Аннотация результатов, полученных в 2021 году
В ходе первого года выполнения проекта были получены следующие научные результаты: 1. с помощью проточной цитометрии и интравитальной микроскопии установлено, что среди субпопуляций лейкоцитов крови лабораторных мышей с подкожно привитой опухолью 4Т1 наиболее перспективными в роли векторов доставки различных типов наночастиц (НЧ), отличающихся по своим физико-химическим свойствам, к опухоли являются нейтрофилы. Это обусловлено количественным преобладанием данных клеток в опухолевом микроокружении и в крови животных наряду со способностью взаимодействовать с НЧ и обеспечивать их выход из кровеносного русла. При этом нейтрофилы могут переносить НЧ как непосредственно на своей поверхности, так и провоцировать выход НЧ за счет формирования микро- и макроутечек; 2. с помощью трансмиссионной электронной микроскопии и лазерной сканирующей конфокальной микроскопии показано, что НЧ могут располагаться как в цитоплазме нейтрофилов, так и внутри вакуолей, не являющихся ранними или поздними эндосомами (предположительно, в эндолизосомах или фагосомах); 3. с помощью конфокальной микроскопии выявлено, что при инкубации нейтрофилов, выделенных из крови мышей с подкожно привитой опухолью, с различными типами НЧ происходит постепенное накопление последних внутри клеток, а насыщение нейтрофилов наночастицами достигается за 1 час совместного культивирования; 4. в ходе проведения экспериментов обнаружено, что важную роль в процессах взаимодействия выделенных нейтрофилов с НЧ играет состав культуральной среды, а именно присутствие или отсутствие в ней плазмы крови; 5. с помощью различных ингибиторов эндоцитоза установлено, что молекулярные механизмы, отвечающие за захват НЧ in vitro, могут отличаться в зависимости от конкретного типа НЧ и условий культивирования. Так, магнитные НЧ как в присутствии, так и в отсутствие плазмы захватываются нейтрофилами за счет клатрин-опосредованного, кавеолин-зависимого эндоцитоза и макропиноцитоза. В основе эндоцитоза липосом в присутствии плазмы, а также PLGA НЧ как при инкубации с плазмой, так и без нее лежат механизмы, зависящие от клатрина, кавеолина/рафтов, а также фагоцитоз. Липосомы в отсутствие плазмы захватываются нейтрофилами за счет макропиноцитоза; 6. с помощью ЛДГ-теста показано, что ни один тип НЧ, используемых в работе, не оказывает токсического влияния на нейтрофилы, выделенные из крови мышей. Выживаемость клеток, инкубировавшихся в присутствии НЧ, составляет 100 %; 7. с помощью конфокальной микроскопии выявлено, что при захвате НЧ нейтрофилами, выделенными из крови мышей, отсутствует выраженное усиление продукции активных форм кислорода (АФК) клетками. Исключение составляют лишь липосомы в условиях, когда нейтрофилы инкубировались с ними в присутствии плазмы. При этом было отмечено наличие существенного усиления генерации АФК нейтрофилами; 8. с помощью проточной цитометрии установлено, что после внутривенного введения НЧ мышам с подкожно привитой опухолью происходит увеличение продукции АФК нейтрофилами, захватившими исследуемые типы НЧ. Однако данное увеличение несущественно. Это, в свою очередь, свидетельствует об отсутствии активации нейтрофилов наночастицами; 9. с помощью проточной цитометрии выявлено усиление экспрессии поверхностного маркера CD11b нейтрофилами, захватившими НЧ вследствие их внутривенного введения мышам. Однако данное усиление так же несущественно и свидетельствует об отсутствии активации нейтрофилов наночастицами; 10. с помощью конфокальной микроскопии показано, что при взаимодействии нейтрофилов с различными типами НЧ, используемых в работе, в условиях in vitro формирование NETs наблюдается лишь у незначительной части клеток; 11. обнаружены различия в поведении трех типов НЧ, отличающихся по своим физико-химическим свойствам, в кровотоке после их внутривенного введения лабораторным животным, а также в механизмах эндоцитоза данных НЧ выделенными нейтрофилами.

Аннотация результатов, полученных в 2022 году
В ходе второго года выполнения проекта были выполнены работы и получены следующие научные результаты: 1. было установлено, что в условиях суспензионного состояния нейтрофилов, выделенных из крови животных с подкожно привитой опухолью 4Т1, присутствие плазмы в среде кудьтивирования влияет как на взаимодействие PLGA-Cy5 с нейтрофилами, так и на их захват клетками, снижая оба этих показателя. Отсутствие в плазме IgG/IgM существенно увеличивает неспецифическое взаимодействие нейтрофилов с НЧ. Взаимодействие и захват НЧ нейтрофилами не опосредованы рецепторами к С3а и С5а компонентам системы комплемента и крайне мало зависят от скавенджер-рецепторов; 2. выявлено, что в условиях прикрепленного состояния нейтрофилов, выделенных из крови животных с подкожно привитой опухолью 4Т1, присутствие плазмы в среде кудьтивирования приводит к увеличению как взаимодействия, так и захвата НЧ нейтрофилами. Ингибирование рецепторов к С3а и С5а компонентам системы комплемента, а также скавенджер-рецепторов не влияет на захват PLGA-Cy5 нейтрофилами. Отсутствие IgG/IgM и блокирование рецепторов к IgG приводит к незначительному снижению захвата НЧ. 3. с помощью теста миграции нейтрофилов in vitro было показано, что клетки сохраняют способность мигрировать через слой эндотелиальных клеток после взаимодействия с липосомами; 4. на модели миграции нейтрофилов in vitro с использованием трансвеллов было установлено, что липосомы способны проникать через слой эндотелиальных клеток как пассивно, так и за счет мигрирующих нейтрофилов, при этом, нейтрофил-ассоциированный транспорт НЧ является более эффективным, чем пассивный; 5. методом интравитальной микроскопии было показано, что внутривенное введение НЧ не оказывает существенного влияния на поведение нейтрофилов. При этом, МНЧ-ЧСА-Су5 и PLGA-Cy5 могут захватываться нейтрофилами и транспортироваться ими через стенку сосуда в ткань опухоли. Липосомы-DiD не захватываются нейтрофилами, однако последние способствуют формированию микро- и макроутечек данного типа НЧ из сосудов; 6. методом интравитальной микроскопии было установлено, что частота переноса МНЧ-ЧСА-Су5 через стенку сосуда с помощью нейтрофилов составляет 19 % случаев, PLGA-Cy5 – 15 %. Формирование макроутечек липосом-DiD наблюдается в 3 % случаев, а микроутечек – в 53 %; 7. с помощью интравитальной микроскопии было выявлено, что вклад активного транспорта МНЧ-ЧСА-Су5 через стенку сосудов крайне невелик, данные НЧ выходят из опухолевых сосудов преимущественно благодаря пассивному транспорту. Активный перенос PLGA-Cy5 нейтрофилами также не является основным способом транспорта данных НЧ через стенку сосудов. Наиболее ощутимый вклад нейтрофилы вносят в доставку липосом-DiD; 8. методом интравитальной микроскопии было показано, что при одновременном введении липосом-DiD и МНЧ-ЧСА-Су3 локусы спонтанных утечек МНЧ-ЧСА-Су3 и микроутечек липосом-DiD, опосредованных нейтрофилами, не связаны друг с другом; 9. методом интравитальной микроскопии было установлено, что NETs не являются механизмом захвата НЧ; 10. с помощью интравитальной микроскопии было выявлено, что контакт НЧ с нейтрофилами не вызывает формирование NETs in vivo.

Аннотация результатов, полученных в 2023 году
В ходе третьего года выполнения проекта были выполнены работы и получены следующие научные результаты: 1. методом интравитальной микроскопии показано, что долгосрочная деплеция нейтрофилов не оказывает выраженного воздействия на частоту формирования локусов скопления PLGA-Cy5 НЧ и микроутечек липосом-DiD в микроокружении опухоли 4Т1; 2. методом IVIS установлено, что в результате деплеции нейтрофилов снижается эффективность накопления как PLGA-Cy5 НЧ, так и липосом-DiD в опухоли 4Т1. При этом, для НЧ PLGA-Cy5 вклад нейтрофилов менее значимый, чем для липосом-DiD; 3. методом интравитальной микроскопии на фоне мобилизации нейтрофилов подтверждено, что вклад нейтрофилов в формирование локусов скопления НЧ PLGA-Cy5 невелик (вне зависимости от исследуемой опухолевой модели); 4. с помощью метода проточной цитометрии доказана эффективность долгосрочной деплеции нейтрофилов вплоть до 4-ого дня с момента введения антител; 5. выявлено, что нейтрофилы могут вносить вклад в эффективность доставки лекарственных препаратов на основе НЧ, а именно липосомальной формы доксорубицина – Келикса, в опухоль, хоть он и не ярко выражен; 6. показано, что однократная инъекция Келикса обладает меньшей эффективностью по сравнению с его двукратным введением, в связи с чем для последующих экспериментов принято решение проводить комбинированную терапию с двукратным введением Келикса (и деплецирующих антител накануне).