Аннотация результатов, полученных в 2021 году
Растения галофиты известны своей устойчивостью к суровым условиям окружающей среды, связанной с избытком солей в местах их обитания. Их устойчивость к таким условиям среды обусловлена, помимо прочего, высокой способностью к детоксикации свободных радикалов, что возможно благодаря сравнительно высокому содержанию антиоксидантов, в том числе соединений полифенольной природы. Что делает данные растения привлекательными с точки зрения биотехнологии, фармацевтической и пищевой промышленности. На побережье Балтийского моря и в лагунах произрастает несколько редких видов-галофитов, занесённых в Красную книгу Калининградской области (Россия) и Балтийского региона, среди которых наибольший интерес вызывают два вида Spergularia marina (L.) Griseb. и Glaux maritima L. Биологическая активность и химический состав вторичных метаболитов видов остаются мало изучены, также не исследованным остаётся биотехнологическое использование данных видов для получения клеточных и тканевых культур. Целью настоящего исследования стало изучение накопления некоторых групп фенольных соединений в различных частях растений S. marina и G. maritima в условиях слабого и сильного засоления почвы, анализа антиоксидантной, антибактериальной и фунгицидной активности экстрактов исследуемых видов растений, а также биотехнологическое использование данных растений для микроклонального размножения, получения клеточных и тканевых культур (бородатых корней). В настоящем исследовании изучено накопления некоторых групп фенольных соединений в различных частях растений S. marina и G. maritima в условиях слабого и сильного засоления почвы, а также анализ антиоксидантной, антибактериальной и фунгицидной активности экстрактов исследуемых видов растений. Показано увеличение общего содержания фенольных веществ в корнях и стеблях S. mariana и в стеблях G. maritima в ответ на повышение засоленности почвы. При этом общее содержание флавоноидов во всех исследованных частях двух видов растений оставалось неизменным. Однако, содержание отдельных флавоноидов (гесперетин, эпикатехин, производные апигенина и лютеолина) в S. mariana повышалось. В свою очередь, для G. maritima наблюдалась тенденция снижения содержания флавоноидов в корнях и стеблях с увеличением солености почвы. Отмечено повышение суммарного содержания гидроксикоричных кислот в корнях Glaux maritima, так же как и повышение содержания протокатеховой кислоты в корнях и стеблях Spergularia marina. Установлена положительная связь между антиоксидантной активностью экстрактов корней S. mariana и общим содержанием фенольных соединений, а также экстрактов побегов G. maritima и общим содержанием фенольных соединений. Была изучена антибактериальная и фунгицидная активность экстрактов из различных частей S. mariana и G. maritima в отношении Escherichia coli, Bacillus subtilis и Candida albicans. Экстракты S. mariana не показали антибактериальной активности, а слабая фунгицидная активность экстрактов стеблей и соцветий, произраставших на почвах с сильным уровнем засоления, выявлена в отношении C. albicans. Экстракты корней и стеблей G. maritima показали слабую антимикробную и фунгицидной активность. В нашем исследовании были подобраны параметры для культивирования, микроклонального размножения и укоренения в условиях in vitro редких видов галофитов S. marina и G. maritima. Для подбора оптимальных сред для роста в культуре in vitro было использовано 7 безгормональных питательных сред: Мурасиге-Скуга (МS) и её модификации – ½МS и ¼МS с ½ и ¼ по макроэлементам, Шенка-Хильдебранта, Гамборга (В5), среда BABI и Андерсона, с добавлением 30 г/л сахарозы и 7 г/л агар-агара. Результаты исследования показали, что для роста и развития S. marina оптимальной является среда Гамборга (В5), в свою очередь для G. maritima оптимальной является среда Андерсона. Для мультипликации и получения адвентивных микропобегов S. marina в условиях in vitro наиболее эффективно использовать среду Гамборга (В5) без регулятора роста или с применением кинетина в концентрации 0,1 или 0,5 мг/л. Для получения адвентивных микропобегов и микроклонального размножения G. maritima перспективно использовать 2iP в концентрации 2,50 мг/л, TDZ в концентрации 0,50 мг/л, 6-BAP в концентрации 0,10 и 0,50 мг/л или на среде ½МS без регуляторов роста, ввиду потенциального токсичного действия регуляторов роста. Для укоренения эксплантов S. marina и G. maritima в условиях in vitro можно использовать любую среду из представленных в данном исследовании. Было показано, что питательные среды содержащие ИУК, ИМК, НУК, 2,4-Д, ХВУК в концентрации 0,25 мг/л стимулируют образование корней на стеблях S. marina, что может быть использовано для укоренения растений в культуре in vitro, а также данные регуляторы роста в концентрации 0,25 мг/л потенциально можно использовать для укоренения ex vitro. Питательные среды содержащие ИМК в концентрации 0,25 мг/л стимулируют обильное образование корней на стеблях G. maritima. Впервые были получены клеточные культуры для Spergularia marina. Первичные каллусные культуры S. marina были получены на питательной среде Мурасиге-Скуга с добавлением 30 г/л сахарозы и 7 г/л агар-агара и с сочетанием регуляторов роста цитокининового и аукснового ряда: БАП 0,25 мг/л; ИУК 1,00 мг/л; БАП 0,25 мг/л; 2,4-Д 1,00 мг/л; кинетин 0,25 мг/л; ХВУК 1,00 мг/л; кинетин 0,25 мг/л; 2,4-Д 1,00 мг/л; 2iP 0,25 мг/л; 2,4-Д 1,00 мг/л; 2iP 0,25 мг/л; ХВУК 1,00 мг/л; TDZ 0,25 мг/л; ИМК 1,00 мг/л; TDZ 0,25 мг/л; НУК 1,00 мг/л; TDZ 0,25 мг/л; 2,4-Д 1,00 мг/л; TDZ 0,25 мг/л; ХВУК 1,00 мг/л. В свою очередь, первичные каллусные культуры G. maritima получены на питательной среде Мурасиге-Скуга с добавлением 30 г/л сахарозы и 7 г/л агар-агара с добавлением следующего сочетания регуляторов роста: 2,4-Д 0,25 мг/л; TDZ 0,25 мг/л; 2,4-Д 1,00 мг/л; TDZ 0,25 мг/л; НУК 1,00 мг/л; 2iP 0,25 мг/л; НУК 1,00 мг/л; БАП 0,25 мг/л; ИМК 1,00 мг/л; БАП 0,25 мг/л; НУК 1,00 мг/л; Кинетин 0,25 мг/л; ИМК 1,00 мг/л; Кинетин 0,25 мг/л; 2,4-Д 1,00 мг/л; Кинетин 0,25 мг/л; НУК 1,00 мг/л. Для субкультивирования полученных клеточных линий первичного каллуса рекомендуется использовать среду соответствующего состава, на которой был получен первичный каллус. Условия культивирования – пассаж в чашки Петри, инкубация в темноте при температуре 25℃, пассирование каждые 30 дней. Впервые была проведена агробактериальная трансформации двух видов галофитов S. marina и G. maritima. Для индукции бородатых корней было использовано 7 диких штаммов Agrobacterium rhizogenes, полученные от разных организаций: А4 (МГУ), А4 (УФА), MSU 440, 15834 (МГУ), 15834 (УФА), Arqua, 8196. Кокультивация эксплантов продолжалась по двум протоколам – в течение 30 мин и 24 часов. Первичные экспериментальные данные показали значительное образование корней на эксплантах обоих видов растений после кокультивации в суспензии Agrobacterium rhizogenes, по сравнению с контрольными эксплантами.

Аннотация результатов, полученных в 2022 году
Проведена серия экспериментов по агробактериальной трансформации изученных видов для индукции бородатых корней. Было использовано 10 диких штаммов Agrobacterium rhizogenes: 15834 SWISS, 15834 Барнаул, 15834 МГУ, 15834 Уфа, A4 Барнаул, A4 МГУ, A4 Уфа, 8196, Arqua, MSU 440, а также различные подходы к продолжительности кокультивации эксплантов с бактериями (30 мин, 2 часа, 4 часа, 24 часа), добавление ацетосирингона, обработка ультразвуком. По результатам экспериментов и ПЦР анализа для подтверждения трансгенного статуса были получены пять штаммов бородатых корней G. maritima и 4 штамма бородатых корней S. marina, при этом в ДНК образцов vir–гены обнаружены не были, что указывает на отсутствие контаминации ДНК растений Ri-плазмидой A. rhizogenes. Все полученные штаммы бородатых корней были перенесены на жидкую среду для культивирования, и только два штамма бородатых корней дали стабильно растущую культуру 8196 2ч- G. maritima и А4 МГУ S. marina. Оценены ростовые характеристики каллусных культур S. marina. Наибольшей интенсивностью роста обладает каллусная культура S. marina, культивируемая на среде Мурасиге-Скуга с 7 г/л агара и 30 г/л сахарозы с добавлением ТДЗ 0,5 мг/л и ИМК 0,25 мг/л, у которой в стационарную фазу индекс роста по сырой биомассе был равен 4,1 ± 0,6, по сухой биомассе – 4,3 ± 0,6. Наименьшей интенсивностью роста обладает каллусная культура S. marina, культивируемая на среде с добавлением ТДЗ 0,25 мг/л и ИМК 0,25 мг/л, индекс роста которой по сырой биомассе составил 1,9 ± 0,1, по сухой биомассе – 2,0 ± 0,1. Оценены ростовые характеристики штамма бородатых корней 8196 2ч- G. maritima, построена кривая роста культуры. Культура не достигла стационарной стадии во время эксперимента. Индекс роста по сырой биомассе равен 5,1 ± 0,3, по сухой биомассе – 4,9 ± 0,1. Культура бородатых корней 8196 2ч-G. maritima показала хороший рост и перспективы для дальнейшего исследования. Выявлено высокое содержание БАВ фенольной природы в культуре S. marina на среде MS с добавлением сочетаний регуляторов роста: ТДЗ 0,25 мг/л и 2,4-Д 1 мг/л; ТДЗ 0,1 мг/л и 2,4-Д 1,5 мг/л; ТДЗ 0,25 мг/л и ИМК 0,25 мг/л; ТДЗ 0,5 мг/л и ИМК 0,25 мг/л; Кин 0,25 мг/л и 2,4-Д 0,5 мг/л. Экстракты проявили высокую антиоксидантную активность, но не антибактериальную и фунгицидную активности. Проведен фитохимический анализ содержания некоторых групп фенольных соединений и антиоксидантной активности экстрактов полученных каллусных культур. Суммарное содержание фенольных соединений в каллусной культуре S. marina, культивируемой на питательной среде с добавлением 0,25 мг/л ТДЗ и 1 мг/л 2,4-Д, в 4 раза ниже, чем их содержание в нативном растении. Присутствие флавоноидов обнаружено только в двух каллусных культурах, в концентрациях от 4 до 20 раз меньших по сравнению с нативным растением S. marina. Во всех культурах антиоксидантная активность была ниже по сравнению с нативным растением. Выявлено высокое содержание БАВ фенольной природы в каллусных культурах G. maritima. Установлено что каллусы на средес 0,25 мг/л 2iP и 1,0 мг/л 2,4-Д; 0,25 мг/л БАП и 1,0 мг/л 2,4-Д, проявляющих высокую антиоксидантную активность, но не проявляющих антибактериальную и фунгицидную активности. В свою очередь каллусы, культивируемые на среде 0,25 мг/л ТДЗ и 1 мг/л ИМК проявили антибактериальную активность в отношении E. coli, B. subtilis и C. albicans. Содержание фенольных соединений в каллусной культуре на средах с добавлением 0,25 мг/л 2iP и 1,0 мг/л 2,4-Д превосходит в 1,5 раза содержание в побегах нативных растений, при этом содержание флавоноидов меньше, чем в нативных растениях. Однако, содержание гидроксикоричных кислот в каллусной культуре 0,25 мг/л 2iP и 1,0 мг/л 2,4-Д более чем 3 раза превосходит содержание в нативных растениях. Выявлено, что экстракты каллусных культур, обладают большей антиоксидантной активностью (DPPH) по сравнению с нативными растениями. В трех культурах бородатых корней G. maritima (15834 SWISS, 8196 2ч- и 8196 2ч+) и одной культуре S. marina (А4 МГУ) выявлено высокое содержание фенольных соединений, флавоноидов, гидроксикоричных кислот, а также высокая антиоксидантная активность экстрактов, превышающие или сопоставимые с таковыми с нативными растениями. Однако, исследованные экстракты культур бородатых корней не проявляли антибактериальной активности в отношении тестовых микроорганизмов. Подобраны параметры повышения биосинтетической активности клеточных и тканевых культур S. marina и G. maritima. Выявлено, что аминокислоты (тирозин и фенилаланин) оказывают влияние на рост и содержание биологически активных веществ в каллусных культурах S. marina. Показано увеличение прироста биомассы, содержания различных групп фенольных соединений и антиоксидантной активности в экстрактах каллусных культур при увеличении концентрации аминокислот. При умеренном засолении 25–200 мМ NaCl наблюдается прирост биомассы каллусных культур S. marina, повышается суммарное содержание фенольных соединений и гидроксикоричных кислот, а также антиоксидантная активность экстрактов. Выявлено, что для каллусных культур G. maritima наибольшее содержание фенольных соединений, гидроксикоричных кислот и максимальная антиоксидантная активность наблюдаются при уровне засоления NaCl 50-100 мМ. На примере культуры бородатых корней 8196 2ч- G. maritima выявлено, что повышение концентрации аминокислот (0,1–1 мМ) и засоления (25–500 мМ) в питательной среде для культивирования, приводит к значимому снижению прироста биомассы бородатых корней, а на высоких концентрациях NaCl (500 мМ) наблюдается убыль биомассы. При этом повышение концентрации аминокислот (до 1 мМ) и NaCl (до 200 мМ) приводит к повышению содержания основных вторичных метаболитов фенольной природы и антиоксидантной активности экстрактов бородатых корней. В исследовании влияние солевого стресса на фенольные соединения и антиоксидантную активность у растений S. marina и G. maritima, культивированные in vitro, выявлено, что низкие и средние концентрации NaCl не стимулируют прирост биомассы, а высокие концентрации снижают биомассу и рост растений. Показано увеличение содержания фенольных соединений у G. maritima при увеличении засоления. В случае S. marina наблюдалось снижение содержания фенольных соединений при добавлении в питательную среду NaCl. Изменение антиоксидантной активности при разных уровнях солености также было видоспецифичным. Максимальные значения антиоксидантной активности экстрактов G. maritima наблюдались при средних концентрациях NaCl (50–300 мМ), а для экстрактов S. marina максимальные значения были получены либо в контроле, либо при максимальной концентрации NaCl 500 мМ. Предполагается наличие дифференциальных механизмов солеустойчивости у изученных видов. Полученные результаты можно использовать в дальнейшем при культивировании этих растений in vitro с целью индукции в них биосинтеза фенольных соединений.