КАРТОЧКА ПРОЕКТА,
ПОДДЕРЖАННОГО РОССИЙСКИМ НАУЧНЫМ ФОНДОМ

Информация подготовлена на основании данных из Информационно-аналитической системы РНФ, содержательная часть представлена в авторской редакции. Все права принадлежат авторам, использование или перепечатка материалов допустима только с предварительного согласия авторов.

 

ОБЩИЕ СВЕДЕНИЯ


Номер 21-64-00024

НазваниеМетаболическая инженерия микробных продуцентов для промышленной биотехнологии: получение ценных изопреноидных синтонов из природных стеринов

РуководительДонова Марина Викторовна, Доктор биологических наук

Организация финансирования, регионФедеральное государственное бюджетное учреждение науки «Федеральный исследовательский центр «Пущинский научный центр биологических исследований Российской академии наук», Московская обл

Годы выполнения при поддержке РНФ 2021 - 2024 

КонкурсКонкурс 2021 года «Проведение фундаментальных научных исследований и поисковых научных исследований по поручениям (указаниям) Президента Российской Федерации» (генетические исследования)

Область знания, основной код классификатора 04 - Биология и науки о жизни, 04-209 - Биотехнология (в том числе бионанотехнология)

Ключевые словаМетаболическая инженерия, гетерологическая экспрессия, рекомбинант, актинобактерии, мицелиальные грибы, стероид, изопреноид, фитостерин, биоконверсия

Код ГРНТИ62.09.39


 

ИНФОРМАЦИЯ ИЗ ЗАЯВКИ


Аннотация
Проект направлен на создание научно-технологического задела для промышленной микробиологии, связанной с биоконверсией природных стеринов. Основными задачами Проекта являются создание перспективных для промышленного использования новых генно-модифицированных и трансгенных микроорганизмов, продуцирующих из дешевых и доступных фитостеринов продукты с высокой добавленной стоимостью – изопреноидные синтоны стероидного и инданового ряда. Разработка на их основе биотехнологий нового поколения открывает перспективы создания производства целой линейки важных соединений для фармацевтики, биомедицины, ветеринарии и других отраслей. Особенно актуальным такое производство является для России: обладая неисчерпаемыми природными ресурсами для производства высококачественных фитостеринов (лесохимическая отрасль), наша страна является единственным крупным государством, не имеющим собственного производства полного цикла стероидных препаратов. Несмотря на значительный прогресс в области изучения катаболизма природных стеринов у актинобактерий, остаются значительные пробелы в понимании генетического контроля ключевых этапов окислительной деградации боковой цепи и колец C/D-стероидного ядра у непатогенных видов. Восполнение этих пробелов является необходимым для создания высокопроизводительных рекомбинантных штаммов, способных селективно продуцировать ценные изопреноидные метаболиты. Актуальной проблемой является также расширение арсенала методов для направленной структурной модификации микроорганизмами стероидов и других терпеноидных липидов, таких как оксифункционализация неактивных углеродных атомов, в том числе регио- и стереоспецифическое гидроксилирование гонанового ядра и боковой цепи стеринов. Решение проблемы связано с генетической инженерией микроорганизмов, в том числе, путем экспрессии чужеродных систем стероидогенеза в микробных хозяевах. В задачи Проекта входит получение новых рекомбинантных микробных штаммов, способных конвертировать фитостерины в С22-, С24- и С26-стероиды, в том числе, 9-гидроксированные, и ненасыщенные при С-17(20), а также новых улучшенных промышленных штаммов - продуцентов С19-стероидов и инданонов. Для решения этих задач в микобактериальных клетках будут модифицированы пути окислительной деградации боковой цепи фитостеринов с переключением метаболических потоков в сторону накопления целевых стероидов, а также блокированы нежелательные активности, приводящие к образованию побочных продуктов. Другим направлением исследований является создание (с применением синтетических оперонов) и изучение функциональных свойств рекомбинантных микроорганизмов, экспрессирующих чужеродные системы стероидогенеза. На основе уникального высокопроизводительного цитохрома P450 BM3 из Bacillus megaterium планируется создание микобактериального трансгенного штамма, осуществляющего окислительную деградацию фитостерина с одновременным регио- и стереоселективным 7бета-гидроксилированием стероидов. Кроме того, будут изучены новые стероидные гидроксилазы мицелиальных грибов, обладающие высокой активностью в отношении стероидов андростанового ряда, идентифицированы кодирующие их гены и на основе их гетерологической экспрессии созданы эффективные рекомбинантные микробные продуценты диастереомеров стероидных спиртов (7бета, 11альфа и других). С учетом высокой актуальности проблемы получения эффективных противовирусных препаратов (в том числе против коронавирусов), на основе экспрессии генов микобактериальных монооксигеназ, гидроксилирующих холестерин при С26, будут созданы рекомбинантные микробные продуценты 26-гидроксистероидов, изучены их функциональные характеристики, получены новые производные для биомедицинских исследований. Перспективные для биотехнологического применения рекомбинантные штаммы будут использованы при создании новых биопроцессов – прототипов промышленных биотехнологий. Этапами их разработки будут оптимизация условий роста созданных микробных штаммов и биоконверсии ими фитостеринов, масштабирование от колбочного уровня до уровня лабораторных (или пилотных) биореакторов, отработка режимов ферментации, разработка процедур выделения и очистки целевых продуктов с получением кристаллических субстанций высокого качества. В ходе выполнения проекта будут получены приоритетные научные результаты о генетическом контроле окислительной деградации боковой цепи стеринов и глубокого окисления стероидного ядра (колец C и D), управляемой гетерологической экспрессии чужеродных генов в бактериальных и дрожжевых хозяевах, функциональных особенностях бактериальных и эукариотических цитохром P450-монооксигеназ, осуществляющих регио- и стереоспецифические реакции гидроксилирования стероидов. Комплексное решение фундаментальных задач в области генетической и метаболической инженерии стероидтрансформирующих штаммов и микробиологической трансформации природных стеринов позволит создать научную основу для создания нового поколения микробных продуцентов и инновационных биопроцессов для промышленной микробиологии. Практическая значимость проекта состоит в создании новых эффективных микробных продуцентов и разработке на их основе прототипов промышленных биотехнологий нового поколения, открывающих перспективы создания многоцелевых микробиологических производств, в которых на одной технологической линии возможна продукция из фитостерина целого ряда востребованных продуктов. Залогами успешного выполнения проекта является профессиональная команда исполнителей - специалистов в области молекулярной биологии, генетической инженерии, микробиологии, биотехнологии, химии, а также весомый научный задел по тематике проекта и практический опыт разработки и масштабирования биотехнологий, а также, несомненно, поддержка проекта компаниями, заинтересованными в дальнейшем практическом применении его результатов.

Ожидаемые результаты
В результате выполнения Проекта будут получены приоритетные результаты, имеющие высокую научную значимость и перспективные для практического применения в промышленной микробиологии, связанной с биоконверсией фитостеринов и производством изопреноидных соединений стероидного и инданового ряда: На основе геномного профилирования и транскриптомного анализа ряда ранее не исследованных актинобактериальных штаммов будет изучена структурно-функциональная организация генов катаболизма стероидов, предсказаны их функции и выявлены новые важные гены, кодирующие ключевые этапы окислительной деградации боковой цепи и глубокого окисления гонанового ядра природных стеринов. Будет получена важная информация о метаболическом потенциале ранее не исследованных актинобактерий и выбраны перспективные штаммы для генетической инженерии микробных штаммов - продуцентов С22, С24, С27-стероидов (продуктов неполного окисления фитостеринов). На основе сравнительного биоинформатического анализа организации и дифференциальной экспрессии генов катаболизма стероидов будут определены перспективные гены-мишени и разработана стратегия направленного мутагенеза для модификации путей стероидного катаболизма в новых актинобактериальных организмах-хозяевах. Будет разработан новый инструментарий для метаболической инженерии актинобактерий, включающий специализированные генетические конструкции и протоколы для введения направленных мутаций в бактериальную хромосому, а также комплементации введённых мутаций и(ли) увеличения экспрессии целевых генов. Будут получены новые рекомбинантные штаммы актинобактерий, несущие одиночные направленные мутации и комбинации мутаций в различных генах KstR и KstR2-регулонов и иных генах, прямо или опосредованно вовлечённых в биотрансформацию стеринов и продукцию стероидных катаболитов. Будет выполнен функциональный анализ генов и наборов генов на основе профилирования спектра интермедиатов и продуктов биоконверсии стеринов, продуцируемых мутантными штаммами актинобактерий, содержащих 13-27 атомов в углеродном скелете и несущих различные наборы функциональных групп, в том числе являющихся перспективными изопреноидными и стероидными синтонами. Будут установлены функции генов известных (KstR, KstR2) и новых регулонов микобактерий, что внесёт весомый вклад в изучение генетической регуляции сложной сети биохимических реакций на стадиях окислительной деградации боковой цепи стеринов и функционирования «нижних» деградативных путей стеринов (деградация колец C/D стероидного ядра) у микобактерий. Будут получены улучшенные рекомбинантные штаммы-продуценты классических стероидных синтонов (таких как 9-гидроксиандростендион или стероидные 1-дегидроаналоги) в которых отсутствуют или понижены нежелательные биохимические активности, и улучшены селективность селективность биотрансформации. К нежелательным активностям относятся необратимое 1(2)-дегидрирование 9-гидроксилированных стероидных интермедиатов, 17-восстановление стероидных 1-дегидроаналогов и другие. Будут получены рекомбинантные штаммы-продуценты новых стероидных синтонов, таких как 9-гидроксилированные С22 соединения, дополнительно функционализированные одной из следующих полезных модификаций: ненасыщенные по положению C17-C20; 9,17-дигидроксилированные; несущие в положении C22 карбоксильную группу, соответствующий простой эфир или карбонильную группу. Будут получены рекомбинантные штаммы-продуценты новых C13 изопреноидных синтонов, таких как 3aα-H-4α(3-пропионат)-7aβ-метилгексагидро-1,5-индандиона (HIP) и его гомологи, важные для разработки альтернативных существующим, более эффективных схем синтеза крайне востребованных в медицине 19-норстероидов, которые обладают анаболическими или гестагенными свойствами. - Будут изучены свойства новых стероидных гидроксилаз мицелиальных грибов. На основании высокопроизводительного секвенирования мРНК грибных штаммов, выращенных в различных условиях индукции стероидными соединениями и биоинформатического анализа транскриптомов, будут идентифицированы гены новых стероидных цитохром P450 монооксигеназ и их нативных редокс-партнеров. Будут созданы трансгенные микробные штаммы, гетерологически экспрессирующие гены гидроксилазных систем мицелиальных грибов, изучены их функциональные характеристики - Будет разработан генетический инструментарий для гетерологической экспрессии уникального мутантного цитохрома P450 BM3 LG из Bacillus megaterium в микобактериальных хозяевах. Впервые будут созданы трансгенные штаммы микобактерий, гетерологически экспрессирующие уникальный P450 BM3 LG в микобактериях, изучены функциональные особенности рекомбинантных штаммов и метаболический профиль образующихся из фитостеринов стероидов. Будут получены приоритетные научные данные о совместном функционировании в микобактериальной клетке собственной полиферментной системы окислительной деградации стеринов и чужеродного бациллярного цитохрома. - Впервые будет оценена возможность получения С26-функционализированных производных холестерина на основе гетерологической экспрессии микобактериальных генов стероид-С26-гидроксилаз. Будут созданы генетические конструкции, кодирующие гены цитохромов P450 стероид-С26-гидроксилаз как одиночно, так и совместно с кДНК редокс-партнеров в составе полицистронных искусственных оперонов, получены рекомбинантные штаммы, оценена их функциональная активность и перспективы биотехнологического применения в качестве продуцентов ценных С-26-гидроксистероидов, обладающих противовирусной активностью - Будут оценены перспективы биотехнологического применения новых рекомбинантных штаммов в качестве продуцентов целевых стероидных и индановых соединений, выявлены условия, благоприятные для их роста и обеспечения высокой активности. - На уровне лабораторных (или пилотных) биореакторов будут разработаны модельные биопроцессы для эффективной биотрансформации фитостерина, оптимизированы режимы ферментации, разработаны методы препаративного выделения и очистки целевых стероидов с получением кристаллических продуктов высокой степени очистки Таким образом, будут получены новые научные данные, разработан новый генетический инструментарий, созданы биотехнологически значимые микробные штаммы и прототипы технологий для промышленной микробиологиии. Результаты, несомненно, обладают мировым приоритетом, высокой степенью научной новизны и практической значимости, находятся на переднем крае исследований в стремительно развивающейся области генетической и метаболической инженерии и биотехнологии стероидов. Реализация результатов проекта будет способствовать решению экономических и экологических проблем за счет применения высокоэффективных одностадийных биотехнологий биоконверсии возобновляемого растительного сырья – фитостеринов и замены многостадийных химических синтезов.


 

ОТЧЁТНЫЕ МАТЕРИАЛЫ


Аннотация результатов, полученных в 2021 году
В соответствии с планом исследований первого года выполнения проекта исследования проводились по следующим основным направлениям: H1 Функциональная характеристика и сопоставительный анализ новых штаммов актинобактерий – деструкторов стеринов и оценка перспектив их использования для метаболической биоинженерии новых продуцентов. Секвенирование и биоинформатический анализ геномов наиболее активных штаммов Выполнен поиск штаммов актинобактерий, потенциально обладающих способностью к эффективной биодеградации растительных стеринов. Первичный отбор кандидатных штаммов из доступных коллекций микроорганизмов произведён на основании их таксономической близости с известными биотехнологически значимыми штаммами-продуцентами рода Mycolicibacterium, способными осуществлять биотрансформацию стеринов в полезные стероидные продукты такие как андростендион (АД), 9-гидроксиандростендион (9-ОН-АД). Ранее не идентифицированные изоляты отобраны на основании сходства профилей цельноклеточных масс-спектров их индивидуальных культур с таковыми у известных продуцентов. В прямых сравнительных экспериментах оценена эффективность биодеградации фитостерина культурами пяти кандидатных штаммов Mycolicibacterium в сравнении с деградативной активностью двух штаммов-продуцентов и известного штамма-деструктора M. smegmatis mc2 155. На основании высокой целевой активности три из пяти штаммов выбраны для дальнейшего изучения. Два новых активных изолята DVD-1296 и DVD-1301 были идентифицированы до вида как Mycolicibacterium fortuitum на основании гомологии генов 16S рРНК. Исследованы ростовые характеристики штаммов M. fortuitum DVD-1296 и DVD-1301 и M. smegmatis ВКМ Ac-1171 и их устойчивость к 10 антибактериальным агентам различных классов. Штаммы M. fortuitum DVD-1296 и DVD-1301 наиболее активно росли при 37 С, и были чувствительны к аминогликозидам гентамицину, канамицину и неомицину. Произведено высокопроизводительное секвенирование полных геномов двух новых штаммов M. fortuitum и штамма M. smegmatis ВКМ Ac-1171, последовательность генома которого была ранее неизвестна. Выполнена сборка и аннотирование геномов. Размеры геномов составили от 5421267 до 6988269 п.о. У всех штаммов идентифицированы ортологи ряда известных и предполагаемых генов, вовлеченных в катаболизм стероидов: гены, кодирующие ферменты окисления боковой цепи (Cyp125, fadD19, FadE26 (chsE4), FadE27 (chsE5), fadA5, fadD17, fadE34 (chsE3), FadE28 (ChsE1), FadE29 (ChsE2), Ltp2, Ltp3, Ltp4, Hsd4A, Hsd4B, EchA19, ChsH1, ChsH2), ферменты окисления колец A и B стероидного ядра (ChoD, ChoD2, Hsd, KstD, KshA, KshB, HsaA, HsaB, HsaC, HsaD, HsaE, HsaF, HsaG) и ферменты окисления колец C и D стероидного ядра (FadD3, FadE30, IpdA, IpdB, IpdC, IpdF, EchA20, FadE31, FadE32). Проведена оценка идентичности аминокислотных последовательностей белковых продуктов выявленных генов. Ключевыми ферментами деструкции стероидного ядра по 9(10)-секопути (единственному известному для актинобактерий пути деградации стероидов) являются 3-кетостероид-1-дегидрогеназа (кодируется геном kstD) и 9а-гидроксилаза, состоящая из субъединиц KshA и KshB (кодируются генами kshA и kshB, соответственно). У штамма M. smegmatis ВКМ Ac-1171 выявлено 5 кандидатных генов kstD, 2 гена kshA и 3 гена kshB. У штаммов M. fortuitum DVD-1301 и M. fortuitum DVD-1296 выявлено по 5 кандидатных генов kstD, 5 генов kshA и 3 гена kshB. При этом количество паралогов кандидатных генов у штаммов M. fortuitum DVD-1301 и M. fortuitum DVD-1296 было аналогично их количеству у M. fortuitum Ac-1817D, а у штамма M. smegmatis Ac-1171 – аналогично их количеству у M. smegmatis mc2 155. Н1 Направленный мутагенез и первичный функциональный анализ мутантных штаммов Mycolicibacterium smegmatis c инактивированными генами глубокой деградации стероидного ядра. Штамм M. smegmatis способен к полной деградации стеринов. В геноме штамма идентифицированы гены KstR2-регулона (гены fadD3, ipdA, ipdB), кодирующие ключевые этапы деградации кольца С стероидного ядра. Выполнен нокаут гена fadD3 - одиночного и в комбинации с генами ipdA одного и комбинации из трёх генов KstR2-регулона (гены fadD3, ipdA, ipdB), продукты которых вовлечены в окисление стероидных колец B и C. С применением различных методов хроматографического анализа проанализирована активность окисления холестерина пятью полученными мутантами. Показано, что мутанты способны конвертировать холестерин с накоплением в качестве основного метаболита изомеризующегося полярного продукта неполного окисления холестерина, предположительно, представляющего собой изопреноид инданового ряда. Начаты работы по его выделению, очистке и идентификации H1 Изучение особенностей катаболизма стеринов у термофильной актинобактерии Saccharopolyspora hirsuta ВКМ Ас-666 Ранее нами впервые была выявлена способность термофильной актинобактерии S. hirsuta ВКМ Ас-666 к эффективной модификации ряда стероидных субстратов (Lobastova et al., 2020). Особенностью окисления стеринов данным штаммом является накопление 26-гидроксистероидной кислоты с 3-гидрокси-5-ен-структурой, что не характерно для мезофильных актинобактерий и впервые выявлено для термофильной актинобактерии. Выделены и идентифицированы 3-оксо-4-ен- и 3-гидрокси-5-ен-стероидные интермедиаты, образующиеся на начальных этапах окислительной деградации боковой цепи стерина S. hirsuta. Соединения были определены как холест-4-ен-3-он, холеста-1,4-диен-3-он, 26-гидроксихолест-4-ен-3-он, 3-оксохолест-4-ен-26-овая кислота, 3-оксохолеста-1,4-диен-26-овая кислота, 26-гидроксихолест-5-ен-3-ол и 3-гидроксихолест-5-ен-26-еновая кислота. Структуры выделенных соединений были подтверждены методами ВЭЖХ, масс-спектрометрии, H1- и C13-ЯМР-спектроскопии. В геноме S.hirsuta нами выявлены кластеры генов, ортологов известных генов окисления боковой цепи стеринов, колец А/B и C/D стероидного ядра (Lobastova et al., 2021, Microorganisms (IF 4.127)). Изучены особенности роста S. hirsuta ВКМ Ас-666 при различных температурах, выявлены условия, способствующие накоплению 26-гидроксихолестерина. Получены препараты тотальной РНК клеток, выращенных в различных условиях индукции (при температурах 30 и 50 С, в присутствии холестерина и при его отсутствии в среде). Осуществлено высокопроизводительное секвенирование полных транскриптомов и получены результаты, свидетельствующие о почти двукратном превалировании количества генов, изменяющих экспрессию при температуре 50 С. Проводятся исследования, направленные на уточнение данных по изменению уровня экспрессии набора специфических генов катаболизма стеринов у S. hirsuta на основе идентификации дифференциально экспрессирующихся в присутствии холестерина генов различных этапов катаболизма стероидов. С целью выявления других термофильных/термотолерантных штаммов, окисляющих стерины, осуществлен поиск ключевых генов, относящихся к 9,10-секо-катаболическому пути стеринов среди 52 доступных геномов термофильных штаммов. Только у семи штаммов актинобактерий: Thermomonospora curvata DSM 43183, Amycolatopsis granulosa DSM 45669, Amycolatopsis methanolba 50.9b, Amycolatopsis methanolica 239T, Thermocatellispora tengchongensis DSM 45615, Amycolatopsis ruanii 49.3e и Microbispora siamensis NBRC 104113 выявлены белки 41,6-64,2%-ным сходством с референсными ферментами M. tuberculosis H37Rv. Для термофильных штаммов G. kaustophilus и P. thermoglucosidasius, способных осуществлять некоторые модификации стероидных соединений (6-гидроксилирование, восстановление 17/20-кетогруппы или 4(5)-двойной связи, отщепление C3-фрагмента боковой цепи по C17-C20) поиск более 20 ферментов катаболизма стероидов с помощью программы BLAST+ позволил выявить предполагаемые белки, которые на 47% и 45% схожи с референсным FadA5, соответственно; а также ферменты P. thermoglucosidasius, которые схожие с HsaF и HsaE из M. tuberculosis H37Rv на 48% и 41% соответственно. Результаты свидетельствуют о том, что способность к полному окислению стеринов не характерна для термофильных штаммов, т.е. найденный нами в результате экспериментального скрининга штамм S. hirsuta 666 является достаточно уникальным. H2 Создание мутантного гена cyp102A1-LG23 (дизайн и практическое осуществление стратегии химического синтеза гена или сайт-направленного мутагенеза), изучение экспрессии гена в составе полученных конструкций в E. coli и функциональное тестирование in vitro синтезированных белковых продуктов. Спроектированы и синтезированы четыре варианта кодирующей ДНК последовательности мутантного цитохрома CYP102A1-LG23, который известен как наиболее эффективный бактериальный (Bacillus megatherium) фермент, осуществляющий стереоспецифическое гидроксилирование стероидных субстратов. На основе этих ДНК последовательностей созданы плазмидные конструкции для экспрессии этих генов в бактериях Escherichia coli. Созданные на основе экспрессионного вектора pET28 конструкции, несущие гены мутантного цитохрома CYP102A1-LG23, экспрессированы в клетках E. сoli. Показан высокий уровень экспрессии оптимизированного для бактерий M. smegmatis mc2 155 гена cyp102A1-LG23 в клетках E. сoli, при этом продукция цитохрома CYP102A1-LG23 и его растворимость не зависели от мутации 211N/AAC (211T/ACC). Функциональное тестирование in vitro с экспрессированными в E. coli белковыми продуктами показало высокую эффективность и селективность 7β-гидроксилирования андростендиона (АД) гетерологическим цитохромом с образованием 7β-OH-AД (82 - 91% моль/моль) уже в первые часы инкубации. Наличие мутации 211N/AAC не влияло на скорость и уровень образования 7β-OH-AД. 7β-Гидроксипроизводные были также основными продуктами при трансформации других 3-оксостероидов, таких как андростадиендион (АДД), тестостерон и 9а-гидроксиандростендион. При этом АДД являлся менее предпочтительным, в сравнении с АД, субстратом для CYP102A1-LG23. При использовании в качестве субстрата дегидроэпиандростендиона (ДГЭА), отличающегося наличием 3-гидрокси-5-ен-структуры, стереоспецифичность реакции гидроксилирования снижается: обе формы CYP102A1-LG23 (мутантная 211N/AAC и LG23 дикого типа) конвертируют ДГЭА в смесь 7α-, так и 7β- эпимеров (7α-OH-ДГЭА + 7β-OH-ДГЭА) с превалированием 7α-формы. Выявлено также образование 7-кето-ДГЭА. Созданный синтетический цитохром может проявляет активность также в отношении других стероидных соединений, таких как эстрон и литохолевая кислота. Таким образом, за прошедший первый год проекта нами были спроектированы и синтезированы четыре варианта кодирующей последовательности мутантного цитохрома CYP102A1-LG23. На основе этих ДНК последовательностей были созданы плазмидные конструкции для экспрессии этих генов в бактериях Escherichia coli. Проведенное функциональное тестирование in vitro с экспрессированными в E. coli белковыми продуктами показало, что при использовании в качестве субстратов 3-оксо-4-ен-стероидов ряда андростана происходит их конверсия с образованием С7β- гидроксилированных андростанов, а 3-гидрокси-5-ен-стероиды могут трансформироваться с образованием соответствующих аллильных 7а- и 7b-спиртов. H2 Модификация стероидов андростанового ряда биотехнологически значимым штаммом мицелиального гриба Drechslera sp. F-34. Транскриптомный анализ мицелия, выращенного в различных условиях индукции, выявление генов новых стероидных цитохром-P450 монооксигеназ и оксидоредуктаз. Штамм Drechslera sp. Ph F-34 был выявлен как один из наиболее эффективных на этапе предварительного широкого скрининга мицелиальных грибов, представляющих отделы Ascomycota и Zygomycota. В ходе настоящей работы была изучена модификация стероидов андростанового ряда: андроста-1,4-диен-3,17-диона (АДД), андрост-4-ен-17β-ол-3-она (тестостерон, ТС) и андрост-5-ен-3β,17β-диола (дегидроэпиандростерона, ДГЭА) отмытым мицелием Drechslera sp. Ph F-34. В качестве потенциальных индукторов стероид трансформирующей активности клеток мицелия оценивали стероиды андростанового (андростендион (АД), АДД, ДГЭА), прегнанового (прогестерон, прегненолон) и холанового ряда (литохолевая кислота (ЛХК)), а также β-ситостерин. Ингибиторный анализ проводили с использованием циклогексимида (ЦГ) и хлорамфеникола (ХФЛ). Структура стероидных метаболитов была подтверждена с использованием методов ТСХ, ВЭЖХ, масс-спектрометрии (МС), 1Н и 13С ЯМР спектроскопии. С использованием ингибиторного анализа (с использованием циклогексимида, ЦГ) подтвержден конститутивный характер 17β-гидроксистероиддегидрогеназы (17β-ГСД) Drechslera sp., осуществляющей восстановление 17-кетогруппы АДД и ДГЭА с образованием 1(2)-дегидротестостреона (дгТС) и андростендиола, соответственно, и индуцибельность 7-гидроксилазной ферментативной системы, ответственной за проведение реакций 7-гидроксилирования. Выявлено, что 17β-ГСД Drechslera sp. Более активна в отношении 3-оксо-1,4-диенстероидов (АДД), чем в отношении 3β-ол-5-енстероидов (ДГЭА). Произведена оценка стероидов андростанового (андростендион (АД), АДД, ДГЭА), прегнанового (прогестерон, прегненолон) и холанового ряда (литохолевая кислота, ЛХК), а также β-ситостерина в качестве индукторов синтеза 7-гидроксилазы в клетках мицелия Drechslera sp. Максимальный индуцирующий эффект выявлен для ДГЭА и снижается в ряду ДГЭА>прогестерон>АД>ТС>АДД>прегненолон>ЛХК. β-Ситостерин не является индуктором синтеза стероидной 7-гидроксилазы в клетках Drechslera sp.. Ингибирующий эффект ЦГ и отсутствие влияния ХФЛ на синтез стероидной 7-гидроксилазы в клетках мицелия указывает на иную, чем митохондриальную природу 7-монооксигеназы. Показана зависимость стереоположения вводимой гидроксильной группы от структуры стероида. Присутствие 1,2-двойной связи (АДД) или 3β-гидроксильной группы в сочетании с 5(6)-двойной связью (ДГЭА) способствует введению гидроксильной группы клетками отмытого мицелия Drechslera sp. преимущественно в положение 7β, в то время как присутствие 17β-восстановленной группы в структуре стероида (дгТС, андростендиол) смещает положение введения гидроксильной группы в сторону C7α. Проведено высокопроизводительное секвенирование и транскриптомный анализ клеток мицелия гриба Drechslera sp., выращенных в различных условиях индукции дегидроэпиандростероном. Выделены и секвенированы мРНК клеток контрольного и индуцированного ДГЭА мицелия Dreshslera sp., осуществлена сборка транскриптома de novo и его аннотация. На основании анализа дифференциальной экспрессии выявлено 15 генов, уровень экспрессии которых в большей степени возрастал в ответ на индукцию клеток мицелия стероидным субстратом. Среди них идентифицированы дифференциально экспрессирующиеся гены цитохром-Р450-монооксигеназ, предположительно связанные с 7-гидроксилированием стероидов андростанового ряда в клетках культуры гриба. Среди транскриптов штамма гриба Drechslera sp. с использованием поиска по консервативным доменам выявлен ген cpr (ORF 2091 п.о.), предположительно кодирующий синтез НАДФН-цитохром Р450 редуктазы (CPR), уровень экспрессии которого в клетках контрольного и индуцированного ДГЭА мицелия Drechslera sp. был сопоставим, что свидетельствует в пользу конститутивной природы НАДФН-цитохром Р450 редуктазы. H2 Конструирование плазмидных генетических конструкций, способных к автономной репликации в клетках модельных штаммов бактерий и кодирующих гены актинобактериальных цитохромов P450 стероид-С26-гидроксилаз как одиночно, так и совместно с кДНК редокс-партнеров в составе полицистронных искусственных оперонов. 27-Гидроксихолестерин (26-гидроксихолестерин), начальный интермедиат окисления холестерина актинобактериями, образуется за счет активности белков суперсемейства P450-монооксигеназ. В клетках M. smegmatis функционируют как минимум две стероид-C26-гидроксилазы этого семейства: CYP125A3 и CYP142A2 , ортологичные Р450-монооксигеназам, обнаруженным в других актинобактериях (Rosłoniec et al., 2009; Capyk et al., 2009). В ходе работ отчетного периода сконструированы плазмидные генетические конструкции, кодирующие гены цитохромов P450 стероид-С26-гидроксилаз CYP125A3 и CYP142A2. ДНК-последовательности генов MSMEG_5995 и MSMEG_5918, кодирующих две бактериальные цитохромы P450 стероид-C26-монооксигеназы CYP125A3 и CYP142A2 были амплифицированы с хромосомной матрицы штамма Mycolicibacterium smegmatis mc2155. Полученные ампликоны были клонированы по рестрикционным сайтам NdeI и HindIII в плазмидном векторе pET28a под контролем индуцибельного промотора фага T7 с образованием рекомбинантных плазмид pETA3 и pETA2 для последующей экспрессии генов cyp125A3 и cyp142A2 соответственно в клетках E.coli. В результате переноса исследуемых ДНК-последовательностей в челночный плазмидный вектор pMVT61 под контроль индуцибельного ацетамидазного промотора были получены генетические конструкции pVA3 и pVA2, позволяющие при необходимости осуществлять контролируемую экспрессию генов монооксигеназ в клетках миколицибактерий. Для обеспечения транспорта электронов к гетерологичным цитохромам P450 были использованы «суррогатные» окислительно-восстановительные партнеры: адренодоксин (Adx) и адренодоксинредуктазу (AdR) коры надпочечников быка. кДНК-фрагменты редокс-партнеров Adx-AdR с рибосомсвязывающими сайтами [RBS_Adx_RBS_AdR] были интегрированы по сайту рестрикции HindIII в плазмиды pETA3, pETA2, pVA3 и pVA2 с получением конструкций pETA3AA, pETA2AA, pVA3AA и pVA2AA, несущих трицистронные опероны клонированных генов. Сконструированные на основе векторов pET28a и pMVT61 рекомбинантные плазмиды были валидированы секвенированием и перенесены соответственно в клетки E. coli BL21(DE3) и M. smegmatis groEL1ΔC для последующей (ко-)экспрессии целевых генов. Осуществлен биоинформатический поиск белковых партнеров, нативно функционирующих совместно с CYP125A3 и CYP142A2 в клетках M. smegmatis. Выявлены ДНК-последовательности генов, кодирующих ферредоксины FdxD и FdxE, а также ферредоксинредуктазы FdrA и FprA, ортологичные известным белкам других актинобактерий. Амплифицированные с хромосомы M. smegmatis mc2155 ДНК-фрагменты, несущие гены fdxD (MSMEI_5744), fdxE (MSMEI_2499), fdrA (MSMEI_ 1381) и fprA (MSMEI_2039), были поодиночно клонированы в векторе pET28a. Полученными конструкциями pETD, pETE, pETFd и pETFp были трансформированы клетки E. coli BL21(DE3). Таким образом, были получены рекомбинантные бактериальные штаммы, позволяющие осуществлять экспрессию генов стероид-C26-монооксигеназ CYP125A3 и CYP142A2 как одиночно, так и совместно с генами «суррогатных» редокс-партнеров, а также осуществлять биосинтез белков M. smegmatis, осуществляющих перенос электронов к цитохромам P450. Результаты проведенных исследований опубликованы в виде статей, а также обнародованы на научных конференциях.

 

Публикации

1. - Ферменты грибов удешевят производство стероидов Научная Россия, 18.11.2021 (год публикации - ).

2. Брагин Е.Ю., Довбня Д.В., Донова М.В. Выявление генов, характерных для бактерий, обладающих стероидным катаболизмом. VII Пущинская школа-конференция "Биохимия, физиология и биосферная роль микроорганизмов" (6-9 декабря 2021 г.) Пущино, Сборник тезисов С. 129-130 (год публикации - 2021).

3. В. Коллеров, А. Шутов, А. Казанцев, М. Донова Hydroxylation of pregnenolone and dehydroepiandrosterone by zygomycete Backusella lamprospora VKM F-944. Selective production of 7α-ОН-DHEA Applied Microbiology and Biotechnology, - (год публикации - 2022).

4. Дещеревская Н.О., Казанцев А.В., Донова М.В. Трансформация холевой кислоты психрофильными бактериями родов Psychrobacter и Arthrobacter. VII Пущинская школа-конференция "Биохимия, физиология и биосферная роль микроорганизмов" (6-9 декабря 2021 г.) Пущино, Сборник тезисов С. 226-228 (год публикации - 2021).

5. Донова М.В., Ивашина Т.В., Довбня Д.В., Карпов М.В., Брагин Е.Ю., Стрижов Н.И. Инженерия микробных продуцентов ценных изопреноидных синтонов на основе актинобактерий рода Mycolicibacterium VII Пущинская школа-конференция "Биохимия, физиология и биосферная роль микроорганизмов" (6-9 декабря 2021 г.) Пущино, Сборник тезисов С. 140-141 (год публикации - 2021).

6. Донова М.В., Стрижов Н.И., Ивашина Т.В.. Довбня Д.В., Карпов М.В., Брагин Е.Ю Актинобактерии рода Mycolicibacterium как платформа для создания микробных продуцентов ценных стероидных соединений 3-й Российский микробиологический конгресс, материалы конгресса / Псков: ООО «Конкорд», 2021, с. 37 (год публикации - 2021).

7. Карпов М.В., Николаева В.М., Фокина В.В., Шутов А.А., Казанцев А.В., Стрижов Н.И., Донова М.В. Конструирование и функциональный анализ рекомбинантных штаммов Mycolicibacterium smegmatis, несущих гетерологичные гены стероидных монооксигеназ 3-й Российский микробиологический конгресс, материалы конгресса / Псков: ООО «Конкорд», 2021, с. 92 (год публикации - 2021).

8. Карпов М.В., Николаева В.М., Фокина В.В., Шутов А.А., Казанцев А.В., Стрижов Н.И., Донова М.В. Конструирование и функциональный анализ рекомбинантных штаммов Mycolicibacterium smegmatis, несущих гены бациллярных цитохромов CYP106A1 и CYP106A2 Биотехнология, Т. 37, № 6, С. 26-39 (год публикации - 2021).

9. Коллеров В.В., Тарлачков С.В., Шутов А.А., Донова М.В Разработка подходов к повышению селективности гидроксилирования стероидов микромицетом Drechslera sp. Ph F-34. 3-й Российский микробиологический конгресс, материалы конгресса / Псков: ООО «Конкорд», 2021, с. 200 (год публикации - 2021).

10. Коллеров В.В., Шутов А.А., Казанцев А.А., Донова М.В. Steroid modification by filamentous fungus of Drechslera sp.: focus on 7-hydroxylase and 17β-hydroxysteroid dehydrogenase activities Fungal Biology, 2021 (год публикации - 2021).

11. Коллеров В.В., Шутов А.А., Тарлачков С.В., Донова М.В. 17β-Гидроксистероид дегидрогеназная и 7-гидроксилазная активность грибного штамма Drechslera sp.: специфичность, индуцибельность, транскриптомный анализ VII Пущинская школа-конференция "Биохимия, физиология и биосферная роль микроорганизмов" (6-9 декабря 2021 г.) Пущино, Сборник тезисов С. 247-249 (год публикации - 2021).

12. Лобастова Т.Г., Фокина В.В., Донова М.В. Конверсия холестерина термофильными актинобактериями VII Пущинская школа-конференция "Биохимия, физиология и биосферная роль микроорганизмов" (6-9 декабря 2021 г.) Пущино, Сборник тезисов С. 251-252 (год публикации - 2021).

13. С. Хомутов, А. Шутов, А. Аверин, Д. Довбня, М. Донова Laccase - mediated oxidation of steroid alcohols in the presence of methylated β-cyclodextrin: from inhibition to selective synthesis Journal of Chemical Technology and Biotechnology, - (год публикации - 2021).

14. Т. Лобастова, В. Фокина, С. Тарлачков, А. Шутов, Е. Брагин, А. Казанцев, М. Донова Steroid Metabolism In Thermophilic Actinobacteria Saccharopolyspora hirsuta VKM Ac-666 Microorganisms, 9, 2554-72 (год публикации - 2021).

15. Текучева Д.Н., Фокина В.В., Николаева В.М., Шутов А.А., Карпов М.В., Донова М.В. Каскадная биоконверсия фитостерина в тестостерон штаммами Mycolicibacterium neoaurum ВКМ Ас-1815Д и Nocardioides simplex ВКМ Ас-2033Д Микробиология, 2022, Т. 91, №3 (год публикации - 2022).

16. Фокина В.В., Брагин Е.Ю., Шутов А.А., Донова М.В. Холестериноксидаза актинобактерий Nocardioides simplex. VII Пущинская школа-конференция "Биохимия, физиология и биосферная роль микроорганизмов" (6-9 декабря 2021 г.) Пущино, Сборник тезисов С. 284-286 (год публикации - 2021).

17. Фокина В.В., Шутов А.А., Брагин Е.Ю., Донова М.В. Секретируемая холестериноксидаза Nocardioides simplex BKM Ac-2033D. 3-й Российский микробиологический конгресс, материалы конгресса / Псков: ООО «Конкорд», 2021, с. 274 (год публикации - 2021).

18. Фуфаева С. Р., Ивашина Т. В., Довбня Д. В., Шутов А. А., Донова М. В. Гетерологическая экспрессия гена kstD2 из Nocardioides simplex ВКМ Ac-2033Д в клетках миколицибактерий 3-й Российский микробиологический конгресс, материалы конгресса / Псков: ООО «Конкорд», 2021, с. 276-277 (год публикации - 2021).

19. Фуфаева С.Р., Довбня Д.В., Ивашина Т.В., Шутов А.А., Донова М.В. Анализ функции гена kstD2 из Nocardioides simplex ВКМ Ас-2033Д. VII Пущинская школа-конференция "Биохимия, физиология и биосферная роль микроорганизмов" (6-9 декабря 2021 г.) Пущино, Сборник тезисов С. 286-288 (год публикации - 2021).


Аннотация результатов, полученных в 2022 году
В соответствии с заявленным планом работы проводились по трем основным направлениям (Н1, Н2, Н3). H1 - Выбраны перспективные штаммы миколицибактерий для введения направленных мутаций. Получена серия генетических конструкций, необходимых для нокаута целевых генов, вовлечённых в деградацию боковой цепи стеринов на уровне C24-C22-интермедиатов. Оптимизирован протокол введения рекомбинантной ДНК в клетки M. fortuitum Ac-1817D. Получены мутанты Ac-1817D с нокаутом гена 3-кетостероид-1-дегидрогеназы - ksdD (G155_04625). Получен мутантный штамм M. neoaurum B-3805ΔkstDΔfadA5 с нокаутом гена ацетил-КоА ацетилтрансферазы fadA5. Показано, что у M. neoaurum B-3805 продукт гена fadA5 играет основную роль в перенаправлении катаболического потока в сторону преимущественного накопления C24-стероидов при деградации фитостеринов. Сконструированы мутантные штаммы M. neoaurum B-3805ΔkstDΔopccR с нокаутом гена opccR ацил-КоА редуктазы и 21-оксостероид редуктазы и M. neoaurum B-3805ΔkstDΔhsd4A с нокаутом гена hsd4A β-гидроксиацил-КоА дегидрогеназы. Установлено, что продукт гена opccR не является определяющим в образовании 20-гидроксиметилпрегненона (20-ГМП) у M. neoaurum B-3805, в то время как нокаут hsd4A позволяет перенаправить метаболический поток в сторону накопления 20-ГМП, выход которого в оптимизированных условиях достигает 95% (мольн.). Результаты отличаются от ранее опубликованных данных о ключевой роли opccR в повышении выхода 20-ГМП [Peng et al. 2020]. - Основные продукты биотрансформации фитостерина мутантным штаммом M. smegmatis mc2 155ΔfadD3 выделены и очищены до кристаллического состояния. Их структуры идентифицированы методами масс-спектрометрии и ЯМР-спектроскопии как, 3aα-H-4α(3'-пропаноат)-7aβ-метилгексагидро-1,5-индандион (ГИП) и 4аα-гидрокси-6аβ-метилдекагидроциклопента-[f]хромен-7(8H)-он (4a-ГМДЦ). Разработан лабораторный метод биотрансформации фитостерина в ГИП на уровне культуральных колб с применением мутантного клона M. smegmatis mc2 155ΔfadD3. Метод обеспечивает высокий выход целевого стероида при высоких (до 40 г/л) нагрузках фитостерина и перспективен для практического применения. H1.2 Осуществлено высокопроизводительное секвенирование полных транскриптомов культур термофильной актинобактерии Saccharopolyspora hirsuta, выращенных в различных условиях индукции холестерином. Результаты валидированы с помощью метода RT-PCR. Выявлены гены, увеличивающие экспрессию в присутствии холестерина, в том числе, гены, связанные с С26-гидроксилированием холестерина (cyp125) и его дальнейшим окислением (kstD3, kshA, ipdF, fadE30). Степень активации транскрипции генов коррелировала с низкой скоростью конверсии холестерина и образования интермедиатов окисления боковой цепи. Получены данные, свидетельствующие о том, что гены стероидного катаболизма у этой термофильной актинобактерии связаны функционально, но не на уровне регуляции транскрипции. Н2.1 Сконструированы комплекты рекомбинантных плазмид для гетерологической экспрессии генов мутантного бациллярного цитохрома CYP102A1-LG23 в бактериальных хозяевах: E. coli и M. smegmatis, а также генов, кодирующие глюкозодегидрогеназу PmGDH и глюкозо-6-фосфатдегидрогеназу MtG6PDH2. Для обоих бациллярных белков CYP102A1-LG23 и PmGDH смоделированы и синтезированы два варианта генов: дикого типа и оптимизированного для экспрессии в микобактериях. При использовании моноцистронных конструкций в клетках E. coli наблюдался высокий уровень экспрессии обоих генов cyp102a1-LG23 и gdh223. При коэкспрессии cyp102a1-LG23 и gdh223 в клетках снижался уровень синтеза как GDH, так и BM3-LG23, по сравнению с рекомбинантами, где эти гены представлены индивидуально. Оба синтезированных белка в клетках E. coli были представлены растворимыми формами и не отличались по целевой активности. Ген цитохрома с кодирующей последовательностью дикого типа не экспрессировался в клетках микобактерий, в отличие от высокого уровня синтеза этого белка с ДНК, оптимизированной для M. smegmatis. Присутствие ДНК фрагмента, кодирующего на N-конце CYP102A1-LG23 20-аминокислотного экстрапептида с 6xHis-tag обусловливало перевод значительной части синтезированного в микобактериях белкa этого цитохрома в нерастворимую форму. Удаление данного фрагмента способствовало повышению растворимости CYP102A1-LG23. Рекомбинантные штаммы M. smegmatis mc2155 Δ(kshB, kstD), гетерологически экспрессирующие бациллярный цитохром, осуществляли 7β-гидроксилирование АД, с максимальным выходом, отмеченным для штаммов, коэкспрессирующих цитохром P450 CYP102a1-LG23 с MtG6PDH. H2.2 Выявленный в ходе полнотрансриптомного анализа гриба Drechslera sp. кандидатный ген (cyp1) 7β-гидроксилазы (цитохром P450-монооксигеназы) и ген его редокс-партнера - НАДФН-цитохром Р450 редуктазы (CPR) были экспрессированы в бактериях E. сoli BL 21 DE(3). Функциональный анализ активности рекомбинантных ферментов in vitro подтвердил способность CYP1 к осуществлению гидроксилирования ДГЭА в положениях 7β и 7α. - Изучена биокаталитическая активность гриба Backusella lamprospora ВКМ F-944 в отношении 3-гидрокси-5-ен-стероидов. С помощью ингибиторного анализа подтвержден индуцибельный характер 7α-гидроксилазы и ее иная, чем митохондриальная, внутриклеточная локализация. ДГЭА оказывал максимальный индуцирующий эффект среди 9 протестированных потенциальных индукторов . Наряду с целевой гидроксилазной активностью штамм проявлял 17β-гидроксистероиддегидрогеназную (17-ГСД) активность. Подтвержден конститутивный характер 17-ГСД. Основными продуктами трансформации прегненолона B. lamprospora являлись 11α-ОН-прегненолон (18-20%) и 7α,11α-диОН-прегненолон (до 5%). - Аскомицет Gibberella zeae VKM F-2600 способен к образованию ценной урсодеоксихолевой кислоты (УДХК) за счет 7β-гидроксилирования литохолевой кислоты (ЛХК). С целью улучшения продуктивности гриба оптимизирована процедура протопластирования и мутагенеза. Найдены условия, обеспечивающие максимальный выход протопластов и их эффективную регенерацию . Получен мутантный штамм, по продуктивности образования УДХК превосходящий все известные аналоги. H2.3 Получены результаты, свидетельствующие о том, что гетерологическая экспрессия генов, кодирующих цитохромы P450 стероид-26-монооксигеназы CYP125A3 и CYP142A2 у миколицибактерий в клетках E.coli BL21(DE3) как одиночно, так и совместно с генами “суррогатных” редокс-партнеров – адренодоксина и адренодоксинредуктазы млекопитающих не обеспечивает образование С26-гидроксихолестерина в клетках E.coli BL21(DE3). Рекомбинантные гидроксилазы CYP125A3 и CYP142A2 очищены с помощью аффинной хроматографии. Осуществлена гетерологическая экспрессия генов, кодирующих нативные редокс партнеры у миколицибактерий. Получены гомогенные белковые препараты ферредоксина FdxE и двух ферредоксинредуктаз: NADH-зависимой FdrA и NADPH-зависимой FprA, подтверждена их функциональность в экспериментах in vitro. H3 Разработан эффективный метод ВЭЖХ с градиентной элюцией для профилирования и количественного анализа C19 - С24 стероидов - продуктов окисления боковой цепи стеринов. Метод адаптирован для автоматизированного микропрепаративного выделения очищенных фракций стероидов. Разработаны методы ВЭЖХ с изократической элюцией для профилирования и рутинного анализа изопреноидных продуктов биотрансформации и для микропрепаративного разделения инданов – продуктов глубокого окисления стеринов. Разработаны методы анализа С26-гидроксистероидов с 3-кето и 3-гидроксиструктурой, а также гидроксипроизводных с различным положением и стереоориентацией гидроксильных групп в стероидном ядре. Структуры ряда стероидных соединений подтверждены с помощью методов масс-спектрометрии и ямр-спектроскопии.

 

Публикации

1. - Ставка на лошадку Биологи приручают микроорганизмы для адресной доставки лекарств газета "ПОИСК", N11-12 от 18 марта 2022 г., стр. 12-13 (год публикации - ).

2. - Ген в нокауте Российская газета, https://rg.ru/2022/04/26/uchenye-vedushchih-institutov-rasskazali-o-rossijskih-razrabotkah-v-sfere-farmakologii.html (год публикации - ).

3. - Мицелиальный гриб синтезирует лекарства для лечения печени Сайт_РНФ_пресс_релиз, Пресс-релиз опубликовали на сайте РНФ: https://www.rscf.ru/news/release/mitselialnyy-grib-sintez-lekarstva-dlya-lecheniya-pecheni/ (год публикации - ).

4. - Интервью Телеканал 360, https://vk.com/video-183088286_456239595?list=33490b60874d88b119 (год публикации - ).

5. - Гриб научился синтезировать лекарство от болезней печени Подмосковье-life 360tv, - (год публикации - ).

6. А.В. Свиридов, М.В. Карпов, В.В. Фокина, М.В. Донова Cholesterol assay based on recombinant cholesterol oxidase, ABTS and horseradish peroxidase Microbial Steroids - Methods and Protocols (2nd Edition), - (год публикации - 2023).

7. Бяков А., Карпов М., Стрижов Н., Донова М. Создание и характеристика Mycolicibacterium smegmatis mc2 155 с делециями в генах, кодирующих ферменты окисления стеринов WoS conferences, - (год публикации - 2022).

8. Бяков А.А., Карпов М.В., Стрижов Н.И., Шутов А.А., Донова М.В. Биоконверсия холестерина рекомбинантными штаммами Mycolicibacterium smegmatis с мутациями в генах окисления боковой цепи. VIII Пущинская конференция «Биохимия, физиология и биосферная роль микроорганизмов», Школа-конференция молодых ученых, аспирантов и студентов «Генетические технологии в микробиологии и микробное разнообразие»: сборник тезисов. М.: ГЕОС, 2022. 294 с., Материалы VIII Пущинской школы-конференции «Биохимия, физиология и биосферная роль микроорганизмов». – Пущино, 2022. – С. 114-115 (год публикации - 2022).

9. В.В. Коллеров, А.А. Шутов, М.В. Донова Selective microbial conversion of DHEA into 7α-ОН-DHEA Microbial Steroids - Methods and Protocols (2nd Edition), - (год публикации - 2023).

10. В.В. Фокина, М.В. Карпов, В.В. Коллеров, Е.Ю. Брагин, Л.О. Эпиктетов, А.В. Свиридов, А.В. Казанцев, А.А. Шутов, М.В. Донова Recombinant Extracellular Cholesterol Oxidase from Nocardioides simplex Biochemistry (Moscow), 2022, 87 (9), pp. 903-915 (год публикации - 2022).

11. Вячеслав Коллеров, Марина Донова Ursodeoxycholic acid production by Gibberella zeae mutants AMB Express, 12 : 105 (год публикации - 2022).

12. Д.В. Довбня, Е.Ю. Брагин, Т.В. Ивашина, М.В. Донова Draft Genome Sequence of Mycolicibacterium smegmatis VKM Ac-1171 contains full set of sterol catabolic genes Microbial Resource Announcement, 2022, e00772-22 (год публикации - 2022).

13. Д.В. Довбня, Т.В. Ивашина, С.М. Хомутов, А.А. Шутов, Н.О. Дещеревская, М.В. Донова Obtaining of 24-norchol-4-ene-3,22-dione from phytosterol with mutants of Mycolicibacterium neoaurum Microbial Steroids - Methods and Protocols (2nd Edition), - (год публикации - 2023).

14. Д.Н. Текучева, В.М. Николаева, М.В. Карпов, Т.А. Тимакова, А.А. Шутов, М.В. Донова Bioproduction of testosterone from phytosterol by Mycolicibacterium neoaurum strains: “one-pot”, two modes Bioresources and Bioprocessing, 2022. 116. P. 2-14 (год публикации - 2022).

15. Довбня Д.В., Брагин Е.Ю., Ивашина Т.В., Шутов А.А., Донова М.В. Стерин-деградирующая активность и геномная последовательность Mycolicibacterium smegmatis ВКМ Ac-1171. VIII Пущинская конференция «Биохимия, физиология и биосферная роль микроорганизмов», Школа-конференция молодых ученых, аспирантов и студентов «Генетические технологии в микробиологии и микробное разнообразие»: сборник тезисов. М.: ГЕОС, 2022. 294 с., Материалы VIII Пущинской школы-конференции «Биохимия, физиология и биосферная роль микроорганизмов». – Пущино, 2022. – С. 126-128. (год публикации - 2022).

16. Коллеров В.В., Донова М.В. Протопластирование и мутагенез грибной культуры Gibberella zeae ВКМ F-2600: получение активных продуцентов урсодезоксихолевой кислоты. VIII Пущинская конференция «Биохимия, физиология и биосферная роль микроорганизмов», Школа-конференция молодых ученых, аспирантов и студентов «Генетические технологии в микробиологии и микробное разнообразие»: сборник тезисов. М.: ГЕОС, 2022. 294 с., Материалы VIII Пущинской школы-конференции «Биохимия, физиология и биосферная роль микроорганизмов». – Пущино, 2022. – С. 246-248 (год публикации - 2022).

17. Коллеров В.В., Шутов А.А., Казанцев А.В., Донова М.В. Hydroxylation of pregnenolone and dehydroepianrosterone by zygomycete Backusella lamprospora VKM F-944: selective production of 7a-OH-DHEA Applied Microbiology and Biotechnology, 2022, 106(2), p. 535-548 (год публикации - 2022).

18. Лобастова Т., Фокина В., Позднякова-Филатова И., Тарлачков С., Донова М. Insight into Different Stages of Steroid Degradation in Thermophilic Saccharopolyspora hirsuta VKM Ac-666T Strain International Journal of Molecular Sciences, - (год публикации - 2022).

19. Лобастова Т.Г., Фокина В.В., Тарлачков С.В., Брагин Е.Ю., Донова М.В. Влияние температуры на экспрессию генов термофильного штамма Saccharopolyspora hirsuta ВКМ Ac-666Т при биоконверсии холестерина. VIII Пущинская конференция «Биохимия, физиология и биосферная роль микроорганизмов», Школа-конференция молодых ученых, аспирантов и студентов «Генетические технологии в микробиологии и микробное разнообразие»: сборник тезисов. М.: ГЕОС, 2022. 294 с., Материалы VIII Пущинской школы-конференции «Биохимия, физиология и биосферная роль микроорганизмов». – Пущино, 2022. – С. 170-172 (год публикации - 2022).

20. М.В. Донова Microbial Steroid Production Technologies: Current Trends and Prospects Microorganisms, 2022, 10, 53 (год публикации - 2022).

21. М.В. Карпов, В.М. Николаева, В.В. Фокина, А.А. Шутов, А.В. Казанцев, Н.И. Стрижов, М.В. Донова Creation and Functional Analysis of Mycolicibacterium smegmatis Recombinant Strains Carrying the Bacillary Cytochromes CYP106A1 and CYP106A2 Genes Applied Biochemistry and Microbiology, 2022, Vol. 58, No. 9, pp. 1–11 (год публикации - 2022).

22. Пошехонцева В.Ю., Стрижов Н.И., Сазонова О.И., Николаева В.М., Шутов А.А., Донова М.В. Создание и функциональный анализ рекомбинантных штаммов Escherichia coli, несущих ген мутантного цитохрома Р450 ВМ3 VIII Пущинская конференция «Биохимия, физиология и биосферная роль микроорганизмов», Школа-конференция молодых ученых, аспирантов и студентов «Генетические технологии в микробиологии и микробное разнообразие»: сборник тезисов. М.: ГЕОС, 2022. 294 с., Материалы VIII Пущинской школы-конференции «Биохимия, физиология и биосферная роль микроорганизмов». – Пущино, 2022. – С. 191-193 (год публикации - 2022).

23. Т.А. Тимакова, В.В. Фокина, Т.В. Бубнова, В.А. Немашкалов, М.В. Донова Optimization of growth conditions for the testosterone-producting Mycolicibacterium neoaurum strain Opera Med. Physiol., 9, 3, 98-104 (год публикации - 2022).

24. Фокина В.В., Карпов М.В., Коллеров В.В., Брагин Е.Ю., Эпиктетов Д.О., Шутов А.А., Свиридов А.В., Донова М.В. Рекомбинантная холестериноксидаза из Nocardioides simplex VIII Пущинская конференция «Биохимия, физиология и биосферная роль микроорганизмов», Школа-конференция молодых ученых, аспирантов и студентов «Генетические технологии в микробиологии и микробное разнообразие»: сборник тезисов. М.: ГЕОС, 2022. 294 с., Материалы VIII Пущинской школы-конференции «Биохимия, физиология и биосферная роль микроорганизмов». – Пущино, 2022. – С. 209-211 (год публикации - 2022).

25. Хомутов С.М., Шутов А.А., Довбня Д.В., Донова М.В. Циклодекстрины в лакказном окислении стероидных спиртов:от ингибирования к синтезу. VIII Пущинская конференция «Биохимия, физиология и биосферная роль микроорганизмов», Школа-конференция молодых ученых, аспирантов и студентов «Генетические технологии в микробиологии и микробное разнообразие»: сборник тезисов. М.: ГЕОС, 2022. 294 с., Материалы VIII Пущинской школы-конференции «Биохимия, физиология и биосферная роль микроорганизмов». – Пущино, 2022. – С. 276-278. (год публикации - 2022).

26. Яппаров Р.Р., Фокина В.В., Донова М.В. Ферментный препарат на основе клеток Nocardioides simplex для получения ценных 1(2)-дегидрированных 3-кетостероидов. VIII Пущинская конференция «Биохимия, физиология и биосферная роль микроорганизмов», Школа-конференция молодых ученых, аспирантов и студентов «Генетические технологии в микробиологии и микробное разнообразие»: сборник тезисов. М.: ГЕОС, 2022. 294 с., Материалы XIII Пущинской школы-конференции «Биохимия, физиология и биосферная роль микроорганизмов». – Пущино, 2022. – С. 223-225 (год публикации - 2022).