КАРТОЧКА ПРОЕКТА,
ПОДДЕРЖАННОГО РОССИЙСКИМ НАУЧНЫМ ФОНДОМ

Информация подготовлена на основании данных из Информационно-аналитической системы РНФ, содержательная часть представлена в авторской редакции. Все права принадлежат авторам, использование или перепечатка материалов допустима только с предварительного согласия авторов.

 

ОБЩИЕ СВЕДЕНИЯ


Номер 21-64-00006

НазваниеГенетические технологии создания моделей заболеваний, обусловленных нарушениями функционирования РНК

РуководительДонцова Ольга Анатольевна, Доктор химических наук

Организация финансирования, регионФедеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования «Московский государственный университет имени M.В.Ломоносова», г Москва

Годы выполнения при поддержке РНФ 2021 - 2024 

КонкурсКонкурс 2021 года «Проведение фундаментальных научных исследований и поисковых научных исследований по поручениям (указаниям) Президента Российской Федерации» (генетические исследования)

Область знания, основной код классификатора 04 - Биология и науки о жизни, 04-208 - Молекулярная биология

Ключевые словаРНК, РНК-белковые комплекс, модификация РНК, сплайсинг, трансляция, минипептид, антибиотик, редактирование генома, модель заболевания, РНК болезнь

Код ГРНТИ34.15.25


 

ИНФОРМАЦИЯ ИЗ ЗАЯВКИ


Аннотация
Одной из приоритетных задач направления «Генетические технологии для медицины» является создание моделей заболеваний с использованием культур клеток и лабораторных животных. Создание моделей заболеваний требует понимания механизмов развития патологии, а именно генетических детерминант, обусловливающих возникновение заболевания. Настоящий проект ставит перед собой несколько задач, направленных как на создание моделей заболеваний уже известной этиологии, так и на выявление новых генетических детерминант и механизмов, лежащих в основе изменения гомеостаза клетки и, как следствие, развития патологических состояний. В проекте будет применен биоинформатический анализ генетических структур с целью выявления новых детерминант, определяющих развитие генетически обусловленных патологий, а также самые современные методы редактирования геномов, такие как инактивация и редактирование генов с помощью системы CRISPR/Cas9, внедрение генов с помощью транспозонов и лентивирусов, а также с помощью сайт-специфических рекомбиназ бактериофагов. Будут проведено сравнительное исследование и оптимизация нескольких методов редактирования генома. В работе, проводящейся совместно с индустриальным партнером проекта ЗАО «БИОКАД», с помощью инактивации гена фактора свертывания крови IX будет создана модель гемофилии, которую индустриальный партнер будет использовать для разработки метода генной терапии этого заболевания. В план исследований в ходе реализации настоящего проекта входят различные задачи, имеющие целью как изучение фундаментальных основ влияния структурных особенностей РНК на программы экспрессии генетической информации, так и создание моделей заболеваний с использованием лабораторных животных и культур клеток. Такой широкий подход позволит определить ключевые аспекты влияния структурных особенностей РНК на реализацию программы экспрессии генома, а также предложить подходы к направленной регуляции экспрессии как конкретных генов, так и программы экспрессии генома в целом.

Ожидаемые результаты
В план исследований настоящего проекта входят различные задачи, имеющие целью как выявление новых генетических детерминант и механизмов, лежащих в основе изменения гомеостаза клетки и, как следствие, развития патологических состояний, так и создания генетических моделей заболеваний на основе лабораторных животных. Создание моделей митохондриопатий, приводящих к развитию оптической дистрофии, прогрессирующей энцефаломиопатии и периферической нейропатии, и мужского бесплодия на основе лабораторных животных позволит провести исследования механизмов развития патологий на уровне организма, а также заложить основу для разработки генно-терапевтических препаратов. Выявление генетических структур в результате биоинформатического анализа, а также применение генетических технологий для исследования роли РНК-модифицирующих ферментов в реализации генетической информации на уровне РНК в результате осуществления сплайсинга по альтернативным участкам позволит создать научный задел в целях идентификации новых мишеней направленной терапии социально-значимых заболеваний. Модели на основе лабораторных животных позволят выявить и описать механизмы развития патологий, возникающих в результате изменения программ сплайсинга, которые часто сопровождают, например, процессы опухолеобразования. Возникновение и закрепление антибиотикорезистентности бактерий становится все более угрожающей проблемой в современном мире. Неконтролируемое употребление антибиотиков приводит к появлению устойчивых штаммов болезнетворных бактерий, борьба с которыми представляет собой крайне актуальную задачу. В рамках настоящего проекта предстоит выявить новые генетические детерминанты, обусловливающие возникновение устойчивости бактерий к антибиотикам. Биоинформатический анализ позволит провести сопоставление генетических детерминант устойчивости к новому антибиотику с таковыми для известных антибиотиков. Полученные результаты будут использованы для выяснения генетических механизмов развития антибиотикорезистентности. В результате выполнения проекта будут получены несколько моделей заболеваний уже известной этиологии. Фундаментальные исследования позволят выявить новые генетические детерминанты, лежащие в основе перепрограмирования сплайсинга, определяющих развитие различных патологий. Направленная модификация выявленных генетических структур ляжет в основу создания новых моделей и изучения молекулярных механизмов патологических процессов. Предлагаемый подход позволит осуществлять эффективное использование генетических технологий для прорывных фундаментальных исследований механизмов функционирования клетки, создания моделей генетически-обусловленных заболеваний и создаст задел для создания новых генно-терапевтических препаратов.


 

ОТЧЁТНЫЕ МАТЕРИАЛЫ


Аннотация результатов, полученных в 2021 году
Проведено сравнение эффективности работы нескольких различных редакторов геномов, а также подходов внесения направленных мутаций путем гомологичной рекомбинации. Сделан вывод, что традиционный подход с использованием мРНК Cas9 и одноцепочечной олигонуклеотидной ДНК матрицы для гомологичной рекомбинации остается самым простым и достаточно эффективным способом внесения желаемых мутаций в геномную ДНК. На основе системы CRISPR/Cas9 успешно созданы генетические конструкции для инактивации генов FIX, NSUN7 и C12ORF65, с тем, чтобы с помощью инактивации выбранных генов создать модели гемофилии, мужского бесплодия и митохондриопатии. Подготовлен список генов, перспективных кандидатов в U6 мяРНК модифицирующие ферменты. Созданы линии клеток с инактивацией набора генов потенциальных РНК-метилтрансфераз. Создана и протестирована in vitro система из очищенных компонентов для изучения терминации митохондриальной трансляции. Существенно расширен инструментарий методов анализа событий альтернативного сплайсинга, включая также неаннотированные события. Разработанный метод был применен к анализу транскриптомов здоровых тканей человека из консорциума GTEx и части данных консорциума TCGA для количественной характеризации ткане- и опухолеспецифического сплайсинга. Данный результат был использован для получения списка генов с предсказанными дальними взаимодействиями во вторичной структуре пре-мРНК, предположительно влияющими на опухоле- и тканеспецифический сплайсинг. Несколько предсказанных событий альтернативного сплайсинга подтверждены экспериментально. В ходе поиска новых ингибиторов синтеза белка обнаружен антибиотик алтиомицин, для которого не известны молекулярные основы механизма действия. При помощи репортерной системы pDualrep2 показано, что малоизученное соединение макроцидин А нарушает синтез белка. Проведено исследование механизма действия и механизма возникновения устойчивости к новому антибиотику аурапланину. Оказалось, что данный антибиотик вызывает небольшие нарушения в точности трансляции, при этом механизм устойчивости связан с возникновением мутаций, некоторые из которых нарушают точность трансляции. При помощи метода криоэлектронной микроскопии обнаружен участок связывания аурапланина в 30S рибосомной субчастице. Оказалось, что участок связывания аурапланина отличается от мест связывания известных антибиотиков, а значит не будет обладать перекрестной устойчивостью с ними.

 

Публикации

1. Аверина О.А, Пермяков О.А., Григорьева О.О., Старшин А.С., Мазур А.М., Прохорчук Е.Б., Донцова О.А., Сергиев П.В. Comparative Analysis of Genome Editors Efficiency on a Model of Mice Zygotes Microinjection International Journal of Molecular Sciences, 22, 10221 (год публикации - 2021).

2. Иванов Т.М., Первушин Д.Д. Тандемные дупликации экзонов расширяют репертуар альтернативного сплайсинга Acta Naturae, - (год публикации - 2022).

3. Сергиев П.В., Рубцова М.П. Мал да удал. Биохимия, Т.86, №9, с.1366-13379 (год публикации - 2021).

4. Чичерин И.В., Духалин С.В., Ханнанов Р.А., Балева М.В, Левицкий С.А., Патрушев М.В., Сергиев П.В., Каменский П.А Functional diversity of mitochondrial peptydil-tRNAhydrolase ICT1 in human cells Frontiers in Molecular Biosciences, V.8, Article 716885 (год публикации - 2021).

5. Шляпина В., Корягина М., Василькова Д., Говорун В., Донцова О., Рубцова М. Human Telomerase RNA Protein Encoded by Telomerase RNA is Involved in Metabolic Responses Frontiers in Cell and Developmental Biology, V.9, Article 754611 (год публикации - 2021).


Аннотация результатов, полученных в 2022 году
В ходе работ прошедшего этапа с помощью направленного редактирования генома мышей были получены фаундеры мышиных моделей гемофилии, мужского бесплодия и митохондриопатий, содержащие нокауты генов FIX, C19ORF81 и C12ORF65 соответственно. Также, для исследования функциональной роли модификации РНК компонентов сплайсеосомы мы получили фаундеров линий мышей с инактивацией генов METTL4 и U6 мяРНК метилтрансферазы. Для поиска РНК субстрата РНК метилтрансферазы NSUN7, в соответствующий ген мышей внесли две модификации, а именно HA довесок на N-конец и Cys/Ala мутация в активный центр. Продуцируемых в полученной линии мышей мутантный вариант метилтрансферазы NSUN7 должен образовывать стабильные ковалентные соединения с РНК субстратом, которые можно выделить с помощью аффинной хроматографии и использовать для определения субстрата Определена метилтрансфераза, модифицирующая U6 мяРНК, и выявлен ее белок-партнер. Стабильных партнеров метилтрансферазы METTL4, модифицирующей U2 мяРНК, не обнаружено. Также обнаружено, что отсутствие метилирования U2 и U6 мяРНК влияет на экспрессию генов в клетке и альтернативный сплайсинг, например, происходит активация экспрессии генов интерферонового ответа и изменение соотношения изоформ альтернативного сплайсинга RPL22L1. Биоинформатический анализ данных консорциума GTEx выявил 590 тканеспецифических событий удержания интронов, для многих из которых предсказаны потенциальные регуляторы – РНК-связывающие белки. В частности, предсказана регуляция удержания интрона в гене BICD2, связанного со спинальной мышечной атрофией, фактором MBNL1. Изучены сигнатуры стволовости и пролиферации опухолей из консорциума TCGA и показано, что эти сигнатуры обладают значительной гетерогенностью, как на уровне тканей и опухолей, так и на уровне индивидуальных клеток. При помощи LNA-миксмеров скринированы десять генов человека с предполагаемыми РНК-структурами, влияющими на сплайсинг. Показано, что в гене BRD2, кодирующем транскрипционный фактор из семейства белков BET, разрушение РНК-структуры качественно влияет на включение экзона 2а. В гене TCF3, в котором ранее наблюдалось изменение сплайсинга в ответ на разрушение РНК-структуры LNA-миксмерами, при помощи мутагенеза в репортерном минигене подтверждено влияние РНК-структуры на альтернативный сплайсинг экзона 18а. Установлено, что кОРС DDX23 эффективно транслируется и подавляет трансляцию основной ОРС. Получены клеточные линии с мутацией в кОРС, которые можно использовать для выяснения ее функциональной роли. В ходе работы с ингибитором биосинтеза белка алтиомицином было показано, что он ингибирует трансляцию на этапе элонгации. Были отобраны устойчивые к алтиомицину клоны. Была получена структура комплекса алтиомицина с рибосомой. Для антибиотиков макроцидинов А и Z было показано, что рибосома не является их основной мишенью в клетке бактерий. При помощи репортерной системы pDualrep2 был обнаружен антибиотик боттромицин А2, для него ранее было показано, что он ингибирует синтез белка, однако детально этот процесс изучен не был. Для антибиотика аурапланина было показано, что он обладает антагонистическим действием по отношению к стрептомицину.

 

Публикации

1. Аверина О.А., Лаптев И.Г., Емельянова М.А., Пермяков О.А., Марьясина С.С., Никифорова А.И., Манских В.Н., Григорьева О.О., Болихова А.К., Калабин Г.А., Донцова О.А., Сергиев П.В. Mitochondrial rRNA Methylation by Mettl15 Contributes to the Exercise and Learning Capability in Mice IJMS, N.23, 6056 (год публикации - 2022).

2. Барановский А., Иванов Т., Грановская М., Папаценко Д., Первушин Д. Transcriptome analysis reveals high tumor heterogeneity with respect to re-activation of stemness and proliferation programs Plos ONE, V.7, N5, e0268626 (год публикации - 2022).

3. Комарова Е.С., Слесарчук А.Н., Рубцова М.П., Остерман И.А., Тупикин А.Е., Пышный Д.В., Донцова О.А., Кабилов М.Р., Сергиев П.В. Flow-Seq Evaluation of Translation Driven by a Set of Natural Escherichia coli 50-UTR of Variable Length IJMS, N.23, 12293 (год публикации - 2022).

4. Ларионова Т., Бастола С., Аксинина Т., Ануфриева К., Ванг Д., Шендер В., Андреев Д., Коваленко Т., Арапиди Г., Шнайдер П., Казакова А., Латышев Я., Татарский В., Штиль А., Моро П., Жиро Ф., Ли Ч., Ванг И., Рубцова М., Донцова О., Павлюков М. Alternative RNA splicing modulates ribosomal composition and determines the spatial phenotype of glioblastoma cells Nature Cell Biology, V.24, p.1541-1557 (год публикации - 2022).

5. Лизунова С., Цветков В., Скворцов Д., Камзеева П., Иванова О., Васильева Л., Чистов А., Беляев Е., Хрулев А., Ведехина Т., Богомазова А., Лагарькова М., Варежук А., Аралов А. Anticancer activity of G4-targeting phenoxazine derivatives in vitro Biochimie, V.201, p.43-54 (год публикации - 2022).

6. Лиу Ш.-В., Ядамбаа Н., Никандрова А., Остерман И., Сан Ч.-Х. Exploring the Diversity and Antibacterial Potentiality of Cultivable Actinobacteria from the Soil of the Saxaul Forest in Southern Gobi Desert in Mongolia Microorganisms, V.10, N. 989 (год публикации - 2022).

7. Малявко А.Н., Петрова О.А., Зверева М.Э., Польшаков В.И., Донцова О.А. Telomere length regulation by Rif1 protein from Hansenula polymorpha eLife, N.11, e75010 (год публикации - 2022).

8. Марьясина С.С., Чан Ч.-Ф., Новолаев Т.Л., Чугунова А.А., Ефимов С.В., Згода В.Г., Ивлев В.А., Донцова О.А., Сергиев П.В., Польшаков В.И. Williams-Beuren Syndrome Related Methyltransferase WBSCR27: From Structure to Possible Function Frontiers in Molecular Biosciences, V.9, N. 865743 (год публикации - 2022).

9. Пахомова Т., Мошарева М., Василькова Д., Зацепин Т., Донцова О., Рубцова М. Role of RNA Biogenesis Factors in the Processing and Transport of Human Telomerase RNA Biomedicines, N 6, T 10, статья № 1275 (год публикации - 2022).

10. Пигарева В.А., Степанова Д.А., Большакова А.В., Марина М.И., Остерман И.А., Сыбачин А.В. Hyperbranched Kaustamin as an antibacterial for surface treatment Mendeleev Communication, №32, с.561-563 (год публикации - 2022).

11. Плетнев Ф.И., Шуленина О., Евфратов С., Трешин В., Субач М., Серебрякова М.В., Остерман И.А., Полескова А., Богданов А.А., Донцова О.А., Коневега А.Л., Сергиев П.В. Ribosomal protein S18 acetyltransferase RimI is responsible for the acetylation of elongation factor Tu Journal of Biological Chemistry, V.298, N.5, #101914 (год публикации - 2022).

12. Рубцова М.П., Донцова О.А. How Structural Features Define Biogenesis and Function of Human Telomerase RNA Primary Transcript Biomedicines, N.10, 1650 (год публикации - 2022).

13. Спектор Д., Ерофеев А., Горелкин П., Ванеев А., Акасов Р., Ульяновский Н., Никитина В., Семкина А., Власова К., Солдатов М., Тригуб А., Скворцов Д., Финько А., Зык Н., Сахаров Д., Мажуга А., Белоглазкина Е., Красновская О. Electrochemical Detection of a Novel Pt(IV) Prodrug with the Metronidazole Axial Ligand in the Hypoxic Area Inorganic Chemistry, Т.61, с. 14705-14717 (год публикации - 2022).