Аннотация результатов, полученных в 2021 году
В результате выполнения первого этапа Проекта синтезированы и комплексно исследованы (состав, структура, свойства) рецепторные и каталитические биомиметики на основе полианилинов и гексацианоферратов переходных металлов. В качестве «синтетических рецепторов» для электрохимических сенсоров, сочетающих в себе селективность аффинных взаимодействий с операционной стабильностью, предложено использовать боронат-замещенный полианилин. Оптимизированы условия электрополимеризации проводящих рецепторных покрытий, включая электрохимический режим и состав реакционной смеси. С целью упрощения производства миметиков и дальнейшей модификации ими электродов предложен проточный электросинтез наночастиц полианалина. Установлены зависимости сопротивления замещенного и незамещенного полианилинов на поверхности гребенчатых электродных структур в зависимости от потенциала и рН. Сопротивление боронат-замещенного полианилина не превышает 1000 Ω·м до рН 9, что на 2 порядка величины ниже, чем для незамещенного полимера. Широкий диапазон рН-стабильности полимера обусловлен изменением механизма редокс-превращения эмеральдин/лейкоэмеральдин. Тогда как потенциал этого перехода не зависит от рН для незамещенного полианилина, редокс-реакция для функционализированного полимера протекает с потерей одного протона на 2 электрона, что позволяет расширить область проводимости примерно на 0.3 В при рН 7. Методом рентгеновской фотоэлектронной спектроскопии (РФЭС) исследованы химические состояния атомов азота замещенного и незамещенного полианилинов в зависимости от рН среды. По мере увеличения рН содержание аминогрупп для обоих полимеров уменьшается, а иминогрупп возрастает. Однако содержание иминовых форм в самодопированном материале существенно ниже, а высокий уровень допирования (до 15% заряженных форм) сохраняется вплоть до рН 9 за счет высокого содержания протонированного амина. Сопряженность протонного допирования с редокс-процессами подтверждена спектроэлектрохимическими исследованиями. Методом РФЭС установлено, что положение линии B1s в спектре замещенного полианилина практически не меняется в зависимости от рН, что указывает на постоянство химического потенциала и окружения атома бора во всем диапазоне рН. В противовес традиционной точке зрения о том, что в замещенном полианилине отрицательно заряженный заместитель –B(OH)3‒ способствует локализации протонов в основной цепи, такая форма отсутствует до рН 11, а основная компонента соответствует –B(OH)2(OH2), что было подтверждено методом твердотельной 11B ЯМР спектроскопии (MQMAS и MAS). Исследование полимера при различных рН также показало координацию данной формы к аминогруппе с образованием –B(OH)2(H2O)..NH< и присутствие формы, координированной анионом–B(OH)2..A―..N+H2<, в кислых средах. В соответствии с данными спектроскопии ЯМР, РФЭС, вольтамперометрии и спектроскопии импеданса, предложена универсальная схема допирования рецепторного материала. Схема включает прямую атаку протоном остатка борной кислоты в кислой среде или присоединение молекулы воды в нейтральной/щелочной среде с последующим трансфером протона на атом азота и образованием цвиттер-иона. Остаток борной кислоты выступает при этом в качестве центра диссоциации воды, обеспечивая постоянное протонирование иминных/аминных мостиков полианилина, тем самым расширяя область рН-стабильности рецепторного материала и обеспечивая его применимость для анализа в физиологических средах. Предложенный механизм справедлив для описания процессов допирования полимера в присутствии полиолов и гидроксикислот. В присутствии глюкозы и лактата (основных метаболитов углеводного обмена), зарегистрировано увеличение содержания в полимере восстановленных и протонированных фрагментов. Даже при рН 11 степень допирования в присутствии глюкозы возрастает от 5 до 10 %. Показано, что диссоциация полиолов сопровождается дополнительным протонированием цепи и обратимым редокс-превращением полимера с уменьшением его сопротивления. Исследованы зависимости хроноамперометрических откликов на глюкозу и лактат в зависимости от рН и потенциала. Предложен механизм редокс-превращений метаболитов на рецепторном миметике, объясняющий природу электрохимических откликов и указывающий на потенциальную возможность протекания (электро)каталитических реакций. С целью увеличения селективности рецепторных миметиков к отдельным метаболитам углеводного обмена синтезированы покрытия на основе боронат-замещенного полианилина с молекулярными отпечатками лактата. Метод адаптирован для проточного синтеза полимерных наноструктур с молекулярными отпечатками лактата. Проведено сопоставительное исследование аналитических характеристик сенсоров на основе синтетических рецепторов в различных режимах (спектроскопия импеданса, хроноамперометрия, потенциометрия). Показано, что использование подходов темплатирования позволяет увеличить селективность сенсора к лактату в присутствии глюкозы практически в 5 раз (a=45 для потенциометрического детектирования и a=25 для режима хроноамперометрии). С целью замены ферментов и создания более стабильных/функциональных (био)сенсорных систем осуществлен химический синтез каталитических миметиков пероксидазы на основе гексацианоферрата железа. Миметики различного размера (согласно данным динамического светорассеяния и электронной микроскопии, от 35 до 250 нм) и пористости (согласно данным метода капиллярной конденсации азота) синтезированы путем восстановления комплекса феррицианида железа (III) пероксидом водорода/органическими гидропероксидами/мономерами проводящих полимеров. Изменение структуры миметика в ходе редокс-превращения берлинская лазурь/берлинский белый исследовали in situ с использованием синхротронного излучения. Установлено, что редокс-переходы с внедрением катионов щелочных элементов сопровождаются обратимым изменением параметра ячейки в пределах 1.012-1.020 нм (независимо от типа катиона), тогда как внедрение протона приводит к существенному падению емкости, сопровождающейся снижением максимального параметра ячейки до 1.014 нм. Потеря электроактивности миметика может быть приписана формированию мостиковых групп Fe-O-Fe в восстановительных условиях. С использованием подходов стационарной ферментативной кинетики проведено сопоставительное исследование каталитической активности фермента и его миметика в присутствии различных гидропероксидов и восстанавливающих субстратов. Установлено, что каталитические миметики на основе берлинской лазури не только активнее пероксидазы из корней хрена, но и более селективны по Н2О2. Для наночастиц среднего размера (d = 70 нм) коэффициенты селективности в присутствии органических гидропероксидов превышают таковые для фермента до 4 раз. В рамках создания миниатюрного электрохимического нательного монитора разработана микрокапиллярная система, сочетающая функции сбора пота с поверхности кожи около 6 см2, доставки пота к поверхности сенсора и его отвода за счет капиллярных сил. Показано, что для изготовления микрокапилляров предпочтительна технология фотополимерной 3D печати. Разработанная система обеспечивает непрерывный поток в условиях физиологических скоростей экскреции (в среднем 25 мкл∙см-2∙ч-1) и постоянное обновление анализируемого раствора у поверхности сенсора для флэш-мониторинга метаболитов. Изготовлен миниатюрный носимый контроллер, обеспечивающий сбор токового сигнала (АЦП 12 бит), обработку и передачу информации на устройство пользователя (смартфон) по протоколу Bluetooth Low Energy. Контроллер позволяет регистрировать ток короткого замыкания в широком диапазоне значений: от 0.01 до 12000 нА, обеспечивая высокое разрешение (до 3 пА) при регистрации малых токов. Изготовленный микроконтроллер обладает высокой производительностью (до 1000 измерений/c) и низким энергопотреблением (до 1мАч в режиме работы). При этом по точности контроллер лишь незначительно уступает по характеристикам приборам аналитического класса (пикоамперметр Keithley 6487).

Аннотация результатов, полученных в 2022 году
В результате выполнения второго этапа Проекта изготовлены биосенсоры для детекции метаболитов углеводного обмена (глюкозы/лактата) путем последовательной и совместной иммобилизации миметика пероксидазы на основе берлинской лазури и соответствующих ферментов оксидаз. Подход соиммобилизации позволяет значительно снизить диффузионные ограничения в чувствительном слое и при использовании оптимального состава полимерной мембраны – до 10 раз увеличить чувствительность биосенсора. Высокая операционная стабильность биосенсоров, обеспечивающая сохранение более 90% первоначального отклика в ходе непрерывного мониторинга ультравысоких концентраций метаболитов (до 80 мМ лактата) в течение нескольких часов, делает возможным их применение для непрерывного анализа метаболитов в составе носимых устройств. Биосенсоры интегрированы в компактные микроэлектронные устройства, сочетающие в себе функции сбора и доставки анализируемого раствора (пота человека в момент его выделения) к поверхности биосенсора, электроанализа в режиме гальванической ячейки и передачи сигнала на мобильное устройство по беспроводному каналу. Осуществлена модификация и прототипирование носимого электроанализатора метаболитов пота с учетом эргономичности, форм-фактора и необходимости непрерывного обновления анализируемого раствора на поверхности (био)сенсора. Реализован графический вывод показаний сенсора на мобильном устройстве, а также обеспечена возможность регуляции параметров считывания и усреднения сигнала с устройства пользователя. С целью передачи импульсного сигнала в качестве альтернативного решения предобработке сигнала на микроконтроллере реализована возможность потоковой передачи данных на устройство пользователя. В Проекте впервые продемонстрировано, что скорость потока анализируемого раствора в значительной мере влияет на величину регистрируемого тока, определяя вклады процессов конвекции, диффузии и электродной кинетики в отклик (био)сенсоров. Исследованы чувствительность и точность (био)сенсоров на ключевые метаболиты (глюкоза, лактат, Н2О2) на основе каталитических миметиков в зависимости от гидродинамических условий. В том числе для моделирования условий мониторинга метаболитов в поте нательными устройствами рассмотрены тонкослойные проточные ячейки, интегрированные в капиллярную систему потоотбора, и ячейки типа патч, в которых экскрецию пота железами имитировали распределительной системой выходных каналов. Установлено, что при низких скоростях потока отклик может быть ограничен как по аналиту (за счет значительного снижения концентрации вещества в диффузионном слое в ходе протекания электрокаталитической реакции), так и по продукту (за счет неэффективного отвода продукта/его адсорбции на поверхности миметика и блокированию активных центров катализатора). Для описания сигнала сенсора в зависимости от скорости потока анализируемого раствора с учетом конкурентного взаимодействия аналита и продукта с активными центрами электрокатализатора предложена модель, в которой соотношение диффузионной и конвективной компоненты учитываются введением числа Пекле. Для пероксидных, глюкозных и лактатных биосенсоров выделены диапазоны концентраций и скоростей потока, в которых значение регистрируемого сигнала определяется эффектами концентрационной поляризации/затрудненным отводом продукта реакции. Показано, что наиболее выраженная зависимость отклика (био)сенсоров от скорости потока наблюдается в области смены диффузионного и кинетического режимов. Исследованы закономерности скорости локального потоотделения человеком в зависимости от условий (нагрузка/покой, до/после стимуляции потовых желез) с использованием как коммерческих потосборников, используемых в клинической практике, так и разработанных капиллярных систем отбора пота, интегрированных с биосенсорами. Установлено, что средняя скорость потоотделения для человека в условиях физической нагрузки составляет около 5 мкл∙ч-1∙см-2 и может изменяться в пределах порядка величины в процессе тренировки. После стимуляции потоотделения при помощи клинически одобренной процедуры электрофореза пилокарпина скорость потоотделения значительно увеличивается, в среднем достигая значений 16 мкл∙ч-1·см-2 в покое и 25 мкл∙ч-1·см-2 в ходе последующей физической нагрузки. Таким образом, для корректной интерпретации сигналов проточных (био)сенсоров на основе берлинской лазури необходимо учитывать эффекты, ассоциированные с низкой/переменной скоростью экскреции пота. Несмотря на слабую потокозависимость генерируемого тока при низких скоростях подачи анализируемого раствора, изменение условий конвекции (вызванное движением или переменной скорость потения) может приводить к значительному (от нескольких раз до порядка величины) изменению сигнала. Для снижения вариации отклика в условиях переменного потока разработан лактатный биосенсор на основе миметика пероксидазы с диффузионной композитной мембраной. Тогда как отклик биосенсора на основе только золя алкоксисиланов зависит от скорости потока в широком диапазоне значений, сигнал биосенсора на основе диффузионной мембраны не чувствителен к изменению потока в диапазоне, соответствующем физиологическим скоростям экскреции пота. С помощью двух независимых носимых устройств осуществлен одновременный in situ контроль уровня лактата с помощью биосенсора на основе диффузионной мембраны и скорости выделения пота с использованием биосенсора, отклик которого в присутствии физиологических концентраций лактата в поте определяется только скоростью потока. Установлено, что показания устройств не зависят друг от друга – а значит, концентрация лактата в поте не определяется интенсивностью потоотделения. Это подтверждает диагностическую ценность лактата в поте человека для контроля состояний гипоксии в ходе физических нагрузок. С целью минимизации эффектов, вызванных ограничениями по продукту и аналиту, и увеличения точности детекции ключевых метаболитов в условиях ограниченного массопереноса для (био)сенсоров на основе миметиков пероксидазы реализован импульсный режим регистрации сигнала. Импульсная генерация тока осуществлена путем попеременного короткого замыкания и размыкания цепи рабочего электрода, модифицированного берлинской лазурью, и хлоридсеребряного электрода сравнения, с помощью программируемого универсального контроллера метаболитов. Установлено, что даже для сенсоров на основе редокс-катализатора (берлинской лазури) обогащение диффузионного слоя аналитом при размыкании цепи позволяет до 15 раз увеличить чувствительность к пероксиду водорода и в 2.5 раза – соотношение сигнал/фон. Помимо этого, снижение ограничений по продукту обеспечивает более равномерное распределение потенциала по поверхности сенсора и, как результат, позволяет улучшить соотношение сигнал/шум. Для создания высокостабильных бесферментных биосенсоров, интегрируемых в носимые электроанализаторы, в рамках Проекта предложены рецепторные миметики на основе боронат-замещенного полианилина, способные селективно и обратимо связываться с сахарами и гидроксикислотами. Исследованы аналитические характеристики проточных сенсоров на глюкозу и лактат с адсорбированными рецепторными миметиками в зависимости от рН среды и прикладываемого потенциала, установлены условия генерации максимальных стационарных токов в присутствии полиолов и гидроксикислот. Продемонстрирована потенциальная возможность протекания (электро)каталитических реакций на поверхности рецепторных миметиков, предложен механизм их включения в каталитический цикл.