Аннотация результатов, полученных в 2021 году
Настоящий проект реализуется в рамках трех концептуально связанных направлений: (1) разработка технологий направленного изменения 3D-генома и эпигенома эукариотической клетки, (2) исследование 3D-генома и базовых механизмов транскрипции для установления мишеней, ответственных за развитие патологий, и (3) изучение роли ядерных компартментов в поддержании стабильности 3D-генома. Экспериментальные работы по 1-му направлению в отчетный период носили, в основном, подготовительный характер, а именно, заключались в создании всех необходимых для дальнейших исследований генноинженерных конструкций; выборе геномных экспериментальных моделей; клонировании, экспрессии и очистке необходимых для исследования белков; подготовке трансгенных организмов (дрозофила); продукции и оптимизации необходимых модифицированных олигонуклеотидов и т.д. В рамках реализации 2-го направления проекта были, в частности, исследованы механизмы участия 3D-генома и других эпигенетических факторов в регуляции экспрессии генов с использованием нескольких отличающихся геномных и клеточных моделей. Наряду с этим были проведены запланированные работы по созданию платформы для скрининга -модулирующих 3D-геном низкомолекулярных соединений и работы в рамках исследования механизмов паузирования РНК-полимеразы II. Из экспериментальных результатов, полученных в рамках реализации 3-го направления, наиболее важными представляются первая демонстрация и подробное исследование того факта, что белки TOPBP1 и Treacle могут выступать в качестве молекулярной платформы для клеточного ответа на репликативный стресс в ядрышке, обеспечивая эффективное привлечение и активацию необходимых репаративных факторов, участвующих в элиминации последствий такого стресса. Безусловно интересными выглядят также полученные данные о том, что однонитевые разрывы ДНК, организованной в хроматин, вызывают паузирование РНК-полимеразы, а также определение условий образования жидкофазных конденсатов с участием гистонов, репаративного белка PARP1 и ДНК. В целом, все запланированные на отчетный год работы выполнены в полном объеме. Полученные результаты легли в основу пяти публикаций, в том числе трех в журналах, входящих в Q1 по импакт-фактору. Ниже представлен краткий перечень конкретных результатов, полученных за отчетный период по каждому из направлений реализации проекта. НАПРАВЛЕНИЕ 1 Создана экспериментальная система для привлечения CTCF к определенным местам генома в составе химерного белка CTCF-dCas9. Сконструированы плазмиды, кодирующие полноразмерный CTCF или его формы с делецией доменов цинковых пальцев, слитые с флуоресцентным белком GFP и нуклеазой Cas9, лишённой энзиматической активности. Трансфекция этих плазмид в культивируемые клетки человека позволит привлечь химерный белок dCas9-GFP-CTCF к заранее выбранным геномным локусам. Создана модельная система для изучения роли ацетилирования гистонов в разграничении топологически-ассоциированных доменов генома. Получена линия дрозофил с кассетой сайтов связывания lexA, интегирированной в один из неактивных топологически-ассоциированных доменов. Эта же линия дрозофил экспрессирует гистоновую ацетилтрансферазу р300, слитую с ДНК-связывающим модулем lexA. Подготовлены инструменты для создания активационыых мини-компартментов в выбранных местах генома. Созданы плазмидные векторы для экспрессии химерных белков dCas9-GATA1, dCas9-BRG4 и dCas9-MED1 в клетках линии К562 и подобраны гидовые РНК для их привлечения в промоторную область взрослого бета-глобинового гена HBB, который в данной линии не транскрибируется, и является хорошей мишенью для активации. В качестве задела для последующих этапов работы созданы экспрессионные вектора для фьюженов белков BRD4 и MED1 с хромодоменом. На основе нуклеосом-позиционирующей последовательности 601 и октамера гистонов были собраны мононуклеосомы с двумя линкерами. Получены трансактивирующие РНК и CRISPR РНК. Сформированы гуаниновые квадруплексы1, меченые парой флуорофоров Cy3/Cy5. Наработаны и очищены эндонуклеаза Cas9 S. pyogenes, поли(АДФ-рибоза)-полимераза PARP1 H. sapiens, ДНК-связывающий белок Nhp6 и шаперон гистонов FACT S. cerevisiae. НАПРАВЛЕНИЕ 2 Созданы библиотеки флуоресцентно-меченых зондов для выявления структурных хроматиновых петель методом Oligopaint FISH. Получены клетки аденокарциномы лёгкого с нокаутом гистонметилтрансферазы SETDB1. Продемонстрировано, что в этих клетках происходит перераспределение H3K9me3 вдоль генома со значительным накоплением этой эпигенетической метки в хроматиновых доменах, ассоциированных с ядерной ламиной. Продемонстрировано, что переключение экспрессии кератинов в кератиноцитах кожи человека кореллирует со значительной реорганизаций системы пространственных взаимодействий внутри локуса кератиновых генов. Судя по всему, основой этой системы являются два суперэнхансера, расположенные на границах локуса и образующие контакты с активными генами кератинов. В эритроцитах Danio rerio на взрослой и личиночной стадии развития получены полногеномные профили связывания транскрипционного фактора GATA1 и профили метилирования ДНК. Обнаружено 1015 генов с дифференциальным уровнем метилирования промоторных областей в эбриональных эритроцитах и эритроцитах взрослого типа. Однако, не выявлено глобальной корреляции между дифференциальным метилированием промоторов и изменением профиля экспрессии индивидуальных генов по ходу переключения экспрессии глобиновых генов. Кроме того, для эритроцитов взрослых рыб получены полногеномные профили связывания архитектурного белка CTCF. Установлено, что расстояние между точкой старта транскрипции и границей нуклеосомы играет ключевую роль при формировании паузы в транскрипции РНКП 2 в положении 10 п.н. до входа в нуклеосому. Обнаружено, что расстояние в 65 п.н. способствует формированию высокоэффективного паузирования РНКП 2, что согласуется с данными, получаемыми in vivo. НАПРАВЛЕНИЕ 3 Впервые показано, что факторы TOPBP1 и Treacle выступают в качестве молекулярной платформы для клеточного ответа на репликативный стресс в ядрышке, обеспечивая эффективное привлечение и активацию необходимых репаративных факторов, участвующих в элиминации последствий такого стресса. Получена стабильная клеточная линия эмбриональных стволовых клеток человека, гиперэкспрессирующих микро-РНК MIR3648 и MIR3687. Получены и изучены в экспериментах по транскрипции in vitro нуклеосомы с однонитевыми разрывами нематричной цепи на границе нуклеосмоной ДНК и при приближении к нуклеосоме. Показано, что такие разрывы вызывают паузирование РНКП, которое наблюдается только при организации ДНК в нуклеосому. Определены условия образования и характеристики жидкофазных конденсатов состава PARP1/свободная ДНК/нуклеосомы. Проанализировано влияние концентрации соли и температуры на фазовый переход в системе конденсатов. Методом FRAP проведена оценка подвижности нуклеосом и свободной ДНК внутри конденсатов.

Аннотация результатов, полученных в 2022 году
Настоящий проект реализуется в рамках трех концептуально связанных направлений: (1) разработка технологий направленного изменения 3D-генома и эпигенома эукариотической клетки, (2) исследование 3D-генома и базовых механизмов транскрипции для установления мишеней, ответственных за развитие патологий, и (3) изучение роли ядерных компартментов в поддержании стабильности 3D-генома. Наиболее важным результатом работы про первому направлению исследований является демонстрация принципиальной возможности внесения изменений в 3D геном посредством привлечения к выбранному месту генома химерного белка CTCF-dCas9 и химерных белков, полученный посредством объединения в одной аминокислотной цепи ферментов, вносящих эпигенетические модификации гистонов, и dСas9. Другим важным результатом работы по этому направлению явилась демонстрация того, что замена канонических гистонов на вариантные (в частности, замена H2A на H2AZ) может дестабилизовать нуклеосому и делать ДНК доступной для воздействия на нее Cas9. Таким образом, состав гистонов нуклеосомы играет важную роль в регуляции ее связывания и разрезания Cas9. Также в хоте работ по направлению 1 создан ряд новых биоинформатических инструментов, в том числе доработан и опубликован протокол пентадного анализа, позволяющего раздельно анализировать уровни контактов внутри хроматиновых компартментов и между хроматиновыми компартментами на малых и больших геномных расстояниях. По второму направлению исследований наиболее важным представляется результат, демонстрирующий, что внесение изменений в профили эпигенетических модификаций гистонов может прямо влиять на морфологию клеточного ядра и клеточный фенотип. Продемонстрировано, что нокаут гена, кодирующего ацетилазу гистонов SETDB1 в клетках рака легкого вызывает изменение профилей распределения по геному H3K9me3, что приводит к усилению гетерохроматинового компартмента, в том числе возрастанию слоя гетерохроматина у ядерной оболочки. В результате ядра становятся более прочными и приобретают более правильную форму, типичную для ядер нормальных клеток. Вследствие этого клетки утрачивают способность к миграции. Фенотип этих клеток приближается к фенотипу нормальных клеток. Также важным представляется раскрытие факторов, влияющих на прохождение РНК полимеразой 2 нуклеосомного барьера. Методами футпринтинга ДНК и spFRET-микроскопии охарактеризованы структурные изменения во внутринуклеосомной ДНК, происходящие при постепенном приближении РНКП к границе нуклеосомы. Полученные данные позволяют предположить, что в формировании и преодолении нуклеосомного барьера для транскрипции значительный вклад может иметь разрушение ДНК-гистоновых контактов. Наконец, отработка методов гибридизации in situ с короткими зондами открывает возможность прямого изучения процесса реконфигурации хроматиновых доменов по ходу дифференцировки, в частности по ходу дифференцировки кератиноцитов. По третьему направлению наиболее важным представляется комплекс результатов, характеризующих различные активности репарационного белка PARP1. Разработана экспериментальная система для изучения действия PARP1 на транскрипцию нуклеосом с однонитевыми разрывами нематричной цепи ДНК. Определено влияние PARP1 на транскрипцию таких нуклеосом. Исследована способность PARP1 индуцировать микрофазовое разделение мононуклеосом с формированием стабильных конденсатов. Охарактеризованы кинетика, обратимость и солезависимость процессов фазового разделения. Изучены такие свойства мононуклеосом в составе конденсатов, как диффузионная подвижность и состояние проксимальной линкерной области. Установлено диссоциирующее влияние поли-АДФ-рибозилирования компонентов на микрофазовые конденсаты. Хотя все эти результаты имеют пока чисто фундаментальный характер, стоит учесть, что все рапарционные белки являются потенциальными мишенями для противораковых агентов. Раскрытие механистических аспектов функционирования PARP1 позволит наметить новые стратегии противораковой терапии. Важным результатом работы по третьему направлению является также раскрытие взаимной роли белков Nbs1, TOPBP1 и Treacle в репарации повреждений генов, кодирующих рибосомную РНК. Продемонстрировано, что локализация Nbs-1 на рибосомных генах при повреждениях ДНК зависит от Treacle/TOPBP1, и что Nbs-1 необходим для усиления активации сигнальной киназы ATM и её нижестоящих мишеней на промоторе рибосомных генов при разных типах генотоксического стресса. Учитывая тот факт, что здесь опять таки речь идет о репарационных белках, эта часть работы также может привести к идентификации новых мишеней для противораковой терапии. По результатам работы по проекту в 2022 опубликовано 10 статей в зарубежных журналах, входящих в первый квартиль (Q1) по импакт-фактору JCR Science Edition, либо отечественных журналах, входящих во второй квартиль (Q2) по той же базе данных, и 3 тезисных сообщения.

Аннотация результатов, полученных в 2023 году
Настоящий проект реализуется в рамках трех концептуально связанных направлений: (1) разработка технологий направленного изменения 3D-генома и эпигенома эукариотической клетки, (2) исследование 3D-генома и базовых механизмов транскрипции для установления мишеней, ответственных за развитие патологий, и (3) изучение роли ядерных компартментов в поддержании стабильности 3D-генома. По первому направлению исследований наиболее важными представляются две группы результатов: (1) Демонстрация возможности формирования хроматиновых петель de novo путём привлечения в заранее определённую точку генома химерного белка, состоящего из ДНК-связывающего модуля (каталитически неактивная нуклеаза Cas9) и N-концевого домена архитектурного белка CTCF; (2) Демонстрация возможности активации транскрипции гена кератина-1 в культивируемых иммортализованных кератиноцитах человека линии HaCaT посредством привлечения к промотору этого гена химерного активаторного белка, состоящего из ДНК-связывающего модуля (каталитически неактивная нуклеаза Cas9) и полноразмерного транскрипционного фактора, мастер-регулятора кератиноцитной дифференцировки KLF4. Согласно полученным данным, активация транскрипции в этом случае происходит за счёт образования пространственного взаимодействия между промотором гена кератина-1 и зоной контроля локуса; по всей видимости, формирующееся взаимодействие имеет жидкофазную природу. Оба перечисленных результата прямо демонстрируют возможность редактирования 3D генома, причем второй результат показывает, что такое редактирование может быть использовано для активации транскрипции гена интереса. Также представляют интерес результаты, демонстрирующие, что эффективность разрезания нуклеосомной ДНК эндонуклеазой Cas9 может модулироваться шапероном гистонов FACT и поли(АДФ-рибоза)-полимеразой PARP1 По второму направлению исследований наиболее важными результатами представляются: (1) отработка методики флуоресцентной гибридизации in situ с использованием проб, полученных из ПЦР-продуктов путём прямого мечения различными флуорофорами, и анализ взаимного расположения в клеточном ядре гена кератина 5 и двух областей контроля локуса кератиновых генов в клетках линии HaCaT (иммортализованные культивируемые кератиноциты) и первичной культуре кожных фибробластов. В клетках линии HaCaT выявлены тройные активаторные комплексы, включающие ген кератина 5 и две области контроля локуса; (2) демонстрация того, что обе области контроля локуса кератиновых генов активно транскрибируются в клетках, экспрессирующих кератины; (3) демонстрация возможной роли обратного смещения РНК-полимеразы (так называемого «бэктрекинга») в формировании нуклеосомного барьера для транскрипции при приближении РНКП к границе нуклеосомной ДНК. По третьему направлению исследований наиболее важными результатами представляются: (1) Раскрытие сигнальных путей, контролирующих подавление транскрипции генов рРНК в условиях повреждения как собственно генов рРНК так и геномной ДНК вне ядрышка; (2) Идентификация некодирующих РНК, которые могут модулировать посадку архитектурного белка CTCF на сайты связывания. Существует потенциальная возможность использования таких некодирующих РНК для редактирования 3D генома; (3) Демонстрация важной роли N-концевых доменов гистонов в подавлении транскрипции организованной в нуклеосомы ДНК с разрывами в нематричной цепи; (4) Демонстрация роли линкерных участков нуклеосомной ДНК, двухвалентных катионов и макромолекулярного краудинга в формировании жидкофазных конденсатов комплексами мононуклеосом с PARP1 и создание экспериментальной модели функционально активных репарационных конденсатов.