Аннотация результатов, полученных в 2021 году
В отчетном периоде были проведены структурные исследования комплекса Dps - ДНК (геномная) с помощью криогенной просвечивающей электронной микроскопии (крио-ПЭМ). Определено, что наблюдаемые объекты представляют собой свернутые листы из 5-8 слоев Dps, с толщиной в пределах 200 нм. Варьирование параметров буфера при сохранении соотношения Dps:ДНК привело к образованию разнонаправленных протяженных кристаллов длиной несколько десятков мкм и толщиной до 500 нм. Однако в обоих случаях тип кристалла соответствует ранее определенной упаковке в случае ДНК 10 т.п.н. Комплексное исследование с помощью крио-ПЭМ и аномального малоуглового рентгеновского рассеяния (АМУРР) механизма связывания железа с белком Dps показал, что при добавлении FeSO4 в раствор белка образование кластеров железа происходит уже после 30 секунд инкубации и далее в течение 24 часов существенных изменений не происходит. Кластеры железа состоят из отдельных субъединиц диаметром 1-1.5 нм, увеличение концентрации железа приводит к увеличению доли кластеров с большим размером (объем до 30 нм3), формирование симметричного кластера наблюдается только для 9.5% частиц и при максимальной концентрации FeSO4. С помощью метода анализа одиночных частиц (Single Particle Analysis) получена трехмерная реконструкция додекамеров Dps с кластерами железа с разрешением 2.59 Å. Получены и классифицированы трехмерные реконструкции для всех наблюдаемых в белке кластеров железа. Объём минимального наблюдаемого «строительного элемента» кластеров, сферический кластер - составил не более 1,5 нм3; размер кластера с морфологией типа "гантель" находится в диапазоне от 1,5 нм3 до 4 нм3. Кластеры объемом 4–10 нм3 состоят из нескольких контактирующих субъединиц, выстилающих внутреннюю поверхность полости Dps, что приводит к большому разнообразию наблюдаемых морфологий. Кластеры объемом более 10 нм3 характеризуются большей однородностью (отсутствие субъединиц вследствие слияния), а их различные проекции могут соответствовать различным морфологиям. Анализ данных АМУРР также показал неравномерное распределение кластеров железа в образцах, при этом среднее количество атомов железа, приходящееся на 1 молекулу Dps, меньше расчетного значения, что свидетельствует о неполном заполнении полости белка, и может быть связано с присутствием в буфере EDTA, способной образовывать с катионами металлов соли этилендиаминтетраацетаты. Этот вывод также подтверждается моделированием. Метод АМУРР позволил определить, что одиночные атомы железа также располагаются на поверхности белка, что невозможно увидеть с помощью крио-ПЭМ. С помощью крио-ПЭМ выявлено, что добавление железа в концентрации 50 атомов на частицу Dps не препятствует кристаллообразованию Dps-ДНК, при этом часть кристаллов имеет повышенных контраст, по всей видимости соответствующий накоплению железа в полости Dps. При этом увеличение концентрации железа в растворе до 2000 атомов на частицу Dps приводит к агрегации ДНК, препятствуя кристаллообразованию. Методом МУРР впервые определено, что IHF в растворе образует тример гетеродимеров. Подобраны оптимальные условия изучения комплекса IHF c ДНК с помощью крио-ПЭМ. Показано, что взаимодействие IHF с ДНК приводит к появлению изгибов ДНК. Особенно важно, что структурные исследования были проведены в условиях наиболее приближенных к естественным при отсутствии специальной подготовки препаратов перед исследованиями. Это позволит продвинуться в понимании действия защитного механизма клетки. Выяснение фундаментальных биохимических, генетических и структурных основ резистентности имеет первостепенное значение для разработки стратегий, направленных на ограничение возникновения и распространения устойчивости бактерий, а также разработки инновационных терапевтических подходов.

Аннотация результатов, полученных в 2022 году
В отчетном периоде проведены структурные исследования процессов накопления ионов железа белком Dps в зависимости от состава буферных растворов, концентрации солей железа, воздействия перекиси водорода и ингибиторов. Во всех исследованных образцах в полости додекамеров формируются контрастные железосодержащие кластеры, при этом кластеры заполняют додекамеры неравномерно. Результаты 2D классификации не демонстрируют качественного влияния H2O2 на накопление железа, однако добавление перекиси водорода привело к незначительному (порядка 3%) увеличению доли ядер объемом более 10 нм3. Использование буфера без ЭДТА так же приводило к незначительному увеличению доли крупных ядер, что может быть связано способностью ЭДТА связывать ионы железа. Дополнительно исследовалась возможность ингибирования накопления железа. По результатам крио-ЭМ исследования показано, что во всех образцах происходило накопление Fe додекамерами Dps, ни один из потенциальных ингибиторов не смог полностью остановить данный процесс. Продолжены структурные исследования белка IHF методом МУРР в различных буферах и при различных концентрациях. Из анализа данных МУРР следует, что в растворе с ионами металлов присутствуют преимущественно димеры белка IHF с небольшим количеством образовавшихся тетрамеров и гексамеров. Образование олигомеров также подтверждается с помощью крио-ПЭМ. Дополнительно с помощью метода динамического рассеяния света была проведена оценка степени олигомеризации белка в растворе, определены гидродинамические размеры каждого компонента в полидисперсной системе. В одном из буферов наблюдается концентрационная зависимость, которая проявляется в образовании очень крупных олигомеров при увеличении концентрации белка, причем образуются олигомеры разных порядков. На основании анализа литературных данных и результатов проделанной работы предложена и частично подтверждена гипотеза, которая несколько иначе представляет процесс формирования ДНК-Dps комплексов, где вместо крупных сферических молекул Dps в ранней стационарной фазе присутствует более компактный белок IHF, который доминирует в этой фазе и предшествует появлению Dps в доминантных количествах. Показано, что IHF образует олигомеры в виде цепочек, что предполагает возможность слоевой укладки ДНК с образованием тороидальной структуры в соответствии с функциональной особенностью белков данного класса. Кроме того, геометрические размеры и форма IHF могут объяснить формирование тороидов в ранней стационарной фазе с межплоскостным расстоянием 6.8 – 7.5 нм, как это было определено ранее. Методами крио-ЭМ и МУРР проведены исследования тройного комплекса Dps-ДНК-IHF, подобраны условия его образования. При изучении контрольных образцов Dps-ДНК в образцах с плазмидной ДНК наблюдалось образование сокристаллов и с триклинной, и с кубической решеткой; в образцах с геномной ДНК - только с триклинной. При изучении тройного комплекса Dps-ДНК-IHF (вне зависимости от типов ДНК) наблюдались кристаллы комплекса Dps-ДНК, неупорядоченные агрегаты Dps-ДНК, а также, предположительно, неупорядоченные агрегаты комплексов Dps-ДНК-IHF и ДНК-IHF. Показано, что при увеличении концентрации IHF увеличивается доля неупорядоченных гелеобразных агрегатов и происходит разрушение кристаллов. При этом наблюдаемые агрегаты (предположительно соответствующие тройному комплексу) чрезвычайно подвижны и не содержат повторяющихся структурных элементов, в то время как кристаллы комплекса Dps-ДНК идентифицируются однозначно и соответствуют описанным ранее. Для получения клеток с конденсированным нуклеоидом на стационарной стадии роста был проведен подбор условий культивирования E. coli, затем на клетки оказывали дополнительное воздействие с помощью внесения в среду культивирования различных стресс-факторов, таких как H2O2, а также FeSO4 как отдельно, так и в сочетании. Наличие кристаллов комплекса Dps-ДНК удалось продемонстрировать с помощью крио-ЭМ только на 2 образцах (E. coli + 1 мМ FeSO4 + 1 мМ H2O2 и E. coli + 1 мкМ FeSO4 + 10 мкМ H2O2), подверженных 72-часовому голоданию. Дополнительно были продолжены исследования комплекса Dps с геномной ДНК в буфере, содержащем ионы калия и магния и буфере, в котором ранее наблюдались сокристаллы Dps-ДНК. Проведенное субтомографическое усреднение с последующей трехмерной реконструкцией продемонстрировали взаимное расположение частиц Dps и геномной ДНК. Показано образование одномерных кристаллов или филаментоподобных структур, которые превращаются в слабоупорядоченные комплексы с триклинной элементарной ячейкой, подобные тем, что наблюдается для плазмидной ДНК. Изменение таких факторов внешней среды, как рН, концентрация ионов калия и магния, приводит к образованию незамкнутых цилиндрических структур, впервые наблюдаемых в настоящем Проекте. Установлено, что основным структурным элементом всех изученных комплексов Dps с геномной ДНК является одномерный ряд соприкасающихся додекамеров, окруженных 4 параллельными нитями ДНК.