Аннотация результатов, полученных в 2021 году
Проведена оценка влияния ультразвукового (УЗ) воздействия в процессе микродугового оксидирования (МДО) на формирование 3D-пористых кальций-фосфатных (CaP) покрытий на титановых пластинах. Подобраны оптимальные параметры процесса МДО с наведенным УЗ полем, позволяющие получать CaP покрытия с наилучшим комплексом свойств, а именно: комбинация высоких показателей внутренней (39 %) и внешней (28 %) пористости, толщина покрытия 50-55 мкм, шероховатость поверхности по Ra 3,0-4,0 мкм, атомное соотношение Ca/P ~ 0,3. Показано, что сформированные гибридные МДО покрытия характеризуются аморфно-кристаллической структурой с содержанием кристаллических фаз CaHPO4 (монетит) и β-Ca2P2O7. Формирование в покрытии монетита представляет высокий интерес благодаря его химическому сходству с костным матриксом, большой удельной площади поверхности, а также высоким остеоиндуктивным свойствам. Проведены исследования по взаимодействию разработанных гибридных CaP покрытий с лекарственными препаратами различного спектра действия (антибактериальный препарат – ванкомицин, противоопухолевый препарат – 5-фторуроцил, противовирусный препарат с противоопухолевым действием – интерферон-альфа). Установлено, что импрегнация покрытий выбранными лекарственными средствами не приводит к изменению морфологии, топографии поверхности, внутренней структуры, элементного и фазового состава. Методом ИК спектроскопии показано, что CaP покрытия после импрегнации лекарственными средствами содержат в своем составе функциональные группы характерные для ванкомицина и 5-фторурацила, что свидетельствует об адсорбции лекарств. Методом спектрофотометрии были изучены кинетические особенности выделения ванкомицина и 5-фторурацила с поверхности гибридных CaP покрытий, которые показали, что лекарства практически полностью высвобождались в изотонический раствор (0,9 мас.% NaCl) в течение 6 ч с характерным «взрывным» высвобождением в первые 10 мин выдержки (75 %). В случае с интерфероном, методом иммуноферментного анализа была установлена сложная «волнообразная» динамика его выхода из CaP покрытий с максимальным высвобождением после 1 и 12 ч выдержки. Полученную сложную динамику выхода интерферона мы связываем со сменой процессов десорбции с поверхности образцов и обратного осаждения (преципитации) биологических молекул из раствора на CaP покрытие. Была разработана и оптимизирована технология «dip-coating» на примере полимеризации титановых образцов с гибридными CaP покрытиями в растворах сополимера молочной и гликолевой кислот (PLGA 50/50), которая позволила получать на поверхности CaP покрытий однородный слой полимера с сохранением порового пространства, как на поверхности, так и в объеме покрытий. Данная технология была применена в последующем для импрегнации покрытий лекарственными препаратами с целью постепенного и пролонгированного выделения лекарств в процессе деградации матриц-носителей. Установлено, что в зависимости от типа лекарственного препарата и формы, в которой он находится, может быть реализовано два оптимальных подхода для импрегнации матриц-носителей: 1) технология «dip-coating», основанная на окунании образца в 5 % раствор PLGA, содержащий лекарственное средство (ванкомицин или интерферон-альфа), 2) технология послойной самосборки, основанная на поочередном окунании в водный раствор лекарственного средства (ванкомицин, 5-фторурацил, интерферон-альфа) и затем в раствор PLGA. Применение предложенных подходов позволили увеличить загрузку лекарств в матрицы носители и обеспечить более продолжительное время их выделения. Для матриц-носителей, полученных методом послойной самосборки, показано, что концентрация выделившихся из них ванкомицина и 5-фторурацила в течение 6 ч превышает концентрацию этих же препаратов, выделившихся из CaP покрытий за аналогичное время, в 3,7 и 1,5 раз, соответственно. При этом максимальная скорость выделения лекарств из матриц-носителей была через 30 минут выдержки. Для ванкомицина было определено, что за 6 ч он полностью выходил из матрицы-носителя, а 5-фторурацил высвобождался в течение 48 ч. На примере ванкомицина показано, что для данного препарата более эффективной импрегнацией в матрицу-носитель является технология «dip-coating», благодаря которой обеспечивается монотонная логарифмическая динамика высвобождения лекарства в течение 7 суток. Для матриц-носителей, импрегнированных интерфероном-альфа с помощью технологии «dip-coating» и метода послойной самосборки, была установлена сложная «волнообразная» динамика высвобождения лекарства со временем, как и в случае с CaP покрытиями, но продолжительнее в 7 раз (14 суток). Согласно полученным результатам для матриц-носителей, синтезированных методом послойной самосборки, значения концентраций выделившегося цитокина интерферона были сопоставимы с таковыми для CaP покрытий и на два порядка превышали значения концентраций интерферона, выделившегося из матриц-носителей, полученных погружением «dip-coating». Таким образом, установлено, что для импрегнации 5-фторурацила в матрицу-носитель применима технология погружением «dip-coating», в то время как для импрегнации ванкомицина и интерферона-альфа – более эффективна технология послойной самосборки, обеспечивающая пролонгированный выход лекарств в течение 7-14 суток.

Аннотация результатов, полученных в 2022 году
В результате физико-механических исследований вариантов матриц-носителей, представляющих собой 3D-пористые кальций-фосфатные (CaP) покрытия на титановых (Ti) подложках, модифицированные полимерной композицией 5%,8% или 10% PLGA, определены важнейшие эксплуатационные свойства композитных систем. Установлено, что с увеличением концентрации PLGA в составе CaP покрытия механизм отрыва от подложки изменяется от адгезионно-когезионного типа до когезионного, сопровождаясь уменьшением прочности композитных слоев от 20,1 до 8,1 МПа. В то же время, нанесение пластически деформируемого полимерного слоя PLGA на CaP покрытии приводит к существенному увеличению значений всех критических напряжений сдвига при скретч-тестировании, благодаря полимеру, выступающего в качестве дефлектора трещин, образующихся при разрушении CaP покрытия. В исследованиях деформационного поведения матриц-носителей в условиях растягивающего напряжения показано, что CaP покрытие способствует увеличению предела упругости от 144,5 до 165,5 МПа и модуля Юнга от 22,1 до 26,2 ГПа, по сравнению с Ti подложкой без покрытия. Вместе с тем, в испытаниях по наноиндентированию определены твердость CaP покрытия 4,3 ± 1,0 ГПа и приведенный модуль Юнга 56,9 ± 9,5 ГПа. Рассчитанный модуль упругости CaP покрытия значительно ниже, чем у чистого Ti (120 ГПа), и более приближен к таковому костной ткани, что позволит избежать экранирования напряжений в прилегающей костной ткани и улучшит биомеханическую совместимость всего композита с костной тканью. В результате электрохимических и гравиметрических исследований установлено, что матрицы-носители, импрегнированные лекарственными средствами и защищенные слоем PLGA, являются стабильными в растворе 0,9% NaCl и фосфатно-солевом буфере, что подтверждается относительной потерей массы 0,8% и 1,7%, соответственно. Впервые в проекте показано, что для надежной защиты от протекания коррозионных процессов в пористых CaP покрытиях на поверхности Ti возможно формирование тонкого однородного полимерного слоя 5% PLGA, обеспечивающего сохранение открытой пористости покрытия и вместе с тем высокую коррозионную стойкость (Icorr = 0.6–3.8 нА/см2, Rcorr = 20,7–37,8 МОм*см2). C другой стороны, чтобы пролонгировать выход лекарственного средства необходима его абсолютная инкапсуляция и возможное запечатывание порового пространства, что достигается путем полимеризации носителей 8 или 10% PLGA, для которых характерна абсолютная коррозионная стойкость благодаря двойному диэлектрическому слою CaP и PLGA (Icorr = 0.1–1.1 нА/см2, Rcorr = 17,8–91,1 МОм*см2). Тем самым, показано, что инкапсуляция матрицы-носителя сополимером PLGA является эффективным средством управления скоростью биокоррозии и биодеградации. В биологических экспериментах in vitro изучено влияние импрегнации разработанных вариантов матриц-носителей различными лекарственными препаратами (антибиотик ванкомицин, цитокин интерферон-альфа или противоопухолевый цитостатик 5-фторурацил) на антимикробную активность и цитотоксичность. На примере микробного штамма золотистого стафилококка, устойчивого к бета-лактамным антибиотикам, показано, что импрегнация ванкомицином обеспечивает 100 % антибактериальную эффективность CaP покрытий в течение 24 ч инкубирования бактерий на их поверхности. Дополнительная обработка покрытий ванкомицином в комбинации с биорезорбируемым сополимером PLGA приводит к постепенному выделению антибиотика, обеспечивая кумулятивный антибактериальный эффект в течение 7 суток. В отношении нормальных и опухолевых клеток линий 3Т3, HeLa и MCF-7, CaP покрытия, в том числе импрегнированные интерфероном и ванкомицином, а также покрытые полимером PLGA, не оказывают цитотоксического действия как при непосредственном инкубировании клеток на их поверхности, так и при инкубировании с их экстрактами (продуктами деградации). Замечено снижение количества жизнеспособных клеток линии 3Т3 на поверхности матриц-носителей системы PLGA/CaP, что может быть связано со слабой адгезией клеток к полимеру. Импрегнация CaP носителей цитостатиком 5-фторурацилом приводит к подавлению жизнедеятельности всех исследуемых клеточных линий, в то время как дополнительная обработка полимером предотвращает «взрывное» выделение препарата из матриц-носителей и обеспечивает его пролонгированное выделение в течение 24 ч. Впервые с применением in situ визуализации методами оптической микроскопии и лазерной интерференционной микроскопии (ЛИМ) изучено in vitro поведение живых раковых клеток MCF-7 в динамике 24-72 ч сокультивирования c разработанными носителями противоопухолевого препарата 5-фторурацила. Методом ЛИМ, особенностью которого является неинвазивный характер измерений и отсутствие разнообразных методов клеточной фиксации и окраски, часто дающих артефакты и требующие своей дополнительной расшифровки, позволил in situ качественно и количественно оценить основные 3D-морфометрические показатели живых клеток. В проекте установлено, что импрегнация CaP покрытия цитостатиком 5-фторурацилом привела к in vitro гибели опухолевых клеток через 24 ч путем апоптоза и некроза. Данный метод является уникальным инструментом в динамике in vitro изучения влияния лекарственных препаратов на состояние опухолевых клеток и может быть использован для скрининга клеточного отклика на различные биоматериалы. 1. Prosolov K.A., Komarova E.G., Kazantseva E.A., Lozhkomoev A.S., Kazantsev S.O., Bakina O.V., Mishina M.V., Zima A.P., Krivoshchekov S.V., Khlusov I.A., Sharkeev Y.P. UMAOH calcium phosphate coatings designed for drug delivery: Vancomycin, 5-fluorouracil, interferon α-2b case. Materials 15 (2022) 4643, https://doi.org/10.3390/ma15134643. 2. Хлусов И.А., Порохова Е.Д., Комарова Е.Г., Казанцева Е.А., Шаркеев Ю.П., Юрова К.А., Литвинова Л.С. Скаффолды-носители лекарственных средств и биологических молекул для биоинженерии костной ткани. Цитология 64 (2022) 183-207, https://doi.org/10.31857/S0041377122030051. 3. Komarova E.G., Kazantseva E.A., Prosolov K., Kazantsev S.O., Lozhkomoev A.S. Structure, Morphology and Composition of Composite PLGA/CaP/Ti Scaffolds for Drug Delivery. AIP Conf. Proc. (2023), в печати. 4. Лечебные покрытия для костных имплантатов https://www.kommersant.ru/doc/5502314. 5. Новые покрытия могут сделать костные имплантаты иммуномодулирующими, антибактериальными или противораковыми https://rscf.ru/news/release/novye-pokrytiya-mogut-sdelat-kostnye-implantaty-immunomoduliruyushchimi-antibakterialnymi-ili-protiv/#. 6. Томские ученые создали многофункциональные покрытия костных имплантатов https://rossaprimavera.ru/news/0049a25b. 7. Победа исполнителя проекта Казанцевой Е.А. в конкурсе Science Slam ТГУ (г. Томск) с докладом «Зачем имплантату нужен костюмчик?», https://vk.com/3scienceslamtsu. 8. Победа исполнителя проекта Казанцевой Е.А. в конкурсе Science Slam Томск с докладом «И швец, и жнец, и на дуде игрец: многофункциональные покрытия для имплантатов», https://vk.com/scienceslamtomsk?w=wall-70416520_2472. 9. Победительница Казанцева Е.А. Science Slam ТГУ выступила на университетском слэме в НГТУ https://depvpo.tomsk.gov.ru/news/front/view?id=107908.

Аннотация результатов, полученных в 2023 году
Выполнено исследование in situ поведения мезенхимных стволовых клеток (МСК) при репаративной регенерации костной ткани в ответ на имплантацию в мышах матриц-носителей лекарственных средств с использованием теста эктопического костеобразования in vivo. В кальций-фосфатных (CaP) носителях без лекарств de novo формирование в составе тканевых пластинок костной ткани с лакунами, заполненными костным мозгом, отмечалось в 100 % случаев. Введение в состав CaP покрытия сополимера полилактидгликолида (PLGA) с концентрациями 5, 8, 10 мас.% не снижало долю случаев и площади роста кости и костного мозга. Напротив, образцы CaP/PLGA 10% вызвали двукратный прирост площади кости, по сравнению с CaP покрытием. Введение в состав носителей иммуномодулятора интерферона-альфа (IFN) уменьшало долю формирования кости с красным костным мозгом в составе тканевых пластинок. Однако с увеличением концентрации PLGA в составе носителей с интерфероном подобный отрицательный эффект не был обнаружен. Такая же закономерность наблюдалась и в случае с импрегнацией в носитель антибиотика ванкомицина (VMN), который снижал частоту формирования в тканевых пластинках костной ткани, заполненной красным костным мозгом. Исключением являлись образцы с максимальной концентрацией полимера, показавшие 100% рост как кости, так и костного мозга в составе тканевых пластинок. Снижение выхода тканевых пластинок может быть закономерным процессом выделения фармпрепаратов из носителей, которые способны тормозить регенерацию/ремоделирование кости. А увеличение концентрации PLGA в составе носителей уменьшало или нивелировало ингибирующий эффект от фармпрепаратов на дифференцировку МСК за счет пролонгированного постепенного выхода в среду организма. Исследована эффективность стерилизации вариантов матриц-носителей лекарственных средств с применением электронно-лучевой обработки (ЭЛО) при дозах облучения 10 – 30 кГр по двум способам: мягкий режим с многократным проходом образцов для постепенного набора дозы, исключающим термический нагрев образцов; жесткий режим (конвейерный) с единоразовым облучением, предусматривающий возможный термический нагрев. Изучено влияние выбранных режимов ЭЛО на химические и структурные изменения органических компонентов в составе вариантов матриц-носителей. Установлено, что интенсивное ионизирующее радиационное излучение приводит к умеренному крекингу PLGA, выражающееся в снижении молекулярной массы в 1,3 – 1,5 раза, что может быть обусловлено большей величиной сшивки, вследствие нагрева титановой подложки, по сравнению с чистым PLGA. Показано, что в результате стерилизации с помощью ЭЛО дозами до 30 кГр фармпрепараты ванкомицин и 5-фторурацил (5FU) как в чистом виде, так и в составе образцов, деградируют путем окисления. При этом степень деградации препаратов после ЭЛО сопоставима с таковой для чистых фармпрепаратов, а также в составе носителей, не подвергавшихся стерилизации с помощью ЭЛО. Экспериментально доказано, что использование ЭЛО с дозами облучения 10 – 30 кГр по двум способам подходит для проведения стерилизации образцов выбранных составов. ЭЛО с выбранными режимами обеспечила высокую стерильность всех образцов матриц-носителей лекарственных средств, при этом стерильность образцов после ЭЛО сохранилась в течение 6 месяцев. Определены характеристики смачиваемости (краевые углы) и свободная поверхностная энергия (СПЭ) вариантов матриц-носителей, которые влияют на способность поверхности биоматериалов поглощать белки и последующую адгезию к окружающим тканям организма. Установлено, что в случае импрегнации СаР покрытий фармпрепаратами их смачиваемость увеличивалась за счет уменьшения краевых углов смачивания водой и глицерином. При этом все CaP покрытия с/без препаратами являлись высоко гидрофильными, характеризуясь СПЭ более 68 мН/м с преобладанием полярной компоненты, что указывает на наличие открытых полярных групп на их поверхности. CaP покрытие с интерфероном являлось супергидрофильным, характеризуясь очень высокой СПЭ = 173,6 мН/м с преобладающим вкладом полярной компоненты. Модификация носителей лекарственных средств полимером PLGA привела к ухудшению характеристик смачиваемости за счет увеличения краевых углов смачивания до 90 º (гидрофобный материал). Это привело к снижению СПЭ в интервале 11,5 – 50,7 мН/м и перераспределению вклада полярной и дисперсионной компонент – основной вклад в СПЭ стала вносить дисперсионная компонента. Введение в носители 5-фторурацила с последующей инкапсуляцией PLGA практически не повлияло на краевые углы смачивания, тогда как введение в образцы ванкомицина и интерферона привело к снижению краевых углов смачивания, по сравнению с образцами CaP/PLGA без лекарств. При этом в образце CaP/IFN/PLGA с интерфероном сохранился определяющий вклад полярной компоненты в СПЭ, указывая на сильное влияние открытых полярных связей интерферона на поверхности носителей на характеристики смачиваемости. В результате выполнения проекта разработана эффективная многоэтапная технология получения многофункциональных покрытий-носителей лекарственных средств на костных титановых имплантатах. На первом этапе предложен новый подход к нанесению покрытий-носителей лекарств на основе аморфных фосфатов кальция на поверхности титановых образцов. Отличительной особенностью технологии является дополнительное введение ультразвукового поля в процессе микродугового оксидирования, ставшего традиционным методом для нанесения биопокрытий. В ходе протекающих электрохимических реакций и в результате акустических кавитаций под действием ультразвука на поверхности титана формируются довольно толстые и прочные покрытия с иерархической 3D-поровой структурой. Далее созданные биоактивные покрытия с системой взаимосвязанных пор были проверены в качестве систем доставки лекарственных средств путем загрузки в них по отдельности трех препаратов: цитостатик 5-фторурацил, антибиотик ванкомицин и иммуномодулятор интерферон. Затем образцы с лекарствами погружали в растворы биоразлагаемого сополимера PLGA с разными концентрациями — 5, 8 и 10 мас.%. В результате на поверхности покрытия сформировалась дополнительная полимерная пленка. CaP покрытие, которое обработали 5 мас.% раствором сополимера, имело однородную пористую структуру, тогда как в покрытии с высоким содержанием сополимера (8–10 мас.%) можно было выделить два слоя: нижний — пористый, и верхний — плотный, в котором полимер заполнил часть пор. Такое «уплотнение» структуры привело к тому, что сопротивление материала к износу увеличилось до 3 раз, а устойчивость к коррозии — на 2 порядка. В результате, введение в CaP покрытие лекарственного средства и «запечатывание» его сверху саморазлагающимся сополимером позволило добиться того, что препарат пролонгировано небольшими порциями выделялся в окружающую физиологическую среду вплоть до 14 дней, оказывая тем самым постепенное терапевтическое действие. Упоминания в СМИ: 1. Биоактивный полимер улучшил свойства костных имплантатов и позволил управлять скоростью высвобождения лекарств, https://rscf.ru/news/release/bioaktivnyy-polimer-uluchshil-svoystva-kostnykh-implantatov-i-pozvolil-upravlyat-skorostyu-vysvobozh/?ysclid=lv40pynvs2917378975. 2. Создано биоразлагаемое защитное покрытие для титановых имплантатов, https://nauka.tass.ru/nauka/20572527?ysclid=lv40rgmz4z923032910 3. Новый полимер для костных имплантатов с содержанием лекарств ускорит восстановление, https://scientificrussia.ru/articles/novyj-polimer-dla-kostnyh-implantatov-s-soderzaniem-lekarstv-uskorit-vosstanovlenie. 4. Биосовместимый полимер улучшил механические свойства костных имплантатов и позволил управлять скоростью высвобождения лекарств, https://indicator.ru/chemistry-and-materials/biosovmestimyi-polimer-uluchshil-mekhanicheskie-svoistva-kostnykh-implantatov-i-pozvolil-upravlyat-skorostyu-vysvobozhdeniya-lekarstv-17-04-2024.htm 5. Телеканал Россия 1. Вести. Томск. Ученые разрабатывают покрытия, способные улучшить прочность металлических имплантатов, https://smotrim.ru/video/2799892 6. Телеканал Россия 1. Вести. Томск. Воскресенье, https://smotrim.ru/brand/67903