Нормировку количества общего белка проводили перед трипсинолизом и последующим МС-анализом в связи со значительной вариабельностью концентраций общего белка в исследуемых образцах мочи. Смесь пептидов SIS добавляли в образец мочи в сбалансированной концентрации, которая была оптимизирована в экспериментах с сериями разведений образцов мочи с протеинурией. Пробоподготовку образцов сыворотки проводили аналогичным образом с использованием 10 мкл каждого образца. После трипсинолиза в образцы добавляли пептиды SIS, очищали их твердофазной экстракцией и лиофилизировали досуха для последуюшего ЖХ-МС/МС анализа (работы с сывороткой крови будут продолжены на следующем этапе). Для предварительного выявления потенциальных белков-мишеней был проведен безметковый панорамный МС анализ (label-free) образцов мочи схожих по манифестации пациентов с БМИ и ФСГС. Образцы триптических пептидов анализировали методом жидкостной хроматографии в сочетании с тандемной масс-спектрометрией (ЖХ-МС/МС) на основе системы нано-ВЭЖХ Dionex Ultimate3000 (Thermo Fisher Scientific, США) и масс-спектрометра timsTOF Pro (Bruker Daltonics, США). Масс-спектрометрический анализ проводили с использованием метода сбора данных с параллельным накоплением и последовательной фрагментацией (PASEF). Широкий спектр белков мочи был обнаружен на повышенных уровнях в группе пациентов с тФСГС. Например, обнаружено увеличение компонентов комплемента С3, С4В, фактора В, а также компонентов мембраноатакующего комплекса С8а и С9. Обнаружение ретинол-связывающего белка 4 и витамин D-связывающих белков в моче является следствием тубуло-интерстициального воспаления и повреждения канальцевого эпителия на фоне гломерулярной протеинурии. Одновременно с интерстициальным воспалением также активируются накопление компонентов внеклеточного матрикса (ВКМ) и тубуло-интерстициальный фиброз. Альфа-2-HS-гликопротеин можно отнести к группе белков, ответственных за активные процессы накопления ВКМ, экспрессию рецепторов на клетках и метаболизм белков ВКМ. При отдельном рассмотрении пациентов с ФСГС были обнаружены незначительные различия белкового профиля у пациентов с сохраненной и нарушенной функцией почек. В частности, у пациентов с нарушением функции почек выявлены более высокие уровни белка, связывающего гормоны щитовидной железы, β2-микроглобулина, витамина D-связывающего белка, альфа-2-HS-гликопротеина (фетуина А). Белки, которые различаются между группой тФСГС и БМИ, оказались на 83% идентичными белкам, различающим две группы ФСГС. Также оказалось, что, как и у пациентов группы лФСГС, в образцах пациентов с БМИ также повышены уровни остеопонтина и ингибитора фосфоинозитид-3 киназы, в то время как белки комплемента, аполипопротеины, гемопексин, витронектин и другие белки в моче остаются низкими. Результаты безметкового анализа были подтверждены с помощью таргетного ЖХ-МС анализа на основе мониторинга множественных реакций (MRM). Таргетный количественный анализ ЖХ-МС проводили с использованием синтетического меченого стабильным изотопом внутреннего стандарта (SIS) и природных (NAT) синтетических протеотипических пептидов для измерения соответствующих белков в моче. Для каждого белка-мишени были построены калибровочные кривые с использованием пептидных стандартов NAT и SIS, причем в качестве матрицы использовался пулированный образец мочи выбранных пациентов. Параметры ЖХ-МС, такие как градиент ЖХ и параметры MRM (сканы Q1 и MRM), были адаптированы и оптимизированы на основе предыдущих исследований. Все образцы анализировали в двух повторностях с помощью системы ВЭЖХ-МС, состоящей из системы ExionLC™, соединенной в режиме онлайн с тройным квадрупольным масс-спектрометром SCIEX QTRAP 6500+ (SCIEX, Канада). Объем загружаемого образца составлял 10 мкл. Масс-спектрометрические измерения проводили с использованием метода регистрации MRM. Для количественного анализа было использовано программное обеспечение Skyline Quantitative Analysis (версия 20.2.0.343). На данном этапе, для синтеза SIS и NAT пептидов проводилось активное взаимодействие с ЦКП ИБМХ РАН (ОИ), были приготовлены SIS и NAT пептиды для 47 из 76 белков, идентифицированных как дифференцирующие, по крайней мере, между одной парой групп пациентов. В итоге с помощью разработанных метод количественного анализа белков в моче удалось выявить и валидировать 22 белка со значительными различиями по крайней мере между двумя группами больных, и 14 белков были подтверждены двумя комплементарными методами анализа (label-free и MRM SIS). Кроме того, все 22 белка, проверенных с помощью таргетного анализа (MRM SIS), показали то же направление изменений, что и на этапе обнаружения с помощью панорамного LC-MS анализа без метки (label-free), то есть повышение или понижение регуляции в группах пациентов с БМИ и лФСГС по сравнению с тФСГС. Более того, стоит отметить, что полученные значения по кратности изменения выбранных белков хорошо согласуются для двух методов количественного анализа (label-free и MRM SIS). Основные результаты работы были представлены на 4-х научных мероприятиях и опубликованы 2 статьи в рецензируемых журналах (Clin Nephrol. и IJMS).

Аннотация результатов, полученных в 2023 году
В 2023г были продолжены работы совместно с клиникой ревматологии, нефрологии и профпатологии им. Е.М. Тареева (Первого Московского государственного медицинского университета имени И.М. Сеченова) по разработке малоинвазивного подхода для диагностики хронических болезней почек (ХБП). На данном этапе все основные работы по протеомному анализу проводили методом таргетной масс-спектрометрии с использованием мониторинга множественных реакций (MRM) и наборов изотопно-меченных пептидов, заготовленных в рамках предыдущих этапов исследования, совместно с ЦКП ИБМХ (ОИ). Помимо работы с пробами мочи пациентов были интенсифицированы работы по параллельному анализу образцов сыворотки крови. Были дополнительно собраны пробы сыворотки от 77 пациентов с активной гломерулопатией (41 - ФСГС, 11 — БМИ и 25 — МН) и 11 здоровых доноров с целью выявления наиболее перспективных белков-маркеров для оценки состояния почечной функции. В соответствии с планом работ было проведено расширение выборки образцов мочи с целью валидации ранее выявленных маркеров ХБП, а также создание более точных дифференцирующих панелей. Дополнительно были включены в исследование 60 пациентов с активными гломерулопатиями: 29 – ФСГС, 10 – БМИ, 10 – МН и 11 – IgA-нефропатией. Были проведены исследования по нескольким направлениям, более подробно описанным ниже. В соответствии с планом работ были проведены исследования по нескольким направлениям: 1) Разработка набора пептидных стандартов для количественного MRM-анализа белков мочи. В рамках настоящего проекта нами была разработана панель из 177 белков и соответствующих им пептидов. Для каждого белка-мишени синтезировалась пара пептидов-стандартов: немеченный «легкий» пептид (NAT), полностью аналогичный природному пептиду, и парный ему меченный стабильными изотопами «тяжелый» пептид (SIS). Для количественного анализа проводилось построение калибровочной кривой для каждой пары пептидов (NAT/SIS) путем разведения переменного количества легкого пептида в необходимом диапазоне концентраций, с добавлением одинакового количества SIS-пептида, как внутреннего стандарта для нормализации сигнала и количественной оценки концентрации немеченных пептидов. Для получения SIS пептидов использовался С-концевой лизин или аргинин с изотопами 13С и 15N: K (+8 Да; 6x 13C, 2x 15N), R (+10 Да; 6x 13C, 4x 15N). 2) Апробации панели пептидных стандартов и исследование изменений в протеомном профиле мочи при хронической болезни почек, вызванной гломерулопатиями. Для апробации панели был проведен таргетный хромато-масс-спектрометрический (ВЭЖХ-МС) количественный MRM анализ 46 образцов мочи пациентов с первичным-фокальный сегментарный гломерулосклерозом (ФСГС, n=26, из них легкая форма ФСГС (mFSGS), n=16; и тяжелая форма ФСГС(sFSGS), n=10), болезнью минимальных изменений (БМИ (MCD), n=8), и мембранозной нефропатией (МН, n=12) и 23 здоровых донора. В результате исследования было обнаружено 138 белков в 2/3 всех образцов по крайней мере из одной из групп. Полученные результаты подтверждают панель из 31 белка, ранее предложенных в качестве маркеров ХБП: их концентрация значимо менялась при сравнительном анализе групп пациентов с разными формами ХБП. Сравнение выявленной нами панели из 138 белков со 167 белками TUPA, предложенными Cantley et al., и панелью из 136 белков мочи, разработанной Percy et al., выявило 49 и 69 распространенных белков соответственно, в то время как 89 и 69 белков (соответственно) были новыми в нашей панели для МРМ анализа мочи. Для дифференциации образцов, взятых у пациентов с легкими и тяжелыми формами ХБП были построены бинарные классификаторы, с использованием четырех алгоритмов машинного обучения. Было показано, что наилучшие показатели ROC-AUC=0,99 могут быть достигнуты при использовании всего трех белков: GPX3, PLMN и A1AT или SHBG. Оба этих набора из трех белков могут использоваться для классификации образцов, взятых у пациентов с легкими и тяжелыми формами ХБП. Все экспериментальные результаты MRM-анализа были загружены в библиотеку экспериментов PeptideAtlas SRM (PASSEL) и доступны по ссылке: http://www.peptideatlas.rg/PASS/PASS04823. 3) Оценка уровня специфичных антител в сыворотке крови у пациентов с подоцитопатиями. В рамках разработки новой концепции о роли изменений антигенной детерминанты подоцитов и продукции антиподоцитарных антител, вызывающих повреждение подоцитов, была проведена оценка уровней антител к CD40 и к убиквитинкарбоксилтерминальной гидролазе L1 (анти-UCH-L1) у 106 пациентов с гломерулопатией и 11 здоровых доноров. При гистологическом исследовании у 35 пациентов выявлен первичный ФСГС (исключены генетические отклонения и вторичный ФСГС при отсутствии нефротического синдрома (НС)), у 15 - БМИ, у 21 - МН, у 13 - МПГН, у 22 больных - IgA-нефропатия. Также была проведена оценка уровня антинефриновых антител (ELISA) в сыворотке 77 пациентов с активной гломерулопатией (41 - ФСГС, 11 — БМИ и 25 — МН) и 11 здоровых доноров. Было установлено, что уровни антител к нефрину оказались достоверно выше у пациентов с БМИ и ФСГС по сравнению с МН и здоровыми донорами. У больных первичным ФСГС уровень антител к нефрину был достоверно выше по сравнению с больными вторичным ФСГС. Согласно результатам ROC-анализа, уровень антител более 41,6 нг/мл можно расценивать как высокоспецифичный для диагностики подоцитопатий (МКД или пФСГС). 4) Количественный МРМ-анализ потенциальных белков-маркеров в парных образцах (моча и сыворотка). При сравнении парных образцов сыворотки крови и мочи, собранных у одних и тех же пациентов и участников контрольной группы, после их MRM анализа был проведен корреляционный анализ с оценкой коэффициентов корреляции Пирсона и Спирмана. Оба коэффициента при всех патологиях оказались статистически значимо выше, чем в контроле и позволяют достоверно различать группы по критерию Манна-Уитни, если рассматривать корреляции для каждого человека отдельно. Особенно заметный рост корреляций между концентрациями белков в крови и моче имеет место у тяжелых пациентов. Это согласуется с тем, что именно при нарушенной фильтрационной функции почек корреляция белков между мочой и плазмой крови должна расти ввиду увеличенного неизбирательного попадания белков плазмы в мочу. Из представленных зависимостей, построенных с использованием логарифмированных относительных концентраций, видно, что и наклон линейных экстраполяций заметно растет при патологиях. Это дополнительно подчеркивает, что у здоровых доноров концентрация большинства белков в моче примерно пропорциональна квадратному корню от их концентрации в сыворотке, а при патологиях эта зависимость приближается к линейной, тем сильнее, чем тяжелее патология патологиях. Отдельное внимание было уделено анализу белков B2M, LYZ и SERPINF1, поскольку они ранее были охарактеризованы как возможные маркеры ХБП в плазме крови в другом исследовании, где результаты их MRM-анализа показали высокую степень корреляции с их анализом методом ELISA. Полученные нами результаты измерения белков в сыворотке, в действительности подтверждают, что уровни B2M и SERPINF1 возрастают в образцах исследованных патологических групп: если SERPINF1 возрастает приблизительно в одинаковой степени, вне зависимости от тяжести патологии, по степени увеличения B2M, вероятно, можно судить о тяжести течения болезни. Результаты для LYZ по медианным и средним значениям не выявили значимых отличий патологических групп от контрольной. Это расхождение с результатами другого исследования (Makridakis M., et al. (2020) Scientific Reports) может быть связано с тем, что в нашем исследовании были проанализированы образцы сыворотки, а не плазмы, что может влиять на результаты для отдельных белков. В дальнейшем, планируется увеличение числа образцов анализируемой выборки, что позволит более успешно использовать методы машинного обучения для выявления панели белковых маркеров. Основные результаты работы были представлены на 4-х научных мероприятиях и опубликованы 6 статьи в рецензируемых журналах, включая издания первого квартиля – Q1 (Molecules, Frontiers in Medicine и IJMS).