Аннотация результатов, полученных в 2021 году
В рамках проекта была изучена возможность производства микропузырьки (МП) с гибридной «белок-сополимер» оболочкой для получения перспективных функциональных агентов для задач репродуктивной медицины. В то время, как известные в практике МП уже используются в клинической практике при ультразвуковых (УЗ) исследованиях, каждый используемый материал обладает своими недостатками, в то время как «гибридная» оболочка может позволить сочетать достоинства каждого материала в одном объекте, снижая влияние недостатков каждого из материалов. Так, были разработаны новые материалы на основе биосовместимого сополимера и белка для формирования микропузырьков и показана их потенциальная применимость в качестве контрастных агентов для диагностики. BSA был введен в структуру оболочки белка аналогично композиции МП используемых в клиниках, а биосовместимый сополимер P(VP-AA) с молекулярной массой 18 кДа использовался в качестве подходящего афмифильного полимера. По данным кислотно-основного титрования мольная доля остатков акриловой кислоты в цепи определена как 9,7 мол.%. Сшитый сополимер винилпирролидона и акриловой кислоты также является новым материалом, разработанным специально для решения поставленной задачи, но может иметь более широкое применение в качестве амфифильного сополимера для задач биомедицины. Введение акриловой кислоты в структуру сополимера позволило получить электростатический комплекс между BSA и P(VP-AA) для дальнейшего формирования МП (что невозможно получить с немодифицированным PVP). Было показано, что даже включение небольшого количества полимера в структуру гибридной «белок-сополимер» оболочки BSA@P(VP-AA) МП может значительно повысить акустическую устойчивость полученных МП по сравнению с белковой оболочкой МП. Проверка концепции показала, что полученный комплекс позволил улучшить такие свойства МП, как концентрация (на два порядка, до 10^10 МП/мл), средний размер (до 5 мкм), толщина оболочки (до 50 нм), что приводит к более высокому выходу МП с большим диаметром и более толстой оболочкой. Увеличение среднего размера продемонстрировало увеличение контраста при УЗ-исследованиях. Улучшенные свойства оболочки позволили нам достичь улучшенной акустической стабильности (7 минут для МП с гибридной оболочкой по сравнению с 2 минутами для белковых МП). МТТ-тест цитотоксичности дополнительно продемонстрировал биосовместимость полученных агентов. Таким образом, был получен прототип эффективного современного не имеющего в России аналогов контрастного агента для УЗИ диагностики на основе амфифильных сополимеров. В дополнение к планируемым исследованиям, нами был разработан уникальный метод рамановской спектроскопии в волокне, позволивший успешно охарактеризовать полученные комплексы «белок-сополимер» и модельные объекты, по результатам работы была опубликована статья в рамках проекта (https://www.mdpi.com/2079-6374/12/1/19). Представленный нами гибридный метод анализа планируется к изучению в применении к задачам гинекологии, что будет реализовано в тесном сотрудничестве с медицинскими партнерами проекта. Выходя за рамки МП, нами были получены нанокапли с белковой оболочкой и ядром, заполненным перфторуглеродами. Жидкое плотное ядро нанокапель при комнатной температуре позволило оптимизировать методы очистки и модификации нанокапель в сравнении с МП. Данные агенты продемонстрировали стабильность и способности к функционализации. Далее нами будет продолжена работа по изучению данных типов УЗ- контрастных агентов. Таким образом, были получены перспективные образцы УЗ- контрастных агентов на основе белков и амфифильных сополимеров, сочетая достоинства материалов в одном объекте за счет «гибридной» оболочки. Дальнейшие исследования будут сосредоточены на расширении функциональности полученных агентов и апробации в решении актуальных задач диагностики женского бесплодия.

Аннотация результатов, полученных в 2022 году
В ходе работы над вторым годом проекта РНФ № 21–73–10254 «Новые функциональные агенты гибридной визуализации на основе амфифильных полимеров для задач репродуктивной медицины» была продолжена работа по масштабированию воспроизводимого синтеза микропузырьков с включением амфифильных полимеров в структуру оболочки как эхоконтрастных агентов ультразвуковой диагностики. В продолжение работы, опубликованной по результатам первого года проекта над микропузырьками с оболочкой типа «белок—сополимер», командой проекта была получена воспроизводимая библиотека микропузырьков на основе бычьего сывороточного альбумина и сополимере N-винилпирролидона и акриловой кислоты с возможностью настраиваемых физико-химических свойств (средний диаметр микропузырьков, концентрация, толщина и эластичность оболочки) и, следовательно, эхоконтрастности. Свойства гибридных микропузырьков контролируются благодаря таким параметрам исходного сополимера, как молекулярная масса и концевая группа, а также благодаря массовым соотношениям белка и сополимера, используемым для синтеза микропузырьков. Также командой проекта был адаптирован зарубежный опыт по получению микропузырьков с полимерной оболочкой на основе поли(винилового спирта) при помощи масштабируемого синтеза в объемах до 50 мл, что в дальнейшем позволить расширить спектр контролируемых свойств микропузырьков со смешанной оболочкой «белок—сополимер» и оптимизировать пути функционализации контрастных агентов с целью достижения мультимодальной визуализации. Высокие концентрации микропузырьков после синтеза позволяют комфортно работать с полученными агентами при выполнении процедур ультразвуковой диагностики. В ходе экспериментов по определению жизнеспособность клеток периферической крови человека (PBMC) в присутствии компонентов оболочки микропузырьков и самих эхоконтрастных агентов, была показана низкая цитотоксичность разрабатываемой платформы. Для дальнейшей апробации эхоконтрастных агентов in vivo, были подобраны концентрации и дозы к введению в хвостовую вену для стабильного контрастирования полученных пузырьков, а также показано in vivo контрастирование сердца крыс с моделированным инфарктом миокарда. Сохранение эхогенных свойств в течение длительного времени (более 5 минут после введения) позволяют сделать вывод о перспективах использования полученных микропузырьков для ультразвуковой диагностики органов. Однако, анатомические особенности малых лабораторных животных ограничивают наши возможности тестирования полученных контрастных агентов на органах женской репродуктивной системы. Поэтому командой проекта был разработан прототип фантома маточных труб, который может быть использован для тестирования контрастных агентов, а также обучения специалистов ультразвуковой диагностики технологии эхогистеросальпингографии (ЭхоГСГ). Прототип имеет размеры и конструкцию близкие к строению женской репродуктивной системы, а также имеет приближенные к реальным органам женской репродуктивной системы размеры и конфигурацию. Используемые материалы для заливки прототипа по плотности и скорости прохождения ультразвука соответствуют тканям маточных труб, визуализируемым с помощью УЗИ, что позволяет получать реалистичное изображение. Также актуальной проблемой работы с эхоконтрастными микропузырьками является контроль их свойств в условиях кабинета врача – а именно, концентрации и химического состава. В продолжение работы первого года проекта нами был разработан портативный сенсор 2-в-1 показателя преломления и комбинационного рассеяния в полых микроструктурированных оптических волокнах для мультикомпонентных коллоидных систем, а именно наноразмерных комплексов бычьего сывороточного альбумина и амфифильного сополимера на основе винилпирролидона и акриловой кислоты, а также соответствующих микропузырьки, заполненные воздухом. Монокомпонентные жидкие растворы белка и сополимера показали линейную зависимость показателя преломления и интенсивности характерного рамановского пика от массовой концентрации. Анализ рамановского рассеяния комплексов и их микропузырьков показал, что изменения интенсивности характерного пика сополимера могут описать взаимодействия между компонентами для образования дисперсионных систем. Анализ показателей преломления многокомпонентных дисперсионных систем демонстрировал четкую линейную зависимость от общей массовой концентрации для всех описанных комплексов, в то время как микропузырьки могут быть обнаружены при концентрациях до 4,0 * 10^8 шт/мл. Таким образом, разработанный 2-в-1 сенсор может быть использован для характеристики многокомпонентных дисперсионных систем, предназначенных для биомедицины.