Аннотация результатов, полученных в 2021 году
Согласно заявленному плану в 2021–2022 гг. были выполнены следующие работы: • проведен синтез с применением подходов «мягкой химии» и анализ комплексом взаимодополняющих физико-химических методов наночастиц СеО2, функционализированных различными биомолекулами; • изучено влияние функционализированных наночастиц СеО2 на транспортные и антиоксидантные свойства сывороточного альбумина человека на примере модельного белка и для биологических жидкостей хемилюминесцентным и спектрофлуориметрическим методами. Получен ряд новых существенных результатов, способствующих решению проблемы, связанной с всесторонним исследованием нанокристаллического СеО2, как участника свободнорадикального метаболизма, для потенциального биомедицинского применения. Показано успешное применение синтеза на основе термогидролиза водного раствора (NH4)2Ce(NO3)6 с последующей функционализацией поверхности образцов биосовместимыми лигандами как способа получения новых видов золей СеО2, характеризующихся стабильностью и биохимической активностью. Получены золи СеО2, модифицированные биосовместимыми молекулами — аминокислотами: L-триптофаном, L-тирозином, L-цистеином (входят в состав сывороточного альбумина и формируют основной пул антиоксидантов) и L-аргинином (источник NO), белками: интерлейкином 1 (цитокин, медиатор воспаления и иммунитета) и коллагеном (главный белок внеклеточного матрикса и физиологический активатор тромбоцитов) и галловой кислотой (соединение, производные которого обладают выраженными антиоксидантными свойствами). В качестве образца сравнения получен цитрат-стабилизированный золь СеО2. Все образцы содержали однофазный диоксид церия (PDF2 34-0394). Размер частиц соответствовал диапазону 3–5 нм. Результаты анализа образцов наночастиц СеО2 методом просвечивающей электронной микроскопии и электронной дифракции подтверждали данные о размере частиц и фазовом составе полученных материалов. Средний гидродинамический диаметр частиц оказался равным 12–18 нм, при этом значения для золей СеО2, модифицированных интерлейкином 1 и коллагеном, 25 и 30 нм, соответственно, свидетельствовали о некотором изменении степени агрегации. Анализ электрокинетических свойств золя СеО2 без модификаторов позволял говорить о высокой степени стабильности коллоидного раствора. Функционализация поверхности наночастиц L-тирозином приводила к повышению дзета-потенциала, для других лигандов — к снижению. Идентифицированы все полосы поглощения в ИК-Фурье спектрах золей. Установлено, что галловая кислота и L-аргинин характеризуются наилучшей способностью к связыванию с наночастицами СеО2. Получены и охарактеризованы конъюгаты наночастиц СеО2 с сывороточным альбумином человека (САЧ) на примере модельного раствора белка (САЧ–СеО2 NPs). В модели генерации алкилпероксильных радикалов для конъюгатов САЧ–CeO2 NPs 1:1 и 1:10 получено снижение уровня стационарного свечения, что позволяет говорить об окислительной модификации альбумина при связывании с наночастицами СеО2. Установлено, что эффект не зависит от концентрации золя СеО2. Показано, что связывание наночастиц СеО2 с альбумином, выделенным из плазмы крови практически здоровых доноров, перитонеальной жидкости пациенток с эндометриозом и синовиальной (суставной) жидкости, приводит к усилению антиоксидантных свойств конъюгатов САЧ–CeO2 NPs (1:1). Продемонстрировано, что связывание наночастиц СеО2 с белком при образовании конъюгатов (1:1, 1:2, 2:5, 1:5, 1:10, 1:20) приводит к конформационным перестройкам в структуре САЧ. Установлено, что супрамолекулярный комплекс формируется при мольном соотношении белка и нанодисперсного СеО2, равном 1:1. Найдено, что снижение флуоресценции при взаимодействии альбумина с цитрат-стабилизированным золем СеО2 происходит по механизму статического тушения: образуется комплекс между флуорофором и тушителем. Найдено, что сопоставление показателей, отражающих связывающую способность (ECA/TAC) и долю модифицированного альбумина (FMA), для конъюгатов САЧ–CeO2 NPs демонстрирует увеличение FMA. При этом значения показателя ECA/TAC практически не изменяются. Взаимодействие наночастиц СеО2, в том числе цитрат-стабилизированного золя, с САЧ приводит к конформационным изменениям в белке, не затрагивающим лекарственные центры альбумина и, соответственно, не вызывающих нарушения его транспортной функции. Для конъюгатов в случае, когда белок выделен из биологических жидкостей, установлено увеличение показателя ECA/TAC, свидетельствующее о снижении связывающей способности белка. Установлено, что липопероксидазоподобная активность цитратного золя CeO2 на 6 порядков ниже, чем у дезоксигемоглобина (Fe(II)) и на 2 порядка выше, чем у коллоидного раствора карбоксимальтозата Fe(III) (антианемический препарат Феринжект®). Анализ кинетики перекисного окисления липидов, индуцированного наночастицами CeO2, дезоксигемоглобином (Fe(II)) и карбоксимальтозатом Fe(III), позволяет сделать предположение о сходстве механизмов их прооксидантного действия. Получено, что цитратный золь СеО2 по отношению к гидропероксиду фосфатидилхолина проявляет фосфолипероксидазоподобную активность. Прооксидантная способность наночастиц CeO2 в 20 раз ниже, чем у дезоксигемоглобина (Fe(II)) и в 4 раза выше, чем у карбоксимальтозата Fe(III). Сравнительный анализ липо- и фосфолипопероксидазоподобной активности наночастиц CeO2 и дезоксигемоглобина (Fe(II)) позволяет характеризовать нанодисперсный CeO2 как мягкий прооксидант. Найдено, что редокс-активность наночастиц CeO2 схожа со свойствами Fe(III), являющегося основным компонентом железосодержащих лекарственных средств для внутривенного введения. Установлено, что фосфолипопероксидазоподобные свойства цитрат-стабилизированного золя СеО2 выражены сильнее по сравнению с липопероксидазоподобными. Сделано предположение о том, что это может отражать тропность нанодисперсного СеО2 к фосфолипидам. Все запланированные в отчетном периоде научные результаты достигнуты. К наиболее значимым с практической и фундаментальной точек зрения результатам выполнения проекта в 2021–2022 гг. можно отнести следующие: 1) Впервые получены стабильные золи СеО2, модифицированные биосовместимыми лигандами, в том числе аминокислотами (L-триптофан, L-тирозин, L-цистеин, L-аргинин), белками (интерлейкин 1, коллаген), органическими кислотами (галловая кислота). 2) Показано, что взаимодействие наночастиц СеО2 с сывороточным альбумином человека приводит к конформационным изменениям в структуре белка, однако эти изменения не затрагивают лекарственные центры альбумина и, соответственно, не ухудшают его транспортные свойства. 3) Получено, что в модели генерации алкилпероксильных радикалов конъюгаты наночастиц СеО2 с альбумином, выделенным из биологических жидкостей (плазма крови, перитонеальная и синовиальная жидкости), характеризуются выраженными антиоксидантными свойствами. 4) Показано, что цитрат-стабилизированный золь СеО2 обладает редким типом нанозимной активности ― фосфолипероксидазоподобной, при этом механизм прооксидантного действия аналогичен проявляемому ионами Fe(III) — основными компонентами железосодержащих лекарственных средств для внутривенного введения. Результаты реализации проекта представлены в СМИ: https://xn--80afdrjqf7b.xn--p1ai/news/9181/, http://www.ras.ru/news/shownews.aspx?id=d048196c-9af0-4135-bd17-32c970a5ab20, https://rscf.ru/news/release/novye-grani/, https://scientificrussia.ru/articles/novye-grani-biologiceskoj-aktivnosti-neorganiceskih-enzimov, https://poisknews.ru/themes/himiya/vyyavleny-novye-grani-biologicheskoj-a/, https://indicator.ru/chemistry-and-materials/khimiki-nashli-u-oksida-ceriya-dva-novykh-tipa-fermentopodobnoi-aktivnosti-03-11-2021.htm, https://mendeleev.info/himiki-nashli-u-oksida-tseriya-dva-novyh-tipa-fermentopodobnoj-aktivnosti/, https://sciencemon.ru/office/org/blog/259700/, http://www.igic.ras.ru/press_release_05_11_2021.php.

Аннотация результатов, полученных в 2022 году
Согласно заявленному плану в 2022–2023 гг. были выполнены следующие работы: • выполнен анализ радикал-перехватывающих свойств и биохимической активности наночастиц диоксида церия, в том числе функционализированных биосовместимыми лигандами, в модельной системе генерации активных форм хлора и в клеточной модели с активированными нейтрофильными гранулоцитами (нейтрофилами) крови хемилюминесцентным методом; • выполнен анализ биохимической активности функционализированных наночастиц СеО2 в модельной системе с пероксинитритом, в том числе в присутствии сывороточного альбумина человека, очищенного и выделенного из биологических жидкостей, спектрофлуориметрическим методом; • исследована энзимоподобная активность конъюгатов наночастиц диоксида церия с ферментами (уриказа, гемоглобин) и тиолсодержащими антиоксидантами (глутатион, цистеин) по отношению к биохимически важным свободным радикалам (алкилпероксильные, липидные и фосфолипидные радикалы, супероксидные анион-радикалы и пероксид водорода) хемилюминесцентным методом. Все запланированные в отчетном периоде научные результаты достигнуты. К наиболее значимым с практической и фундаментальной точек зрения результатам выполнения проекта в 2022–2023 гг. можно отнести следующие. Впервые получены количественные характеристики редокс-активности наночастиц СеО2 по отношению к активным формам хлора в молекулярной и клеточной моделях хемилюминесцентным методом. Найдено, что способность цитрат-стабилизированного золя CeO2 выступать в качестве перехватчика свободных радикалов в молекулярной модели генерации активных форм хлора на основе миелопероксидазы и пероксида водорода примерно на 2 порядка ниже, чем у глутатиона. На примере крови практически здоровых доноров показано, что цитрат-стабилизированный золь СеО2 оказывает активирующее влияние на спонтанную хемилюминесценцию и супрессорное действие на стимулированную хемилюминесценцию нейтрофилов. При этом активирующее влияние наночастиц СеО2 на порядок меньше по сравнению с искусственными стимулами — форбол-12-миристат-13-ацетатом и N-формилметионил-лейцил-фенилаланином. Получено, что сочетанное действие наночастиц СеО2 и импульсного широкополосного УФ-излучения в дозе 210 мДж/см2 вызывает активацию нейтрофильного звена системного иммунитета. При УФ-облучении крови дозой 210 мДж/см2 наночастицы СеО2 усиливают как спонтанную, так и стимулированную радикал-продуцирующую функцию нейтрофилов. Продемонстрировано дозозависимое снижение интенсивности флуоресценции раствора пероксинитрита в присутствии цитратного золя СеО2. Показано, что сывороточный альбумин человека (очищенный и выделенный из биологических жидкостей) в составе конъюгатов с наночастицами СеО2 в меньшей степени подвергается окислительной модификации, обусловленной пероксинитритом, по сравнению с индивидуальным белком. Продемонстрирована прооксидантная активность конъюгатов наночастиц СеО2 с уриказой (СеО2@уриказа) и гемоглобином (СеО2@гемоглобин) по отношению к пероксиду водорода методом люминол-зависимой хемилюминесценции. В случае с конъюгатом СеО2@гемоглобин реализуется синергетический прооксидантный эффект. Установлено, что прооксидантная емкость конъюгата СеО2@гемоглобин в 1.7 раз больше, чем аналогичный показатель, оцененный для индивидуального гемоглобина. Впервые продемонстрировано, что конъюгаты СеО2@уриказа и СеО2@гемоглобин обладают прооксидантной активностью по отношению к гидропероксиду линолевой кислоты (липопероксидазоподобная активность). Найдено, что конъюгаты СеО2 с уриказой не обладают редокс-активностью по отношению к гидропероксиду фосфатидилхолина. Эффект усиления кумарин-зависимой хемилюминесценции в системе с фосфолипидными радикалами для конъюгатов СеО2@гемоглобин обусловлен фосфолипопероксидазной активностью гемоглобина. В системе с алкилпероксильными радикалами получено, что связывание наночастиц СеО2 с L-цистеином и глутатионом приводит к значительному снижению антиоксидантной и прооксидантной емкости аминокислоты и трипептида. При сравнении одинаковых концентраций композитов СеО2 с цистеином (СеО2@цистеин) и глутатионом (СеО2@глутатион) и индивидуальных растворов лигандов получено, что наиболее выраженные изменения биохимических свойств после взаимодействия с наночастицами диоксида церия характерны для L-цистеина. Методом люцигенин-активированной хемилюминесценции в системе с ксантином и ксантиноксидазой продемонстрирована СОД-подобная активность композитов СеО2@цистеин и СеО2@глутатион. Результаты, полученные для исходного золя СеО2 без лиганда и индивидуальных растворов тиоловых антиоксидантов, L-цистеина и глутатиона, свидетельствуют о синергетическом антиоксидантном действии композитов СеО2@цистеин и СеО2@глутатион по отношению к супероксидным анион-радикалам. Показано, что композиты CeO2 с галловой кислотой (CeO2@ГК) обладают разнонаправленной редокс-активностью, обусловленной сочетанием антиоксидантных и прооксидантных свойств. Установлено, что редокс-активность композитов CeO2@ГК в большей степени обусловлена лигандом — галловой кислотой. При этом иммобилизация галловой кислоты на поверхности наночастиц диоксида церия приводит к снижению ее антиоксидантной и прооксидантной активности. Данный эффект наиболее выражен в случае композита CeO2@ГК состава 2:1, снижение антиоксидантной и прооксидантной емкости галловой кислоты составляет 40 ± 3% и 58 ± 9%, соответственно.