Аннотация результатов, полученных в 2021 году
Апурин-апиримидиновые сайты (АП-сайты) — наиболее часто встречающиеся повреждения ДНК, которые возникают при утере оснований ДНК за счет гидролиза N-гликозидной связи в водной среде спонтанно, либо под влиянием генотоксичных воздействий (ионизирующая радиация, многие химиотерапевтические агенты), а также как интермедиаты репарации ДНК. АП-сайты чувствительны к гидролизу, элиминированию и окислению, порождая целый спектр реакционноспособных повреждений ДНК. Было показано, что АП-сайты и их производные охотно реагируют с нуклеофильными группами. Так как ДНК живых организмов постоянно связана с широким набором разнообразных белков, (например, с гистонами, богатыми нуклеофильными остатками лизинов), это часто приводит к образованию ДНК-белковых сшивок, репарация которых происходит путем протеолиза белка до небольшого пептида. Однако в настоящий момент совершенно непонятно, что происходит с оставшимися ДНК-пептидными сшивками в дальнейшем, и как аддукты АП-сайтов с пептидами влияют на основные генетические процессы клетки. Настоящий проект призван восполнить этот пробел. В ходе первого года реализации нами были получены стабильные, химически детерминированные модели конъюгатов натурального АП-сайта с пептидами разной структуры: линейным пептидом (I-пептид) и разветвленным пептидом (Y-пептид). Протокол создания такого рода моделей позволяет получить аддукты АП-сайтом с большим разнообразием различных пептидов, и может быть использован исследователями по всему миру. Мы начали характеризовать влияние аддуктов АП-сайтов с пептидами на работу ферментов важнейших процессов метаболизма ДНК: ферментов матричного синтеза и репарации ДНК. Мы исследовали способность ДНК-полимераз, принадлежащих к разным структурным семействам, вести синтез на матрицах, содержащих аддукты АП-сайтов с пептидами, а также оценили мутагенный потенциал аддуктов. Оказалось, что блокирующие свойства конъюгатов АП-сайтов с пептидами соизмеримы с блокирующими свойствами АП-сайта в случае линейного I-пептида, и незначительно превышают блокирующие свойства АП-сайта в случае разветвленного Y-пептида. Мы показали, что некоторые нуклеазы, участвующие в репарации ДНК, способны эффективно гидролизовать пептидные конъюгаты с АП-сайтами особенно в условиях так называемой «инцизионной репарации нуклеотидов». При количественной оценке эффективности гидролиза оказалось, что АП-эндонуклеазы суперсемейства «TIM-бочка» процессируют пептидные конъюгаты с АП-сайтами либо с аналогичной, либо с превышающей по отношению к каноничным субстратам эффективностью, что говорит о возможной биологической роли данных ферментов в репарации пептидных аддуктов с АП-сайтами. Таким образом заявленный в проекте план работы научного исследования на отчетный период выполнен в полном объеме и все заявленные научные результаты были достигнуты. В рамках реализации проекта была опубликована одна статья в журнале, индексируемом в WoS (Q2) и Scopus (Q2).

Аннотация результатов, полученных в 2022 году
Апурин-апиримидиновые сайты (АП-сайты) — наиболее частые спонтанные повреждения ДНК, образующиеся при самопроизвольном гидролизе N-гликозидной связи в водной среде или под влиянием различных генотоксичных агентов и как интермедиаты репарации ДНК. Было показано, что АП-сайты, как их производные, крайне реакционоспособны и охотно реагируют с нуклеофильными группами многих молекул. Так как ДНК живых организмов постоянно связана с широким набором разнообразных белков, (например, с гистонами, богатыми нуклеофильными остатками лизинов), это часто приводит к образованию ДНК-белковых сшивок. Судьба ДНК-белковой сшивки в клетке предрешена и заключается в протеолитической деградации белковой части до небольшого пептида. Однако в настоящий момент совершенно непонятно, что происходит с оставшимися ДНК-пептидными сшивками в дальнейшем, и как аддукты АП-сайтов с пептидами влияют на основные генетические процессы клетки. Настоящий Проект призван восполнить этот пробел. В ходе второго года реализации Проекта мы полностью охарактеризовали влияние аддуктов АП-сайтов с пептидами на работу ферментов важнейших процессов метаболизма ДНК: ферментов матричного синтеза и репарации ДНК. Мы использовали созданный в первый год реализации Проекта протокол создания модельных ДНК-пептидных сшивок с АП-сайтом для получения множества разнообразных субстратов для изучения различных ферментов. Мы исследовали способность транслезионных ДНК-полимераз человека, участвующих в клетке в преодолении повреждений ДНК, вести синтез на матрицах, содержащих аддукты АП-сайтов с пептидами разной структуры. Оказалось, что аддукты с пептидом, пришитым N-концевой аминогруппой (I-пептид) и пептидом, пришитым аминогруппой внутреннего бокового радикала (Y-пептид), сильно блокируют даже транслезионные ДНК-полимеразы. При этом присутствие пептидных аддуктов в вытесняемой ДНК-полимеразами комплементарной цепи не мешает ДНК-полимеразами вести синтез с вытеснением. Более того, мы показали, какие механизмы используют ДНК-полимеразы при преодолении ДНК-пептидных сшивок. Оказалось, что наиболее вероятно участвующие в преодолении такого рода повреждений в клетке репаративные и транслезионные ДНК-полимеразы, не включают нуклеотид напротив повреждения, а предпочитают «проскальзывать» ДНК-пептидную сшивку, что говорит о крайне высоком мутагенном потенциале повреждения. Кроме того, мы показали, что присутствие ДНК-пептидных конъюгатов представляет собой препятствие для расщепления ДНК ферментами экзонуклеазами, что еще раз подчеркивает оказываемое большое негативное влияние исследуемого повреждения на метаболизм ДНК. Высокая мутагенность ДНК-пептидных сшивок, показанная в биохимических экспериментах, говорит о необходимости быстрой и эффективной репарации пептидных аддуктов с АП-сайтами в клетке. На основании полученных в рамках реализации Проекта результатов, мы предположили, что репарация пептидных сшивок может идти по пути эксцизионной репарации оснований, что подтвердили экспериментально, восстановив полный цикл репарации в пробирке. Кроме того, была оценена эффективность репарации I- и Y-аддуктов в клетках человека и бактерий. Было показано, что репарация пептидных конъюгатов в клетках человека идет медленнее, чем аналога АП-сайта. Таким образом заявленный в Проекте план работы научного исследования выполнен в полном объеме и все заявленные научные результаты были достигнуты. В рамках реализации Проекта опубликована одна статья в журнале Genes (IF = 4.141; WoS Q2, Scopus Q2), принята к публикации статья в высокорейтинговом журнале Nucleic Acids Research (IF = 19.160, WoS Q1; Scopus Q1). Еще одна статья находится на этапе рецензирования в журнале International Journal of Molecular Sciences (IF = 6.208; WoS Q1, Scopus Q1) и к моменту окончания реализации Проекта 30 июня 2023, вероятно, также будет принята к публикации (рукопись статьи приложена в качестве дополнительного материала).