КАРТОЧКА ПРОЕКТА,
ПОДДЕРЖАННОГО РОССИЙСКИМ НАУЧНЫМ ФОНДОМ

Информация подготовлена на основании данных из Информационно-аналитической системы РНФ, содержательная часть представлена в авторской редакции. Все права принадлежат авторам, использование или перепечатка материалов допустима только с предварительного согласия авторов.

 

ОБЩИЕ СВЕДЕНИЯ


Номер 21-74-10054

НазваниеЭволюция прогамной фазы оплодотворения у семенных растений: физиологические аспекты

РуководительБрейгина Мария Александровна, Кандидат биологических наук

Организация финансирования, регионФедеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования «Московский государственный университет имени M.В.Ломоносова», г Москва

Срок выполнения при поддержке РНФ 07.2021 - 06.2024 

КонкурсКонкурс 2021 года «Проведение исследований научными группами под руководством молодых ученых» Президентской программы исследовательских проектов, реализуемых ведущими учеными, в том числе молодыми учеными

Область знания, основной код классификатора 04 - Биология и науки о жизни, 04-206 - Физиология и биохимия растений

Ключевые словаразмножение растений, гаплоидное поколение, полярный рост, мужской гаметофит, пыльцевая трубка, активные формы кислорода, ионный гомеостаз

Код ГРНТИ34.31.00


 

ИНФОРМАЦИЯ ИЗ ЗАЯВКИ


Аннотация
Актуальность исследования механизмов, регулирующих прорастание мужского гаметофита обусловлена тем, что этот процесс определяет успех оплодотворения и, соответственно, образования семян. Возможность и эффективность прорастания определяется двумя факторами: во-первых, фертильностью самого мужского гаметофита, которая зависит от условий его формирования и от генотипа, а во-вторых, способностью спорофитных тканей активировать и поддержать пыльцевое зерно на ранних этапах его активации и позднее, в процессе роста. Именно на последнем пункте мы и планируем сосредоточиться в рамках настоящего Проекта. Таким образом, поставленная цель лежит в плоскости межклеточной коммуникации между пыльцой и женскими тканями. Акцент планируется сделать на взаимодействие между пыльцой и жидкостью, в которой она активируется и прорастает in vivo (назовем ее рецептивной жидкостью, РЖ). Этот аспект является крайней важным для успеха репродукции, поскольку у всех растений с влажным рыльцем и большинства хвойных растений пыльца при опылении оказывается в жидкости, погружается в неё и в ней прорастает. Наша гипотеза заключается в том, что состав жидкости и её свойства оказываются ключевыми факторами, определяющими эффективность прорастания пыльцы. Эти факторы мы будем рассматривать в эволюционном аспекте: мы планируем проследить развитие систем взаимодействия между пыльцой и женскими тканями у растений из разных семейств, как голо-, так и покрытосеменных. Со стороны пыльцевого зерна такая работа уже была нами начата: мы проверяли способность пыльцевых зёрен растений из разных систематических групп реагировать на какие-либо активирующие факторы (в основном АФК) в условиях in vitro. Но это лишь одна сторона: ведь если даже пыльца способна реагировать на какой-либо сигнал, это ещё не доказывает, что такой сигнал действительно воздействует на неё in vivo. Изучая свойства РЖ и меняя их, мы можем выявить соответствие между системами контроля прорастания со стороны спорофита и способностью пыльцы реагировать на эти системы. Надо сказать, что жидкости, участвующие в прорастании пыльцы у хвойных растений (опылительная капля) и у цветковых растений (рыльцевый экссудат) продуцируются разными тканями и проводить между ними прямую гомологию было бы неправильным, но тем важнее их функциональное сходство как среды, поддерживающей прорастающий гаметофит. Состав этих жидкостей уже изучался для некоторых растений, но основной упор всегда делался на питательный состав (смесь углеводов) и белковый компонент (ферменты и регуляторные белки). Мы же планируем, во-первых, собрать рецептивные жидкости с целого ряда растений из разных филогенетических групп (сосновые, замиевые, гинкго, кирказоновые, пионовые, паслёновые, лилейные и другие), во-вторых, провести сравнение этих жидкостей по разным параметрам, связанным с межклеточным взаимодействием: измерить в них содержание АФК и антиоксидантную активность (методами ЭПР, хемилюминесценции, спектрофотометрии), содержание неорганических ионов (спектрофлуориметрия, пламенная фотометрия), насыщенных и ненасыщенных жирных кислот (ГХ-МС) и фитогормонов (ВЭЖХ). В ходе реализации Проекта впервые для разных групп растений будет проведено сравнительное исследование пыльцевых трубок, формирующихся и растущих in vitro и in vivo. На данный момент такие исследования проводились только на модельных объектах и включали в себя главным образом измерения количественных параметров (насколько быстро растет трубка). Полученные результаты достаточно очевидны: in vivo она растет быстрее. Гораздо интереснее другой вопрос: почему? В нашей работе планируется применять нативную и модифицированную РЖ в качестве дополнения к прорастанию in vitro. Модификации РЖ помогут выявить наиболее важные для прорастания компоненты, воздействующие на пыльцу в каждой из групп растений. Сравнение будет включать в себя как количественные показатели (скорость роста трубок, интенсивность дыхания), так и цитологические характеристики (флуоресцентная микроскопия, ТЭМ, гистохимия), показывающие, как именно обеспечивается быстрый рост. Также большой интерес представляет вопрос, насколько универсальны механизмы контроля прорастания, и насколько эти механизмы могут быть ответственны за многократное укорачивание прогамной фазы оплодотворения у цветковых растений по сравнению с голосеменными. Для ответа на него нам необходим достаточно широкий в таксономическом смысле охват растений. Мы, как небольшой коллектив, не планируем исследовать десятки видов, но гораздо важнее, как нам кажется, выбрать растения, максимально отстоящие друг от друга на филогенетическом древе (с поправкой на доступность в нашей полосе и в нашем городе), а также протестировать как можно больше параметров, которые могут оказывать влияние на прорастание. В состав коллектива, помимо сотрудницы, дипломницы и аспирантки руководителя, вошли специалисты из разных областей ботаники, биофизики и физиологии, которые обеспечат комплексный характер исследования. У каждого члена коллектива своя экспериментальная задача, основанная на его методической компетенции и позволяющая привлечь к исследованию целый ряд современных методов без закупки чрезмерно дорогостоящего оборудования, а также грамотно подойти к таксономии растений и эволюционной проблеме, что очень важно для подготовки высокорейтинговых публикаций. В результате реализации Проекта будет впервые экспериментально получен ответ на вопрос о наиболее важных механизмах контроля начальных этапов прогамной фазы оплодотворения у разных групп растений. Также будет впервые проверена гипотеза о различиях в этих механизмах между голосеменными и покрытосеменными растениями и выявлены факторы, способствовавшие многократному ускорению прогамной фазы у последних. На этой основе станет возможным предложить стратегии оптимизации репродуктивного процесса, и, как следствие, повышения продуктивности растений и их устойчивости к неблагоприятным внешним воздействиям.

Ожидаемые результаты
1. Будет проведено сравнение рецептивных жидкостей (РЖ), которые продуцирует спорофит растений из разных систематических групп (опылительных капель и рыльцевого экссудата) по нескольким параметрам, важным для межклеточного взаимодействия: уровень АФК и антиоксидантная активность (ЭПР, хемилюминесценция, спектрофотометрия), содержание неорганических ионов (ионоселективные электроды, пламенная фотометрия), насыщенных и ненасыщенных жирных кислот (ГХ-МС) и фитогормонов (ВЭЖХ). Тем самым будут впервые выявлены механизмы, которые те или иные растения используют для взаимодействия рыльца (у покрытосеменных) или микропиле (у голосеменных) с мужским гаметофитом и активации его роста. Подобные исследования никогда ранее не проводились, поскольку изучение рыльцевого экссудата и особенно опылительных капель очень затруднено из-за малого объема этих жидкостей, короткого периода их появления и трудности сбора. Есть целый ряд работ по составу этих жидкостей, но указанные параметры там практически не обсуждались (в отличие от состава сахаров и протеома), тем более, в эволюционном аспекте. 2. Впервые для различных групп растений будет проведено сравнение пыльцевых трубок, формирующихся и растущих in vitro и in vivo. Сравнение будет включать в себя как количественные показатели (длину трубки, количество трубок из одного пыльцевого зерна – для хвойных), так и цитологические характеристики (зонирование цитоплазмы, положение мужского гаметного модуля). Тем самым будет показано влияние РЖ на запуск полярного роста и его параметры. Пыльцевые зерна и трубки некоторых групп растений (например, саговниковых, кирказоновых) в цитологическом отношении изучены очень мало, поэтому для выявления указанных различий сначала нужно будет собрать данные об особенностях этих гаметофитов, подобно тому, как это ранее было сделано для модельных объектов. Так, для новых объектов будут подобраны условия роста in vitro, будет изучено расположение и движение органелл, особенности состава клеточной стенки и плазматической мембраны. Данный блок результатов также будет включать эволюционный аспект, поскольку цитологические параметры мужского гаметофита являются одной из линий развития отношений между спорофитным и гаметофитным поколениями. Проследить это развитие с опорой на разные группы растений – одна из задач настоящего Проекта. 3. Взаимодействие между РЖ и мужским гаметофитом будет изучено in vitro. Для установления роли каждой из обнаруженных в пункте 1 систем в контроле прорастания пыльцы воздействие рецептивной жидкости будет проверяться в двух вариантах: РЖ полного состава и РЖ после модификации, затрагивающей изучаемую систему, например, систему редокс-баланса (добавление антиоксидантов/АФК), систему ионного гомеостаза (добавление/хелатирования важного иона), систему гормонального сигналинга (связывание/инактивация обнаруженного гормона). Тем самым будет подтверждено не только наличие какой-либо из регуляторных систем на рыльце/в опылительной капле, но и её прямое участие в контроле репродуктивного успеха. Актуальность этого результата не вызывает сомнений, так как механизмы межклеточного взаимодействия в репродуктивных процессах сейчас находятся в центре внимания исследователей. В самых престижных журналах публикуются статьи по взаимодействию белков и пептидов с рецепторами на рыльце, но это лишь один из механизмов, которые растения используют для активации и поддержания полярного роста. Не вступая в прямую конкуренцию, мы планируем подойти с другой стороны, представив доказательства многоплановости общения между спорофитом и гаметофитом и эволюционного развития разных механизмов этого общения.


 

ОТЧЁТНЫЕ МАТЕРИАЛЫ


Аннотация результатов, полученных в 2021 году
Основное внимание при изучении двух типов экссудата уделялось активным формам кислорода и ферментам, обеспечивающим их взаимопревращение и деградацию. Для этой цели использовали надежные и наглядные методы детекции АФК: ЭПР для детекции суммарных радикальных АФК и супероксид радикала и спектрофотометрию для измерения концентрации пероксида водорода. На данный момент сделана динамика пероксида водорода в экссудате двух видов, динамика супероксид радикала в экссудате табака и динамика суммарных радикальных АФК в экссудате лилии. Ювенильные рыльца табака значительно активнее продуцировали супероксидный радикал, чем зрелые. Сигнал на каждом из стадиях 2, 3 и 4 значительно отличался от сигнала предыдущей стадии. Самый высокий уровень O•2¯ был обнаружен на стадии 1, самый низкий – на стадии 3. После опыления продукция супероксидного радикала снова увеличивалась, достигая примерно уровня стадии 2. Следует учитывать, что мы удаляли пыльцу, попавшую в экссудат, собранный на 4 стадии, так что она не могла повлиять на уровень сигнала. Уровень пероксида водорода, который мы оценивали в свежем экссудате спектрофотометрически, также был максимальным на ювенильных рыльцах и снижался по мере созревания; однако в этом случае уровень сигнала на стадии 4 был значительно ниже, чем до опыления. Аналогичные эксперименты мы провели для лилии и обнаружили обратную картину: количество перекиси увеличивалось по мере созревания и было максимально в фертильных рыльцах, после опыления значение не менялось. В последнюю публикацию вошли также данные, которых не было в изначальном плане, по динамике активности СОД в геле (так называемый зимографический метод). Этот метод удобнее определения активности в вытяжке, поскольку не только дает наглядное представление о количестве активного фермента, но и дает дополнительную информацию, например, о количестве изоферментов, составляющих суммарную активность в каждом образце. Все наносимые на гель образцы выравниваются между собой по количеству белка. Мы показали, что активность СОД на первой стадии ниже, чем на последующих, а более легкий изофермент практически не обнаруживается в ювенильных цветках. Уровень активности обоих изоферментов на 2 и 3 стадиях одинаков. Уровень активности обоих изоферментов на 2 и 3 стадиях одинаков. На 4 стадии результаты сильно различались: в одних случаях выявлялась высокая активность, а в других примерно такая же, как на 2 и 3 стадиях. На 4-й стадии обнаружены либо оба изофермента, либо только один. Чем это вызвано, мы пока не знаем. Каковы же обнаруженные изоферменты СОД? Для определения изофермента, ответственной за каждую из полос активности СОД из рылец табака, перед оценкой активности нативные полиакриламидные гели обрабатывали различными ингибиторами. Мы выяснили, что за активность СОД на рыльцах табака ответственны два изофермента: Cu/Zn-СОД и Fe-СОД. Поскольку нижняя полоса в экстрактах первой стадии была очень слабой или полностью отсутствовала, можно заключить, что Cu/Zn-СОД появляется позже в ходе онтогенеза рыльца. Увеличение активности СОД и числа изоферментов логично связать с наблюдаемым снижением уровня супероксидного радикала в зрелом пестике. На табаке мы разработали методику ингибиторного анализа на рыльце, ранее такой подход не применялся, хотя смысл его довольно прост. Ингибитор какого-либо фермента, предположительно, активного на рыльце, добавляется на него в малом объеме жидкости, и какое-то время действует (20-30 мин), затем экспериментатор осуществляет «контролируемое опыление», после чего пестики фрагментируют, фиксируют и делают срезы, окрашивают пыльцевые трубки аналиновым голубым (на каллозу). Количество трубок служит показателем скорости прорастания. Количество семян служит показателем эффективности опложотворения. Чтобы выявить значение активных форм кислорода, обнаруженных на рыльце, мы сместили баланс АФК с помощью ингибиторов. Как мы показали, СОД на рыльце чувствительна к перекиси водорода и цианиду калия, но применить эти ингибиторы к рыльцу мы не могли, так как сама перекись является компонентом окислительно-восстановительной системы, а цианид токсичен для живых тканей. Поэтому для экспериментов in vivo мы использовали только специфический Cu/Zn-ингибитор СОД LCS1. Нам удалось проверить эффективность ингибитора непосредственно на рыльце: содержание O•2¯ в экссудате на рыльце, обработанном LCS1, увеличилось на 38%. Предварительно инкубируя рыльца с этим ингибитором, а также с двумя ингибиторами НАДФН-оксидазы, вероятно, одного из ключевых продуцентов АФК на рыльце, мы оценивали изменение скорости прорастания пыльцы на рыльце и эффективности оплодотворения. Ингибиторы НАДФ-оксидазы влияли на скорость прорастания: DPI и AV снижали количество трубок в столбике на 59 и 76%, соответственно. Однако при тестировании с точки зрения успешности оплодотворения не было обнаружено значительного снижения. По-видимому, количества трубочек, которые в итоге достигли завязи, было достаточно, чтобы оплодотворить достаточное количество семязачатков. Таким образом, подавление генерации О•2¯ влияет на динамику прорастания, но не на его эффективность. С другой стороны, смещение баланса АФК в сторону супероксидного радикала (путем блокирования одного из типов СОД) значительно снижало скорость прорастания: через полчаса пыльцевые трубки в столбике отсутствовали. Ингибирование СОД также сказывалось на эффективности оплодотворения: количество семян в коробочке было на 31 % меньше, чем в контроле, т. е. этот показатель изменялся пропорционально действию ингибитора на содержание О•2¯ . Анализ экссудата табака на содержание гормонов был произведен в апреле (в сотрудничестве с .Кочкиным Д.В.). Обработка и осмысление данных продолжается, но на данный момент обнаружена абсцизовая кислота, это было подтверждено на двух приборах по совпадению параметров со стандартными образцами (см. файл с доп.материалами), все другие гормоны в пробе отсутствуют. Это первый анализ рыльцевого экссудата методом ВЭЖХ-МС, результаты вызвают большой интерес, помимо абсцизовой кислоты, обнаружена группа неидентифицированных веществ. Эти данные будут проверяться и анализироваться дальше.

 

Публикации

1. Брейгина М.А., Воронков А.С., Галин И.Р., Ахиярова Г.Р., Полевова С.В., Клименко Е.С., Иванов И.И., Кудоярова Г.Р. Dynamics of endogenous levels and subcellular localization of ABA and cytokinins during pollen germination in spruce and tobacco Protoplasma, - (год публикации - 2022).

2. Брейгина М.А., Щекалева О.И., Клименко Е.С., Лунева О.Г. The Balance between Different ROS on Tobacco Stigma during Flowering and Its Role in Pollen Germination Plants, 11(7):993 (год публикации - 2022).