КАРТОЧКА ПРОЕКТА ФУНДАМЕНТАЛЬНЫХ И ПОИСКОВЫХ НАУЧНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ,
ПОДДЕРЖАННОГО РОССИЙСКИМ НАУЧНЫМ ФОНДОМ

Информация подготовлена на основании данных из Информационно-аналитической системы РНФ, содержательная часть представлена в авторской редакции. Все права принадлежат авторам, использование или перепечатка материалов допустима только с предварительного согласия авторов.

 

ОБЩИЕ СВЕДЕНИЯ

Номер 21-73-20158

НазваниеРазработка красителей для флуоресцентных методов диагностики in vitro и in vivo

РуководительФедорова Ольга Анатольевна, Доктор химических наук

Организация финансирования, регион федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт элементоорганических соединений им. А.Н.Несмеянова Российской академии наук, г Москва

Период выполнения при поддержке РНФ 2021 г. - 2024 г. 

Конкурс№51 - Конкурс 2021 года по мероприятию «Проведение исследований на базе существующей научной инфраструктуры мирового уровня» Президентской программы исследовательских проектов, реализуемых ведущими учеными, в том числе молодыми учеными.

Объект инфраструктуры Центр коллективного пользования «Медицинские и биотехнологические нанотехнологии».

Область знания, основной код классификатора 03 - Химия и науки о материалах, 03-101 - Синтез, строение и реакционная способность органических соединений

Ключевые словасинтез, краситель, оптическая спектроскопия, фотохимия, флуоресцентная визуализация, флуоресцентные зонды, ДНК, тераностика, супрамолекулярные ассоциааты с нуклеиновыми кислотами

Код ГРНТИ31.21.27 31.15.29

 

ИНФОРМАЦИЯ ИЗ ЗАЯВКИ

Аннотация
В последние годы предпринимаются активные попытки создания неинвазивных оптических методов диагностики злокачественных опухолей, вирусных, инфекционных заболеваний, а также проводятся биологические исследования поведения нуклеиновых кислот и их взаимодействия с белковыми молекулами с использованием современных флуоресцентных приборов. Важными компонентами во флуоресцентных методах анализа играют флуоресцентные красители. Среди наиболее популярных и хорошо разработанных красителей можно выделить цианиновые и кумариновые производные. Быстрый прогресс флуоресцентных методов исследования и диагностики заболеваний, а также появление новых флуоресцентных приборов, применяемых в биологии и медицине, требует расширения круга флуоресцентных реагентов. В настоящем проекте предполагается цикл работ, который включает разработку синтеза библиотеки флуорофоров на основе моно- и бисстириловых красителей, производных нафталимидов, конъюгатов флуорофоров с бензилгуанином, нуклеозидом, а также с производными бактериохлорина (препарата для ФДТ) и фотоуправляемым агентом, цитотоксичным по отношению к раковым клеткам. Предложенные в проекте структуры флуорофоров должны обеспечить такие характеристики, как интенсивное поглощение в видимой области и высокая флуоресценция в области 600-900 нм в составе биологического объекта, высокая фотостабильность. Флуорофоры должны содержать подходящие для конъюгации функциональные группы. Будут проведены спектрофотометрические исследования полученных флуорофоров и проанализировано влияние структуры на проявляемые фотофизические свойства. Важным этапом исследования будет изучение флуорофоров в клетках. Эти исследования помогут определить флуорофоры с нужными характеристиками в клеточной среде, а также покажут, где локализуются красители. В случае конъюгатов флуорофоров с биологически активными соединениями, клеточные исследования позволят выявить, являются ли полученные конъюгаты тераностиками, проявляющие свойства как терапевтических, так и диагностических агентов. На заключительной стадии исследований наиболее перспективные соединения и конъюгаты будут протестированы in vivo. В экспериментах будет проанализировано накопление соединений в различных органах мышей, противораковая активность соединений, возможность флуоресцентной диагностики накопления соединений в раковых клетках с использованием флуоресцентных терапевтических агентов. Запланированные исследования носят междисциплинарный характер и включают широкий круг методов таких как оптическую, одномерную и двумерную ЯМР-, КД-спектроскопию, рентгеноструктурный анализ, масс-спектрометрию, квантово-химические расчеты. В состав исполнителей включены химики-синтетики, специалисты в области физико-химических исследований, биолог из ФГБУ «НМИЦ ПН им. В. П. Сербского» и медик из Московского научно-исследовательского онкологического института имени П.А. Герцена. Все это позволит надеяться на успешное выполнение проекта. Запланированные in vitro эксперименты в Центре коллективного пользования «Медицинские и биотехнологические нанотехнологии» Российскиого национального исследовательского медицинского университета имени Н.И. Пирогова позволят установить возможность генерации противораковой компоненты непосредственно в клетке, локализацию исходных стириловых соединений и их фотопродуктов в клетке, а также доказать образование комплексов ДНК-флуорофор.

Ожидаемые результаты
В проекте предполагается получение следующих значимых результатов: 1) Разработка библиотеки флуоресцентных красителей на основе моно- и бисстириовых производных и нафталимидов. Вариация структуры и состава флуоресцентных соединений позволит выявить зависимость структура – флуоресцентные характеристики и определить наиболее перспективные структуры для дальнейшего использования в синтезе флуоресцентных реагентов для мечения полипептидов или олигонуклеотидов, или для получения конъюгатов с терапевтическими агентами. Среди разработанных стириловых производных предполагается проведение исследований их взаимодействия с нуклеиновыми кислотами, которые позволят выявить соединения с высокой аффиностью к двухцепочечной ДНК или РНК, а также обнаружить соединения, способные к селективному взаимодействию с определенными парами оснований в составе нуклеиновых кислот. 2) Будут получены конъюгаты флуорофоров с бензилгуанином и нуклеозидом, в последнем введение флуорофора будет проведено как в углеводную часть, так и в состав азагетероцикла. Будет проведен анализ поведения красителей в биологических жидкостях (например, раствор альбумина) и в клетках. Такие исследования позволяют прояснить поведение соединений в биологических объектах: как изменяются оптические характеристики молекул, происходит ли внедрение молекул в белковые структуры, способны ли молекулы к мембранному переносу, где локализуется краситель в клетках. 3) Будут получены конъюгаты с бактериохлоринами, проявляющими высокую противораковую активность в ФДТ. Варьирование способа объединения двух функциональных фрагментов позволит получить тераностики, проявляющие способность как к флуоресцентной навигации, так и сохраняющие высокую противораковую активность. Свойства полученных препаратов будут подтверждены экспериментами in vitro и in vivo. 4) Будут получены конъюгаты флуорофоров с азагетроциклическими соединениями, обладающими цитотокическими свойствами по отношению к раковым клеткам. Для данного вида конъюгатов будет проанализировано их воздействие на молекулы двуцепочечной ДНК, изучена противораковая активность в in vitro и in vivo эксперимента. Будет предложен механизм цитотоксического действия препаратов. Проведенный запланированный цикл исследований позволит предложить новый флуорофоры, которые будут отличаться фотостабильностью, доступностью, более низкой себестоимостью для использования в различных методах анализа с использованием флуоресцентной спектроскопии.

 

ОТЧЁТНЫЕ МАТЕРИАЛЫ

Аннотация результатов, полученных в 2021 году
Настоящий проект направлен на создание библиотеки новых флуоресцентных красителей на основе стириловых производных, гетарилфенилэтенов и нафталимидов, использование их для получения реагентов для SNAP-меток и олигонуклеотидных маркеров, а также тераностиков на основе конъюгатов красителей с терапевтическими агентами. Получение такого широкого круга производных, детальный анализ их характеристик в водных растворах и биологических объектах позволит выявить потенциал новых флуорофоров для диагностических применений in vitro и in vivo. В первый год выполнения проекта был разработана серия моностириловых красителей, исследованы их флуоресцентные характеристики в водных растворах и в биологической среде. На основе полученных результатов были выделены красители, которые имеют высокое сродство к ДНК, демонстрируют многократное разгорание флуоресценции в биологической среде и, таким образом, могут служить биологическими зондами. Также были синтезированы моностириловые красители, на основе которых получены конъюгаты с бензилгуанином (SNAP-метки). С использованием фотохимической трансформации наработаны производные бензотиазолохинолиния из производных 2-стирилбензотиазола. Показано, что соединения способны к прочному связыванию с ДНК и в зависимости от структуры демонстрируют селективную цитотоксичность к определенным типам раковых клеток. Получены конъюгаты нафталимидных красителей с бактериохлорином, отличающиеся типом и размером соединяющего хромофорные фрагменты спейсером. Исследования in vitro и in vivo показали, что конъюгат, в которых флуоресцентный фрагмент нафталимида и фрагмент фотосенсибилизатора на основе бактериохлорина связаны через триазольный гетероцикл, являются тераностиками, которые можно использовать как диагностические флуоресцентные препараты, а также как терапевтические средства, активность которых находится на уровне применяемых в медицине фотосенсибилизаторов. Все проведенные in vitro и in vivo исследования были выполнены на оборудовании Центра коллективного пользования «Медицинские и биотехнологические нанотехнологии» Российского национального исследовательского медицинского университета имени Н.И. Пирогова.

 

Публикации

1. Морозова Н. Б., Павлова М. А., Плетинская А. Д., Панкратов А. А., Эфендиев К. Т., Семкина А. С., Притьмов А. Д., Миронов А. Ф., Панченко П. А., Федорова О. А. Photodiagnosis and photodynamic effects of bacteriochlorin-naphthalimide conjugates on tumor cells and mouse model Photochemistry Photobiology, B: Biology, v.223 , p.112294 (год публикации - 2021) https://doi.org/10.1016/j.jphotobiol.2021.112294

2. Сайфутярова А. Э., Федоров Ю. В., Цветков В. Б., Рустамова Д. А., Гулакова Е. Н., Чмелюк Н. С., Абакумов М. А., Федорова О. А. Photochemical synthesis, intercalation with DNA and antitumor evaluation in vitro of benzo[d]thiazolo[3,2-a]quinolin-10-ium derivatives Bioorganic chemistry, v. 115, p.105267 (год публикации - 2021) https://doi.org/10.1016/j.bioorg.2021.105267

Аннотация результатов, полученных в 2022 году
Флуоресцентная диагностика (ФД) является неинвазивным методом исследования человека, этот метод доступен по стоимости, он позволяет определять не травмируя объект исследования, получить о нем необходимую достоверную информацию. Важными компонентами во флуоресцентных методах анализа являются применяемые флуоресцентные красители. Cтремительное развитие методов и техники проведения анализов, расширение медицинских и биологических задач требует постоянного пополнения круга таких флуорофоров. В настоящем проекте проводятся работы, направленные на создание библиотеки новых флуоресцентных красителей на основе стириловых производных и нафталимидов, использование их в качестве зондов на ДНК, клеточных компонент, а также для создания тераностиков на основе конъюгатов красителей с терапевтическими агентами. На данном этапе проекта исследования проводились по трем основным направлениям: 1) синтез и исследование стириловых красителей для окрашивания компонентов клеток и ДНК, 2) синтез и исследование гетарилфенилэтенов, способных под действием света генерировать интеркаляторы ДНК; 3) синтез и исследования нафталимидных красителей в качестве флуоресцентных диагностиков в составе ФДТ препаратов. В результате проведенных исследований были получены стириловые красители, демонстрирующие селективное связывание с митохондриями клетки. Также показано, что синтезированные стириловые красители образуют прочные комплексы с ДНК, показывая различные модели взаимодействия в зависимости от структуры гетероциклического фрагмента красителя. Были предложены подходы к синтезу новых 2-стирилбензотиазолов, содержащих заместители при двойной С=С связи. Показано, что при облучении такие соединения претерпевают внутримолекулярную циклизацию с образование поликондесированных производных, способных к внедрению в состав ДНК через интеркаляцию. Можно ожидать, что благодаря такому механизму взаимодействия с нуклеиновыми кислотами, синтезированные соединения продемонстрируют цитотоксические свойства в экспериментах с клетками, а введенные при С=С связи заместители будут усиливать цитотоксический эффект. При разработке тераностиков для ФДТ важной проблемой является обмен энергией между фотоактивными компонентами тераностика – фотосенсибилизатора и флуорофора. Для преодоления проблемы нами предложен синтез конъюгатов нафталимида с бактериопурпурином и дисульфидным спейсером между компонентами. При попадании в клетку происходит гидролиз дисульфидного связывающего мостика, высвобождение компонент и их независимое функционирование. Исследование в растворах и в клетках подтвердили предполагаемые свойства синтезированного конъюгата.

 

Публикации

1. М.А. Павлова, П.А. Панченко, Е.А. Алехина, А.А. Игнатова, А.Д. Плютинская, А.А. Панкратов, Д.А. Притьмов, М.А. Грин, А.В. Феофанов, О.А. Федорова A New Glutathione-Cleavable Theranostic for Photodynamic Therapy Based on Bacteriochlorin e and Styrylnaphthalimide Derivatives Biosensors, 12, 12, 1149 (год публикации - 2022) https://doi.org/10.3390/bios12121149

2. Устимова М.А., Федоров Ю.В., Чмелюк Н.С., Абакумов М.А., Федорова О.А. Fluorescence turn-on probes for intracellular DNA/RNA distribution based on asymmetric bis(styryl) dyes Spectrochimica Acta - Part A: Molecular and Biomolecular Spectroscopy, V. 279, 121446 (год публикации - 2022) https://doi.org/10.1016/j.saa.2022.121446

Аннотация результатов, полученных в 2023 году
Флуоресценция нашла широкое применение в различных прикладных биологических и биомедицинских исследованиях, Особенно важны флуоресцентные реагенты в молекулярной и клеточной биологии. Настоящий проект направлен на создание библиотеки новых флуоресцентных красителей на основе стириловых производных, гетарилфенилэтенов и нафталимидов, использование их для получения реагентов для анализа ДНК, клеточных компонент, а также для получения тераностиков на основе конъюгатов красителей с терапевтическими агентами. Получение такого широкого круга производных, детальный анализ их характеристик в водных растворах и биологических объектах позволит выявить потенциал новых флуорофоров для диагностических применений. На этапе 2023 года в проекте разработаны новые стириловые красители на основе N-сульфопропилбензотиазолия, бис(гетарилфенилэтенов) на основе хинолина, а также конъюгат (BChl-NI), в составе которого флуорофор на основе 1,8-нафталимида и фотосенсибилизатор бактериохлорин. Показано, что синтезированные красители демонстрируют разгорание флуоресценции в составе ДНК, а также окрашивают в клетках митохондрии. Митохондриальные красители являются важным классом реагентов, используемым для наблюдения за состоянием митохондрий, связанных с протеканием ряда важных жизненных процессов. Показано, что синтезированные бис(гетарилфенилэтены) на основе хинолина в присутствии ДНК способны при облучении светом претерпевать фотохимическую реакцию с образованием бис(гетероароматических катионов), внедряться в тело ДНК, вызывая его разрушение. Таким образом, синтезированное соединение является фотоуправляемым реагентом для разрушения ДНК.

 

Публикации

1. Ефимова А.С., Устимова М.А., Чмелюк Н.С., Абакумов М.А., Федоров Ю.В., Федорова О.А. Specific Fluorescent Probes for Imaging DNA in Cell-Free Solution and in Mitochondria in Living Cells Biosensors, Vol. 13 (7), p. 734 (год публикации - 2023) https://doi.org/10.3390/bios13070734

2. Суйфутярова А.Э., Гулакова Е.Н., Федоров Ю.В., Федорова О.А. A novel bis(intercalating) agent for DNA based on the bis(benzoquinolizinium) derivative Russian Chemical Bulletin, Vol. 72, No. 7, pp. 1701—1710 (год публикации - 2023) https://doi.org/10.1007/s11172-023-3950-7

3. Ефимова А.С., Устимова М.А., Фёдорова О.А. Флуоресцентные зонды для визуализации ДНК в бесклеточном растворе и в митохондриях живых клеток Международная конференция по химии «Байкальские чтения-2023», посвященная 65-летию Иркутского института химии им. А.Е. Фаворского СО РАН и 85-летию академика Бориса Александровича Трофимова: Сборник тезисов докладов, с. 169 (год публикации - 2023)

4. Ефимова А.С., Устимова М.А., Фёдорова О.А. Пиридин- содержащие стильбены для ковалентного и нековалентного мечения биомолекул ХХVI Всероссийская конференция молодых учёных-химиков (с международным участием): тезисы докладов (Нижний Новгород, 18–20 апреля 2023 г.), с.49 (год публикации - 2023)

5. Павлова М.А, Панченко П.А., Притьмов Д.А., Грин М.А., Федорова О.А. Тераностики для фотодинамической терапии на основе конъюгатов бактериохлорина и нафталимида Международная конференция по химии «Байкальские чтения-2023», посвященная 65-летию Иркутского института химии им. А.Е. Фаворского СО РАН и 85-летию академика Бориса Александровича Трофимова: Сборник тезисов докладов, с. 187 (год публикации - 2023)

6. Перевозчикова П.С., Черникова Е.Ю., Федоров Ю.В., Федорова O.A. Супрамолекулярные ансамбли бисхромофорных конъюгатов с ДНК и кукурбит[7]урилом Сборник тезисов пленарных, ключевых, приглашенных, устных и стендовых докладов, представленных на Всероссийской конференции с международным участием «Идеи и наследие А.Е. Фаворского в органической химии», c. 204 (год публикации - 2023)

7. Перевозчикова П.С., Черникова Е.Ю., Федоров Ю.В., Федорова О.А. DNA-based assemblies with bischromophoric styryl dye-chromene conjugates and cucurbit[7]uril Book of abstracts «New Emerging Trends in Chemistry» Conference (NewTrendsChem-2023), c. 266 (год публикации - 2023)