Аннотация результатов, полученных в 2021 году
Основное внимание при изучении двух типов экссудата уделялось активным формам кислорода и ферментам, обеспечивающим их взаимопревращение и деградацию. Для этой цели использовали надежные и наглядные методы детекции АФК: ЭПР для детекции суммарных радикальных АФК и супероксид радикала и спектрофотометрию для измерения концентрации пероксида водорода. На данный момент сделана динамика пероксида водорода в экссудате двух видов, динамика супероксид радикала в экссудате табака и динамика суммарных радикальных АФК в экссудате лилии. Ювенильные рыльца табака значительно активнее продуцировали супероксидный радикал, чем зрелые. Сигнал на каждом из стадиях 2, 3 и 4 значительно отличался от сигнала предыдущей стадии. Самый высокий уровень O•2¯ был обнаружен на стадии 1, самый низкий – на стадии 3. После опыления продукция супероксидного радикала снова увеличивалась, достигая примерно уровня стадии 2. Следует учитывать, что мы удаляли пыльцу, попавшую в экссудат, собранный на 4 стадии, так что она не могла повлиять на уровень сигнала. Уровень пероксида водорода, который мы оценивали в свежем экссудате спектрофотометрически, также был максимальным на ювенильных рыльцах и снижался по мере созревания; однако в этом случае уровень сигнала на стадии 4 был значительно ниже, чем до опыления. Аналогичные эксперименты мы провели для лилии и обнаружили обратную картину: количество перекиси увеличивалось по мере созревания и было максимально в фертильных рыльцах, после опыления значение не менялось. В последнюю публикацию вошли также данные, которых не было в изначальном плане, по динамике активности СОД в геле (так называемый зимографический метод). Этот метод удобнее определения активности в вытяжке, поскольку не только дает наглядное представление о количестве активного фермента, но и дает дополнительную информацию, например, о количестве изоферментов, составляющих суммарную активность в каждом образце. Все наносимые на гель образцы выравниваются между собой по количеству белка. Мы показали, что активность СОД на первой стадии ниже, чем на последующих, а более легкий изофермент практически не обнаруживается в ювенильных цветках. Уровень активности обоих изоферментов на 2 и 3 стадиях одинаков. Уровень активности обоих изоферментов на 2 и 3 стадиях одинаков. На 4 стадии результаты сильно различались: в одних случаях выявлялась высокая активность, а в других примерно такая же, как на 2 и 3 стадиях. На 4-й стадии обнаружены либо оба изофермента, либо только один. Чем это вызвано, мы пока не знаем. Каковы же обнаруженные изоферменты СОД? Для определения изофермента, ответственной за каждую из полос активности СОД из рылец табака, перед оценкой активности нативные полиакриламидные гели обрабатывали различными ингибиторами. Мы выяснили, что за активность СОД на рыльцах табака ответственны два изофермента: Cu/Zn-СОД и Fe-СОД. Поскольку нижняя полоса в экстрактах первой стадии была очень слабой или полностью отсутствовала, можно заключить, что Cu/Zn-СОД появляется позже в ходе онтогенеза рыльца. Увеличение активности СОД и числа изоферментов логично связать с наблюдаемым снижением уровня супероксидного радикала в зрелом пестике. На табаке мы разработали методику ингибиторного анализа на рыльце, ранее такой подход не применялся, хотя смысл его довольно прост. Ингибитор какого-либо фермента, предположительно, активного на рыльце, добавляется на него в малом объеме жидкости, и какое-то время действует (20-30 мин), затем экспериментатор осуществляет «контролируемое опыление», после чего пестики фрагментируют, фиксируют и делают срезы, окрашивают пыльцевые трубки аналиновым голубым (на каллозу). Количество трубок служит показателем скорости прорастания. Количество семян служит показателем эффективности опложотворения. Чтобы выявить значение активных форм кислорода, обнаруженных на рыльце, мы сместили баланс АФК с помощью ингибиторов. Как мы показали, СОД на рыльце чувствительна к перекиси водорода и цианиду калия, но применить эти ингибиторы к рыльцу мы не могли, так как сама перекись является компонентом окислительно-восстановительной системы, а цианид токсичен для живых тканей. Поэтому для экспериментов in vivo мы использовали только специфический Cu/Zn-ингибитор СОД LCS1. Нам удалось проверить эффективность ингибитора непосредственно на рыльце: содержание O•2¯ в экссудате на рыльце, обработанном LCS1, увеличилось на 38%. Предварительно инкубируя рыльца с этим ингибитором, а также с двумя ингибиторами НАДФН-оксидазы, вероятно, одного из ключевых продуцентов АФК на рыльце, мы оценивали изменение скорости прорастания пыльцы на рыльце и эффективности оплодотворения. Ингибиторы НАДФ-оксидазы влияли на скорость прорастания: DPI и AV снижали количество трубок в столбике на 59 и 76%, соответственно. Однако при тестировании с точки зрения успешности оплодотворения не было обнаружено значительного снижения. По-видимому, количества трубочек, которые в итоге достигли завязи, было достаточно, чтобы оплодотворить достаточное количество семязачатков. Таким образом, подавление генерации О•2¯ влияет на динамику прорастания, но не на его эффективность. С другой стороны, смещение баланса АФК в сторону супероксидного радикала (путем блокирования одного из типов СОД) значительно снижало скорость прорастания: через полчаса пыльцевые трубки в столбике отсутствовали. Ингибирование СОД также сказывалось на эффективности оплодотворения: количество семян в коробочке было на 31 % меньше, чем в контроле, т. е. этот показатель изменялся пропорционально действию ингибитора на содержание О•2¯ . Анализ экссудата табака на содержание гормонов был произведен в апреле (в сотрудничестве с .Кочкиным Д.В.). Обработка и осмысление данных продолжается, но на данный момент обнаружена абсцизовая кислота, это было подтверждено на двух приборах по совпадению параметров со стандартными образцами (см. файл с доп.материалами), все другие гормоны в пробе отсутствуют. Это первый анализ рыльцевого экссудата методом ВЭЖХ-МС, результаты вызвают большой интерес, помимо абсцизовой кислоты, обнаружена группа неидентифицированных веществ. Эти данные будут проверяться и анализироваться дальше.

Аннотация результатов, полученных в 2022 году
Прорастанию пыльцы in vivo на влажных рыльцах способствует рецептивная жидкость - экссудат рыльца. Его точный состав до сих пор неизвестен, изучены лишь некоторые компоненты. На данном этапе работ в рамках Проекта мы изучали высвобождение АФК в экссудат рыльца у растений из разных систематических групп: Paeonia suffruticosa, Nicotiana tabacum, Lilium hybr., Aristolochia manshuriensis и Berberis vulgaris; в большинстве случаев экссудат собирали с интактных цветков на всем растении, чтобы свести к минимуму влияние экспериментального вмешательства на чувствительную систему окислительно-восстановительного баланса. Динамику общей окислительной способности экссудата рыльца оценивали с помощью ЭПР спектроскопии и прижизненного окрашивания рыльца бенздином, а также флуоресцентным зондом DCFH. Уровень перекиси водорода в экссудате оценивали спектрофотометрически, а активность супероксиддисмутазы, катализирующей образование H2O2, - зимографическим методом после нативного электрофореза белков рыльца. У всех исследованных растений общий уровень АФК увеличивался по мере созревания рыльца, однако концентрация Н2О2 снижалась у исследованных представителей двудольных, кроме пиона. У лилии она увеличилась, а у кирказона осталась низкой, что, по-видимому, связано с отсутствием активности СОД. У всех исследованных дивергентных растений фермент проявлял активность на рыльцах с участием двух изоферментов. В фертильный период активность была выше, чем на более ранней стадии. На основании полученных данных мы обсуждаем примитивные и прогрессивные паттерны генерации и трансформации АФК на рыльце и возможную эволюцию редокс-баланса на влажном рыльце. В сотрудничестве с коллегами с кафедры и ИФР РАН впервые проведен гормональный скрининг, а также изучен жирнокислотный состав липидосодержащего (Nicotiana tabacum) и нелипидного (Lilium longiflorum) экссудата. Скрининг экссудата на растительные гормоны и гормоноподобные вещества с помощью ВЭЖХ-МС выявил АБК в экссудате рылец табака на двух стадиях развития: непосредственно накануне зрелости и в зрелых рыльцах, ожидающих опыления, причем на фертильной стадии концентрация гормона возрастала. На ювенильных и опыленных рыльцах табака, а также в экссудате лилии АБК не обнаружена ни на одной стадии. ГХ-МС анализ показал, что оба типа экссудата характеризуются преобладанием насыщенных жирных кислот. Липиды экссудата рыльца табака содержат значительно больше миристиновой, олеиновой и линолевой кислот, что приводит к более высокому индексу ненасыщенности по сравнению с липидами экссудата рыльца лилии. Последние, в свою очередь, содержат больше 14-гексадеценовой и арахиновой кислот. В обоих экссудатах обнаружено значительное количество сквалена. Обсуждается возможное участие насыщенных жирных кислот, АБК и сквалена в реализации различных функций экссудата, а также их возможная взаимосвязь на рыльце. Для тех же видов изучена активность ферментов редокс-метаболизма на рыльце на разных стадиях созревания и после опыления. Получены зимографические данные для аскорбат перокидазы, каталазы и СОД – активность каталазы не выявляется у табака, а у лилии она присутствует на всех стадиях, хотя в фазе фертильности максимальна; СОД и аскорбат пероксидаза активны у обоих объектов на всех стадиях, однако количество и молекулярный вес изоферментов отличаются, как и активность в ювенильных, зрелых и опыленных рыльцах. Спектрофотометрически определено отсутствие активности гваяколовой пероксидазы на всех стадиях. Параллельно сравнивали динамику образования супероксид радикала методом ЭПР спектроскопии и окрашивания рылец NBT, а также динамику концентрации пероксида водорода в экссудате рылец. У табака и лилии выявлены значительные различия, которые могут быть связаны как с их систематическим положением, так и с экологическими особенностями. В рамках Проекта мы начали эволюционный скрининг рецептивных жидкостей голосеменных растений – опылительных капель. Уже изучены капли двух видов с различным уровнем и составом АФК, и эта сезонная работа продолжается. Мы также продолжили начатую ранее работу по изучению пыльцевых зёрен, сравнению механизмов прорастания у двух отделов растений. Пыльца покрытосеменных и голосеменных прорастает принципиально сходными способами, но последние также имеют важные особенности, в том числе медленные темпы роста и меньшую зависимость от женских тканей. Эти особенности в некоторой степени обусловлены свойствами липидов пыльцы, выполняющих ряд функций при прорастании. Здесь мы сравнили состав жирных кислот (ЖК) липидов пыльцы двух видов цветковых растений и ели с помощью ГХ-МС. ЖК состав пыльцы ели существенно различался, включая преобладание насыщенных и моноеновых ЖК и высокую долю ЖК с очень длинной цепью (ЖКОДЦ). Для лилии и табака обнаружены достоверные отличия ЖК из покровных липидов (трифины) и липидов клеток гаметофита, в том числе очень низкий индекс ненасыщенности у липидов трифины. Доля ЖКОДЦ в трифине была в несколько раз выше, чем в клетках гаметофита. Впервые проанализированы изменения состава ЖК при прорастании пыльцы голосеменных и покрытосеменных растений. Стимулирующее действие Н2О2 на прорастание ели также приводило к заметным изменениям ЖК состава растущей пыльцы. Для табака в контрольных и опытных образцах состав ЖК был стабилен.

Аннотация результатов, полученных в 2023 году
В отчетном периоде проанализирован АФК-баланс в рецептивных жидкостях целого ряда растений, которые ранее в этом отношении не изучались. Так, АФК впервые обнаружены в опылительных каплях хвойных: они присутствуют в детектируемых количествах у всех исследованных растений, которые являются представителями трех семейств. При этом соотношение двух основных АФК отличалось как от такового у цветковых растений, так и у различных хвойных растений между собой. Для опылительных капель характерно присутствие либо супероксид радикала, либо пероксида водорода, в то время как для всех изученных ранее цветковых растений присутствовали обе формы, хотя одна из них преобладала. У сосны, ели и тиса выявлялся только супероксид радикал, у туи – только пероксид водорода. К этим данным мы дополнительно поставили опыты по влиянию АФК на прорастание пыльцевых зёрен ели колючей – стандартного объекта, который был ранее нами изучен и показал хорошее прорастание in vitro. Оказалось, что влияние АФК совпадает с составом опылительной капли – супероксид сильно стимулировал общее прорастание у ели, эффект пероксида также был положительным, но небольшим. Из цветковых растений были изучены рецептивные жидкости представителей семейств Бромелиевые и Орхидные, а также гиацинта (семейство Спаржевые). Полученные данные действительно демонстрируют разнообразие: если для орхидей характерен весьма низкий уровень генерации АФК, а малые количества супероксид радикала не могут быть детектированы с помощью спиновой ловушки, то представителям Бромелиевых свойственен высокий уровень АФК в опылительной капле, причем супероксид также присутствует в значительном количестве, подобно тому, как это было у лилии. У гиацинта уровень АФК невысок, однако супероксид присутствует в заметном количестве. У нового двудольного модельного объекта из семейства Геснериевых – стрептокарпуса – высокий уровень генерации АФК и пероксида водорода, супероксид пока выявить не удалось, но опыты продолжаются. Помимо АФК, в разработке находилось и другое направление, связанное с низкомолекулярной регуляцией прорастания in vivo: изучение состава неорганических ионов в рецептивных жидкостях и ионообменных свойств клеточной стенки. Был проанализирован качественный и количественный состав ионогенных групп клеточной стенки пыльцы ели, причем данные получены для двух слоёв оболочки, имеющих разный состав и функции. В структуре полимерного матрикса оболочки выявлены ионогенные группы четырех типов, способные участвовать в обменных реакциях с ионами среды при соответствующих условиях: три из них – катионообменные, а четвертая обменивает анионы. Во внутреннем слое оболочки – интине – представлены все четыре типа групп, а в наружном (экзине), наряду с анионообменной группой, лишь две катионообменные. В экзине содержание карбоксильных групп гидроксикоричных кислот почти в три раза больше, чем в интине, а по содержанию фенольных ОН-групп отличие между ними не превышает 10%. Исследование содержания различных элементов в рецептивных жидкостях: экссудате рыльца и в опылительной капле – было проведено для табака, лилии и ели. Полученные данные демонстрируют восходящую динамику практически для всех элементов по мере созревания рыльца у обоих цветковых растений, однако, если у табака такая динамика достоверна для целого ряда элементов, включая калий и кальций, то у лилии разброс значений очень велик и не позволяет выявить четкий тренд ни для одного элемента. У ели такая же ситуация: несколько опылительных капель содержат совершенно разные количества калия и кальция, а также анионов. И, наконец, новое направление включало анализ вторичных метаболитов, входящих в состав экссудата рыльца двух модельных объектов – табака и лилии – и позволило выявить новые важные метаболиты в экссудате табака, которые, предположительно, могут участвовать и в поддержании баланса АФК, в частности, в массивной генерации пероксида водорода, уровень которого именно у табака, как мы ранее показали, особенно высок в ювенильных рыльцах. Хромато-масс-спектрометрический анализ проводился в коллаборации с сотрудником кафедры Кочкиным Д.В. Руководителем проекта написана и подготовлена к защите докторская диссертация по теме «Активные формы кислорода как регуляторы взаимодействия между мужским гаметофитом и спорофитом семенных растений», защита назначена на 24 мая.