Аннотация результатов, полученных в 2021 году
Известно, что во многих патологических состояниях нарушено функционирование пуринергических рецепторов Р2Х типа, что позволяет рассматривать их в качестве новых перспективных молекулярных мишеней для лечения ряда серьезных заболеваний. В настоящее время интенсивно исследуется терапевтический потенциал антагонистов Р2Х7 рецепторов для лечения ряда патологий, главным образом, хронической нейропатической боли, психических и нейродегенеративных заболеваний, воспаления, а также рака и внутриклеточных инфекций. Обнаружено, что воспаление клеток микроглии, окружающих нейроны, является одной из существенных причин нарушений функционирования нейронов, приводящих к болезни Паркинсона, Альцгеймера и к ряду других нейродегенеративных заболеваний. Одной из причин воспаления макрофагальных клеток и микроглии является действие высоких концентраций АТФ на пуринергические рецепторы, в основном Р2Х7 подтипа. Морские анемоны (актинии) являются перспективным источником получения пептидных соединений, обладающих противовоспалительным и нейропротекторным действием. Продуцируемые актиниями яды представляют собой сложные смеси биологически активных соединений, которые работают в синергизме и выполняют важную роль в морском биоценозе. Являясь уникальными по специфичности и эффективности действия молекулами, они способны влиять на различные физиологические процессы в организме жертвы или потенциального хищника. В данной работе мы впервые показали способность пептидов морских анемон блокировать в нейронах активность пуринергических рецепторов Р2Х7 подтипа и, тем самым, предохранять клетки от нейродегенеративных изменений. На первом этапе нами были выделены и охарактеризованы как уже известные, так и новые природные и рекомбинантные пептиды, определена их цитотоксическая активность. Установлено, что все исследуемые пептиды являются нетоксичными для мышиных нейрональных клеток линии Neuro-2a. Обнаружено, что пептиды способны блокировать как токсический эффект, вызванный АТФ в клетках Neuro-2a, так и функциональную активность рецепторов P2X7, что было подтверждено ингибированием входа Ca2+ и поглощения клетками ряда низкомолекулярных красителей. Молекулярный механизм ингибирующего действия пептидов отчасти может быть объяснен их прямым взаимодействием с субъединицами рецептора Р2Х7. Впервые методом биосенсорного анализа было показано, что пептиды способны связываться с внеклеточным доменом P2X7 рецептора. С другой стороны обнаружено, что пептиды способны снижать экспрессию Р2Х7 рецептора в нейрональных клетках, что также может объяснять их блокирующие действие. Таким образом, в результате работы нам удалось найти пептиды, которые способны взаимодействовать с P2X7 рецепторами и блокировать их активность, что свидетельствует о высоком фармакологическом потенциале этих соединений и обусловливает возможность их использования в качестве прототипов лекарственных препаратов. Результаты исследований опубликованы в журнале International Journal of Molecular Sciences (IF 5.924, Q1).

Аннотация результатов, полученных в 2022 году
Для выполнения работ второго этапа проекта были отобраны пептиды Кунитц-типа морских анемон Heteractis crispa и Stichodactyla mertensii, которые оказались перспективными кандидатами для последующих исследований их противовоспалительных свойств: HCGS1.36, HCGS1.44, HCGS1.46, HCRG1, HCTX1, SMTX1 и SMTX1A49E. Пептиды получали путем экспрессии кодирующих их генов в системе E.coli с последующей очисткой с применением металл-аффинной и высокоэффективной жидкостной хроматографии. Установлено, что все пептиды в диапазоне концентраций до 50 мкМ являются нетоксичными в отношении макрофагальных клеток RAW 264.7. Оценено влияние отобранных пептидов на активность гистаминовых рецепторов методом регистрации внутриклеточной концентрации ионов кальция ([Ca2+]i ) в клетках RAW 264.7 с помощью флуоресцентного зонда Fluo-8/AM методом спектрофлуориметрии. Установлено, что большинство исследуемых пептидов оказывают ингибирующее действие на функционирование гистаминовых рецепторов в макрофагальных клетках RAW 264.7. Наиболее активными оказались пептиды HCGS1.36, HCGS1.46, SMTX1 SMTX1A49E, HCRG1, которые в концентрации 0,1-10 мкМ снижали внутриклеточную концентрацию ионов кальция практически в два раза по сравнению с клетками, к которым добавляли только гистамин. Использование специфического блокатора гистаминового H1 рецептора фексофенадина значительно ингибирует повышение гистамин-индуцированной внутриклеточной концентрации Ca2+, что свидетельствует о значительном вкладе в кальциевый ответ H1 рецептора. Методами иммуноцитохимии и вестерн-блотинга, с использованием коммерческих первичных антител к H1 рецептору было показано, что клетки RAW 264.7 содержат гистаминовые H1 рецепторы. Установлено, что исследуемые пептиды способны регулировать уровень экспрессии генов, кодирующих H1 гистаминовые рецепторы. Показано, что длительное, в течение 24 часов, инкубирование пептида SMTX1 с макрофагальными клетками RAW 264.7 приводит к уменьшению уровня H1 рецептора в этих клетках. Исследованы противовоспалительные и антиоксидантные свойства пептидов на клетках RAW 264.7. Воспалительный процесс в этих клетках был индуцирован добавлением индуктора воспаления – бактериального липополисахарида (ЛПС), что приводило к образованию активных форм кислорода (АФК) в клетках. Большинство протестированных пептидов эффективно и достоверно снижали уровень АФК в макрофагальных клетках при действии ЛПС, что свидетельствует об их противовоспалительном потенциале. Наиболее эффективными оказались пептиды SMTX1, SMTX1A49E, HCGS1.36 и HCGS1.46 в концентрации 0,1-10 мкМ Противовоспалительная эффективность отобранных соединений была также оценена на клетках RAW 264.7 по степени блокирования продукции ряда провоспалительных цитокинов (ФНО-альфа, ИЛ-1бета) и провоспалительных ферментов (ЦОГ-2 и 5-ЛОГ), индукция которых была стимулирована бактериальным ЛПС. Ингибирующую активность проявили пептиды SMTX1 и SMTX1A49E, которые достоверно снижали уровень ИЛ-1бета на 10 и 33% соответственно. В случае ФНО-альфа, помимо пептидов SMTX1 и SMTX1A49E, ингибирование продукции цитокина показали пептиды HCGS1.36 и HCGS1.46; снижение составило от 37 до 51% в сравнении с ЛПС-стимулированными клетками. Циклооксигеназа-2 (ЦОГ-2) и 5-липоксигеназа (5-ЛОГ) играют важную роль в процессе воспаления, включая нейровоспаление, и являются основными компонентами процесса прогрессирования болезни Паркинсона. Известно, что при действии ЛПС уровень этих ферментов резко возрастает. Большинство пептидов показали способность снижать уровень ЦОГ-2 и 5-ЛОГ, однако наиболее активными оказались лишь SMTX1 и SMTX1A49E. Таким образом, нам удалось обнаружить ряд пептидов, которые способны не только блокировать активность гистаминовых рецепторов и влиять на их уровень в клетках RAW 264.7, но и оказывать влияние на воспалительные процессы за счет снижения уровня АФК, уменьшения уровня провоспалительных цитокинов (ФНО-α, ИЛ-1β), а также снижения количества провоспалительных ферментов (ЦОГ-2, 5-ЛОГ), что свидетельствует об их фармакологическом потенциале, как противовоспалительных препаратов. Таким образом все поставленные задачи на второй год реализации проекта были выполнены в полном объеме.