Аннотация результатов, полученных в 2021 году
За отчетный период разработан метод одностадийной подготовки проб к анализу методом высокоэффективной жидкостной хроматографии, совмещенной с тандемной масс-спектрометрией (ВЭЖХ-МС/МС), включающий иммунопреципитацию фибриногена на магнитных микрочастицах с последующим ферментативным гидролизом. Иммунопреципитация фибриногена из образцов плазмы проводилась с использованием магнитных микрочастиц с NH2-группой (Sileks, Россия), модифицированных моноклональными антителами (МАт) против фибриногена (клон 1F3, HyTest, Россия). Был отработан протокол иммунопреципитации на магнитных частицах фибриногена из плазмы крови здоровых доноров, в т.ч. время инкубации, соотношение количества частиц и объема образца, подбор состава буфера для разведения образца плазмы (содержание ингибиторов протеаз, молярность буфера и его солевой состав, а также присутствие детергентов). Первый этап разработанной методики включает взаимодействие молекул фибриногена с МАт, поэтому крайне важно определить влияние окислителя на эпитопную специфичность МАт к фибриногену. Окисление образцов плазмы проводилось раствором гипохлорита (Sigma, SHBJ5633) при температуре 37°С, 1 час, при постоянном перемешивании. Количество окислителя составляло 300 мкМ. Реакция останавливалась добавлением десятикратного молярного избытка L-метионина. Методом электрофореза в ПААГ было проведено сравнение смывов фибриногена, преципитированного из нативной и окисленной плазмы, с магнитных частиц, модифицированных МАт. Количество фибриногена, захваченного МАт на поверхности магнитных частиц, не зависит от обработки окислителем образцов плазмы, что свидетельствует о том, что эпитопная специфичность сохраняется. Как было показано на электрофореграмме образцов окисленного и неокисленного фибриногена, полипептидные цепи Аα, Вβ и γ сохраняют свою целостность. Другими словами, не наблюдалось ни образования ковалентных сшивок, ни фрагментации цепей в результате воздействия окислителей. Ферментативное расщепление образцов смесью (1:1) трипсина и Arg-C осуществляли в соответствии с протоколом производителя (Trypsin Gold, mass spectrometry grade, V5280, Arg-C, Sequencing Grade, V1881, Promega, США). Эффективность гидролиза оценивалась методом электрофореза в ПААГ. Магнитные частицы после гидролиза были проинкубированы в буфере для образцов с добавлением 5% 2-меркаптоэтанола 5 минут при 90⁰С. Полученная электрофореграмма, демонстрирует, что большая часть белка была успешно гидролизована с поверхности частиц уже через 1 час обработки ферментами. По результатам масс-спектрометрии количество детектированных участков молекулы фибриногена, так называемое покрытие, слабо зависит от времени гидролиза (отличия внутри группы не более 10%). Изменение покрытия в окисленных образцах может быть вызвано рядом причин в т.ч. повреждением участков гидролиза в результате окисления, либо, напротив, экспонированием ранее труднодоступных участков гидролиза в результате гидрофобизации поверхности молекулы белка при окислении. Было исследовано изменение структуры фибриновых сгустков в результате индуцированного окисления. Гель фибрина, полученный из необработанного фибриногена, представляет собой структуру, состоящую из фибрилл, находящихся на большом расстоянии друг от друга, в результате чего в геле образуются крупные поры. Для гелей окисленного фибрина, полученных из фибриногена, обработанного 25, 50 и 150 мкМ HOCl/-OCl, наблюдалось дозозависимое уплотнение фибриновой сетки. Изображения морфологии фибрина, полученные с помощью конфокальной лазерной сканирующей микроскопии (КЛСМ), указывают на то, что умеренное окисление фибриногена 50 мкМ HOCl/-OCl оказало заметное влияние на сеть фибринового геля. Когда фибриноген обрабатывали 300 мкМ HOCl/-OCl, фибриновая сеть состояла из отдельных крупных блоков. Эти результаты дают убедительные доказательства отрицательного воздействия больших количеств HOCl/-OCl на структуру фибриногена, влияя на сборку фибрина. Было показано, что окисление фибриногена гипохлоритом оказывает влияние на сборку фибрина, что обусловлено изменением мутности фибринового геля, а не кинетикой гелеобразования. С увеличением концентрации гипохлорита резко уменьшалась мутность геля (пространственная структура фибрина напрямую связана с мутностью получаемого геля – окисленный фибриноген образует более тонкие фибриллы, что приводит к увеличению прозрачности получаемого геля), что связано с нарушением пространственной структуры фибрина. Для анализа лизиса сгустков фибриногена методом КЛСМ, раствор фибриногена сворачивали тромбином. Тканевый активатор плазминогена (ТАП) и флуоресцентно-меченый плазминоген добавляли в раствор белка перед свертыванием. Лизис проводили при комнатной температуре. Изображения сгустка регистрировались каждые 30 секунд в течение 15 минут. Снижение флуоресценции в образцах было уменьшено за счет использования оптических фильтров, ослабляющих интенсивность лазерного излучения. В присутствии ТАП плазмин постепенно накапливался на неподвижных волокнах во время первой стадии лизиса и оставался связанным с подвижной и частично гидролизованной фибриновой сетью до ее полного лизиса во время второй фазы. В самые последние моменты лизиса как фибрин, так и плазмин, по-видимому, концентрируются в остатках сетки, предположительно, в результате агрегации разрозненных частей фибриновой сети. В случае фибринового сгустка, образованного из окисленного фибриногена, процесс накопления плазминогена и лизиса сгустка замедляются, за счет образования более плотной структуры геля, а также, вероятно из-за повреждения участков связывания с плазминогеном в молекуле фибрина. Все вышеописанные методики, позволяющие исследовать изменение структуры, динамики образования и лизиса фибриновых сгустков были адаптированы для работы с образцами плазмы в микрообъемах. Для анализа возможного вклада окислительно модифицированного плазминогена в нарушения процесса лизиса сгустка, был проведен ряд экспериментов по исследованию влияния индуцированного окисления на молекулу плазминогена и сохранение функциональных свойств плазмина, образованного из окисленного плазминогена. Согласно полученным данным, молекула плазминогена проявляет высокую устойчивость к воздействию окислителей, и в физиологических условиях, когда в растворе будет присутствовать смесь плазменных белков, перехватывающих основную массу свободных радикалов, влиянием окисления плазминогена на лизис фибриновых сгустков можно пренебречь. В соответствии с планом работ на данный отчетный период, методом ВЭЖХ МС/МС были проанализированы 24 образца возрастной контрольной группы (средний возраст донора - 68,5 лет). Была получена информация о точном расположении модифицированных остатков аминокислот, о их типах модификации, а также о степени модификации идентифицированных аминокислотных остатков молекулы фибриногена. Как и в экспериментах с модельными системами, большая часть модифицированных аминокислотных остатков (10 окисленных аминокислотных остатков метионина было идентифицировано) относится к метионинам с самым распространенным типом модификации: +15.99 Oxidation. В большей части случаев степень окислительной модификаций не превышает 10%.

Аннотация результатов, полученных в 2022 году
В соответствии с заявленным планом работ, сгустки, образованные из фибриногена (ФГ) плазмы крови доноров контрольной группы (средний возраст 68,2лет), пациентов с диагностированной болезнью Альцгеймера (БА) (средний возраст - 73,2 года) и пациентов с синдромом мягкого когнитивного снижения (МКС) (средний возраст - 71,8 год), были охарактеризованы с точки зрения их структуры, динамики образования и лизиса. Полученные методом конфокальной лазерной сканирующей микроскопии (КЛСМ) изображения фибринового геля из ФИТЦ-меченного фибриногена позволяют визуализировать статичную структуру сгустка. Образцы фибринового геля, полученного из плазмы контрольной возрастной группы, группы МКС и БА, не показали значительных различий в структуре. Гели характеризовались более плотной структурой, тонкими фибриллами и меньшим размером пор по сравнению с группой здоровых доноров (средний возраст – 34 года). Для исследования методом КЛСМ кинетики гидролиза фибринового геля и распределения в нем плазмина гель получали из не меченого ФГ. На первом этапе ФИТЦ-меченный плазмин(оген) связывается с волокнами фибрина, визуализируя структуру сети. С течением времени происходит гидролиз геля. Визуализация фибриновой сети в норме (в образцах здоровых молодых доноров) начинается уже с конца первой минуты, к 5 минутам сеть визуализирована полностью, и к 10 минутам наблюдается почти полный ее гидролиз. Для ФГ, содержащегося в образцах плазмы остальных групп (контрольные возрастные доноры, МКС, БА), процессы визуализации геля и его гидролиза были в существенной мере замедлены (см. дополнительные материалы). Скорость полимеризации и деградации фибрина оценивали по изменению мутности при 350 нм. По сравнению с группой здоровых доноров (средний возраст 34 года) в группах с БА, МКС и доноров со средним возрастом 68,2 года наблюдается уменьшение максимального наклона полимеризационной кривой, что свидетельствует о замедлении процесса гелеобразования. Также снижается значение максимальной оптической плотности, т.е. гель становится более прозрачным, что указывает на изменение структуры геля. Однако достоверных различий между исследуемыми группами (БА, МКС и доноры со средним возрастом 68,2 года) не было обнаружено из-за неоднородности полученных результатов внутри групп, что может быть связано с наличием сопутствующих заболеваний и проводимого лечения. При измерении мутности в процессе гидролиза сгустка в образцах плазмы пациентов с БА, МКС и доноров со средним возрастом 68,2 года также наблюдается снижение максимальной оптической плотности и сдвиг максимума оптической плотности кривой гидролиза во времени в сторону увеличения, что указывает на замедление процесса фибринолиза. Совокупность результатов указывает на ухудшение связывания плазмина с волокнами фибрина, что в сочетании с уплотнением структуры фибринового сгустка приводит к замедлению процесса фибринолиза. За отчетный период настоящего проекта методом тандемной масс-спектрометрии были проанализированы образцы пациентов с синдромом МКС, пациентов с диагностированной БА. Исследование посттрансляционной модификации фибриногена in vivo осуществлялось на базе коллекции клинических образцов плазмы крови, собранной в 2016-2020 гг. в ФГБНУ “НАУЧНЫЙ ЦЕНТР ПСИХИЧЕСКОГО ЗДОРОВЬЯ” Министерства здравоохранения РФ в рамках проектов РНФ №04-208 04-207, №16-14-01181 (рук. А.С. Кононихин). Для каждого из проанализированных образцов суммарное покрытие (детектированные области молекулы фибриногена) составляло около 80%. Среднее покрытие альфа цепи – 76,8%, бета цепи – 87%, гамма цепи – 88%. Среди обнаруженных во всех образцах посттрансляционных модификаций, наиболее часто определяемыми являются: окисление (+15.99), дезамидирование (+0.98), диокисление (+31.99), окисление до 2-амино-3-оксобутановой кислоты (-2.02) и другие (см. дополнительные материалы). Практически все обнаруженные ПТМ молекулы фибриногена вопроизводимо детектировались во всех исследуемых группах возрастных доноров. Однако, внутри групп часто наблюдалась значительная неоднородность в уровнях одних их тех же модификаций. Несмотря на это, при сравнении уровней ПТМ между исследуемым группами наблюдались корреляции. Например, между группой пациентов с диагностированной БА и доноров контрольной группы (средний возраст 68,2лет) определилось несколько ПТМ, которые достоверно отличаются в выборках и могут стать кандидатами для дальнейшей проверки на большем числе образцов. Для оценки различий между группами образцов использовался U-критерий Манна — Уитни. Согласно статистической оценке, между группами контроля (средний возраст 68,2лет) и пациентами с диагностированной БА достоверно отличались уровни модификаций: для альфа цепи: (+15.99) M 207 (p=0.031), (-18.01) D 212 (p=0.0412), (+31.99) R 244 (p=0.0120), (+0.98) Q 563 (p=0.0151), (+15.99) M 584 (p=0.0301); бета цепи: (+15.99) P 31 (p=0.0134); гамма цепи: (-18.01) Y 96 (p=0.0054). Также, в соответствии с планом работ было проведено сравнение результатов ВЭЖХ-МС/МС фибриногена, полученных ранее при индуцированном окислении белка с результатами окислительной модификации фибриногена in vivo в образцах плазмы крови пациентов с БА, синдромом МКС и контрольной группы. Для сравнения с окислением in vitro, были взяты средние значения уровня модификаций для каждой из групп. Аминокислотные остатки образцов in vivo, для которых значения уровня модификаций были примерно равны (± 3%) контрольным образцам в экспериментах in vitro (т.е. фибриноген, выделенный из образцов здоровых доноров со средним возрастом – 34 года), альфа цепи: 91 M, 259 M; 517 M (23,2%), бета цепи: 190 M, 224 M, 235 P, 242 M, 249 W, 305 M, 314 M, 373 M, 418 W, 426 M, 438 M и гамма цепи: 78 M, 89 M, 94 M. Значения уровней модификаций во всех группах образцов в этом случае, за исключением 517 M, в среднем не превышало 15%. В это же время, наблюдалась группа аминокислотных остатков, уровень модификаций которых в исследуемых образцах пациентов и возрастной контрольной группы в среднем значительно превышал необработанные окислителем контрольные образцы здоровых доноров (со средним возрастом 34 года). В их число входят: для альфа цепи: 207 M(+15.99), 258 Y(+15.99), 276 W(+15.99), 437 M(+15.99) в бета и 264 M(+15.99) в гамма цепи, уровень окисления которых равен таковому у образцов фибриногена (± 5%), обработанных 50 мкМ гипохлорита, и 495 M(+15.99), 603 M(+15.99) в альфа цепи, и 397 M (+15.99) в гамма цепи, уровень окисления которых характерен таковому при обработке фибриногена 25 мкМ гипохлорита. Кроме того, в образцах исследуемых групп наблюдались ПТМ, которые отсутствовали или имели крайне низкие (около 0,5%) значения в образцах, подвергнутых индуцированному окислению. К их числу относятся в альфа цепи: 3 S(+79.97) – 16,7%, 212 D(-18.01) – 35,6%, 229 W(+31.99), 235 M(+15.99), 238 M(+15.99) – 5,6%, 245 P(+13.98) – 4,6%, 546 P(+15.99) – 8,5%, в гамма цепи - 96 Y(-2.02) – 6,7%, 348 Y(-18.01) – 18,2%. Можно предположить, что упомянутые выше ПТМ могут в той или иной степени влиять на функциональные свойства фибриногена, приводя к нарушениям структуры сгустков и процесса фибринолиза, продемонстрированных ранее с помощью КЛСМ.