КАРТОЧКА ПРОЕКТА,
ПОДДЕРЖАННОГО РОССИЙСКИМ НАУЧНЫМ ФОНДОМ

Информация подготовлена на основании данных из Информационно-аналитической системы РНФ, содержательная часть представлена в авторской редакции. Все права принадлежат авторам, использование или перепечатка материалов допустима только с предварительного согласия авторов.

 

ОБЩИЕ СВЕДЕНИЯ


Номер 21-64-00001

НазваниеМеханизмы поддержания стабильности 3D-генома и технологии его направленного изменения для решения фундаментальных и прикладных задач.

РуководительРазин Сергей Владимирович, Доктор биологических наук

Прежний руководитель Кантидзе Омар Леванович, дата замены: 26.05.2022

Организация финансирования, регионФедеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биологии гена Российской академии наук, г Москва

Годы выполнения при поддержке РНФ 2021 - 2024 

КонкурсКонкурс 2021 года «Проведение фундаментальных научных исследований и поисковых научных исследований по поручениям (указаниям) Президента Российской Федерации» (генетические исследования)

Область знания, основной код классификатора 04 - Биология и науки о жизни, 04-201 - Структурная, функциональная и эволюционная геномика

Ключевые словахроматин, хроматиновый домен, транскрипция, регуляция экспрессии генов, 3D-геном, энхансер, промотор, клеточное ядро, доменная организация генома, коммуникация между промотором и энхансером, РНК-полимераза, эпигеном

Код ГРНТИ34.15.00


 

ИНФОРМАЦИЯ ИЗ ЗАЯВКИ


Аннотация
В основе развития различных патологий, включая онкологические, сердечно-сосудистые, нейродегенеративные и психические заболевания, часто лежат нарушения в молекулярных системах регуляции экспрессии генов и поддержании стабильности генома. Накопленные за последние десятилетия данные о структуре и динамике клеточного ядра не позволяют рассматривать эти системы только как набор белковых факторов, регулирующих транскрипцию и репарацию ДНК. Помимо базовых механизмов транскрипции и репарации, большое влияние на регуляцию экспрессии генов и поддержание стабильности генома оказывают существующие в ядре локальные контексты, обусловленные эпигенетическими условиями, динамикой внутриядерных компартментов и пространственной организацией генома (3D-геном). Настоящий проект будет посвящен комплексному анализу влияния различных внутриядерных условий, в первую очередь 3D-организации генома, на регуляцию экспрессии генов и поддержание стабильности генома. Важной как для фундаментальных, так и для трансляционных исследований задачей проекта будет разработка технологий направленного изменения 3D-генома, основанная на модуляции локальных внутриядерных условий (контекстов). Настоящий комплексный проект будет реализовываться в рамках трех концептуально связанных направлений: (1) разработка технологий направленного изменения 3D-генома и эпигенома эукариотической клетки, (2) исследование 3D-генома и базовых механизмов транскрипции для установления мишеней, ответственных за развитие патологий, и (3) изучение роли ядерных компартментов в поддержании стабильности 3D-генома. В рамках разработки новых технологий направленного изменения 3D-генома и эпигенома клетки особое внимание будет уделено технологиям, позволяющим исследовать причинно-следственные связи между изменениями пространственной организации генома и модуляцией его функциональной активности, а также технологиям, обладающим потенциалом к эпигенетической коррекции/компенсации геномных дефектов, связанных с развитием различных патологий. Реализация второго направления проекта позволит не только получить оригинальные данные о базовых механизмах транскрипции, а также об участии хроматин-модифицирующих ферментов и пространственной организации генома в регуляции экспрессии генов и процессах дифференцировки клеток, но и приведет к разработке платформы для идентификации низкомолекулярных соединений, способных модулировать структуру 3D-генома эукариотической клетки. Реализация третьего направления проекта, посвященного роли ядерных компартментов в поддержании стабильности 3D-генома позволит существенно расширить наши представления о механизмах формирования субъядерных компартментов и их роли в регуляции процессов транскрипции и репарации ДНК. Особое внимание будет уделено также механизмам взаимовлияния транскрипции и репарации ДНК в зависимости от локальных внутриядерных условий/контекстов. Все составные части проекта являются принципиально новыми и не имеют прямых аналогов в современной науке. Помимо того, что каждая из обозначенных выше задач является оригинальной, научная актуальность и новизна проекта в целом обусловлена тем, что он носит системный характер и направлен на расширение, а возможно и частичный пересмотр современных представлений об организации транскрипции и репарации ДНК в ядре эукариотической клетки, а также о взаимосвязи этих процессов (подробнее см. п.п. 4.2 и 4.3).

Ожидаемые результаты
Экспериментальный проект направлен на решение ключевых вопросов современной молекулярной и клеточной биологии, которые находятся в фокусе внимания ведущих научных коллективов, регулярно обсуждаются на наиболее важных международных симпозиумах и являются предметом обсуждения в многочисленных обзорных статьях, публикуемых в рейтинговых международных журналах. Учитывая тот факт, что предыдущие результаты работы авторов настоящей заявки, которые положены в основу всех трех частей заявляемого научного проекта, были опубликованы в ведущих высокорейтинговых международных журналах и вызвали широкий интерес научной общественности, можно утверждать, что и реализация заявляемого научного проекта приведет к получению результатов мирового уровня, которые будут опубликованы в ведущих международных журналах. Мы полагаем, что в результате реализации проекта: - Будут разработаны несколько принципиально новых генно-инженерных технологий (систем) для таргетного изменения 3D-генома и эпигенома эукариотической клетки, которые, с одной стороны, будут способствовать раскрытию фундаментальных механизмов пространственной организации генома и регуляции экспрессии генов, и, с другой стороны, станут прототипами потенциальных генотерапевтических систем, способных эпигенетически компенсировать геномные дефекты, ассоциированные с различными патологическими состояниями. - Будут охарактеризованы механизмы узнавания ДНК в хроматине нуклеазой Cas9, в частности, будет проанализирована роль вариантных гистонов и модификаций коровых гистонов, гуаниновых квадруплексов, и регуляторов структуры хроматина в узнавании нуклеазой Cas9 ДНК в составе хроматина. - Будет разработана платформа для идентификации низкомолекулярных соединений, способных модулировать структуру 3D-генома эукариотической клетки. - Будут исследованы роль 3D-генома и механизмы участия хроматин-модифицирующих ферментов и в процессах дифференцировки клеток. - Будут исследованы механизмы формирования нуклеосомного барьера РНК-полимеразы при транскрипции. - Будут выявлены молекулярные механизмы формирования ядерных компартментов, включая гетерохроматиновый и эухроматиновый компартменты генома, а также разработаны стратегии их направленной модуляции в живых клетках. - Будет выявлена роль ядрышковых белков в регуляции транскрипции и репарации неядрышковых генов, а также исследованы механизмы участия ядрышка и его отдельных компонентов в клеточном ответе на генотоксический и репликативный стрессы. - Будут охарактеризованы тонкие механизмы узнавания транскрипционной машиной различных повреждений ДНК в составе хроматина и механизмов взаимовлияния транскрипции и репарации ДНК.


 

ОТЧЁТНЫЕ МАТЕРИАЛЫ


Аннотация результатов, полученных в 2021 году
Настоящий проект реализуется в рамках трех концептуально связанных направлений: (1) разработка технологий направленного изменения 3D-генома и эпигенома эукариотической клетки, (2) исследование 3D-генома и базовых механизмов транскрипции для установления мишеней, ответственных за развитие патологий, и (3) изучение роли ядерных компартментов в поддержании стабильности 3D-генома. Экспериментальные работы по 1-му направлению в отчетный период носили, в основном, подготовительный характер, а именно, заключались в создании всех необходимых для дальнейших исследований генноинженерных конструкций; выборе геномных экспериментальных моделей; клонировании, экспрессии и очистке необходимых для исследования белков; подготовке трансгенных организмов (дрозофила); продукции и оптимизации необходимых модифицированных олигонуклеотидов и т.д. В рамках реализации 2-го направления проекта были, в частности, исследованы механизмы участия 3D-генома и других эпигенетических факторов в регуляции экспрессии генов с использованием нескольких отличающихся геномных и клеточных моделей. Наряду с этим были проведены запланированные работы по созданию платформы для скрининга -модулирующих 3D-геном низкомолекулярных соединений и работы в рамках исследования механизмов паузирования РНК-полимеразы II. Из экспериментальных результатов, полученных в рамках реализации 3-го направления, наиболее важными представляются первая демонстрация и подробное исследование того факта, что белки TOPBP1 и Treacle могут выступать в качестве молекулярной платформы для клеточного ответа на репликативный стресс в ядрышке, обеспечивая эффективное привлечение и активацию необходимых репаративных факторов, участвующих в элиминации последствий такого стресса. Безусловно интересными выглядят также полученные данные о том, что однонитевые разрывы ДНК, организованной в хроматин, вызывают паузирование РНК-полимеразы, а также определение условий образования жидкофазных конденсатов с участием гистонов, репаративного белка PARP1 и ДНК. В целом, все запланированные на отчетный год работы выполнены в полном объеме. Полученные результаты легли в основу пяти публикаций, в том числе трех в журналах, входящих в Q1 по импакт-фактору. Ниже представлен краткий перечень конкретных результатов, полученных за отчетный период по каждому из направлений реализации проекта. НАПРАВЛЕНИЕ 1 Создана экспериментальная система для привлечения CTCF к определенным местам генома в составе химерного белка CTCF-dCas9. Сконструированы плазмиды, кодирующие полноразмерный CTCF или его формы с делецией доменов цинковых пальцев, слитые с флуоресцентным белком GFP и нуклеазой Cas9, лишённой энзиматической активности. Трансфекция этих плазмид в культивируемые клетки человека позволит привлечь химерный белок dCas9-GFP-CTCF к заранее выбранным геномным локусам. Создана модельная система для изучения роли ацетилирования гистонов в разграничении топологически-ассоциированных доменов генома. Получена линия дрозофил с кассетой сайтов связывания lexA, интегирированной в один из неактивных топологически-ассоциированных доменов. Эта же линия дрозофил экспрессирует гистоновую ацетилтрансферазу р300, слитую с ДНК-связывающим модулем lexA. Подготовлены инструменты для создания активационыых мини-компартментов в выбранных местах генома. Созданы плазмидные векторы для экспрессии химерных белков dCas9-GATA1, dCas9-BRG4 и dCas9-MED1 в клетках линии К562 и подобраны гидовые РНК для их привлечения в промоторную область взрослого бета-глобинового гена HBB, который в данной линии не транскрибируется, и является хорошей мишенью для активации. В качестве задела для последующих этапов работы созданы экспрессионные вектора для фьюженов белков BRD4 и MED1 с хромодоменом. На основе нуклеосом-позиционирующей последовательности 601 и октамера гистонов были собраны мононуклеосомы с двумя линкерами. Получены трансактивирующие РНК и CRISPR РНК. Сформированы гуаниновые квадруплексы1, меченые парой флуорофоров Cy3/Cy5. Наработаны и очищены эндонуклеаза Cas9 S. pyogenes, поли(АДФ-рибоза)-полимераза PARP1 H. sapiens, ДНК-связывающий белок Nhp6 и шаперон гистонов FACT S. cerevisiae. НАПРАВЛЕНИЕ 2 Созданы библиотеки флуоресцентно-меченых зондов для выявления структурных хроматиновых петель методом Oligopaint FISH. Получены клетки аденокарциномы лёгкого с нокаутом гистонметилтрансферазы SETDB1. Продемонстрировано, что в этих клетках происходит перераспределение H3K9me3 вдоль генома со значительным накоплением этой эпигенетической метки в хроматиновых доменах, ассоциированных с ядерной ламиной. Продемонстрировано, что переключение экспрессии кератинов в кератиноцитах кожи человека кореллирует со значительной реорганизаций системы пространственных взаимодействий внутри локуса кератиновых генов. Судя по всему, основой этой системы являются два суперэнхансера, расположенные на границах локуса и образующие контакты с активными генами кератинов. В эритроцитах Danio rerio на взрослой и личиночной стадии развития получены полногеномные профили связывания транскрипционного фактора GATA1 и профили метилирования ДНК. Обнаружено 1015 генов с дифференциальным уровнем метилирования промоторных областей в эбриональных эритроцитах и эритроцитах взрослого типа. Однако, не выявлено глобальной корреляции между дифференциальным метилированием промоторов и изменением профиля экспрессии индивидуальных генов по ходу переключения экспрессии глобиновых генов. Кроме того, для эритроцитов взрослых рыб получены полногеномные профили связывания архитектурного белка CTCF. Установлено, что расстояние между точкой старта транскрипции и границей нуклеосомы играет ключевую роль при формировании паузы в транскрипции РНКП 2 в положении 10 п.н. до входа в нуклеосому. Обнаружено, что расстояние в 65 п.н. способствует формированию высокоэффективного паузирования РНКП 2, что согласуется с данными, получаемыми in vivo. НАПРАВЛЕНИЕ 3 Впервые показано, что факторы TOPBP1 и Treacle выступают в качестве молекулярной платформы для клеточного ответа на репликативный стресс в ядрышке, обеспечивая эффективное привлечение и активацию необходимых репаративных факторов, участвующих в элиминации последствий такого стресса. Получена стабильная клеточная линия эмбриональных стволовых клеток человека, гиперэкспрессирующих микро-РНК MIR3648 и MIR3687. Получены и изучены в экспериментах по транскрипции in vitro нуклеосомы с однонитевыми разрывами нематричной цепи на границе нуклеосмоной ДНК и при приближении к нуклеосоме. Показано, что такие разрывы вызывают паузирование РНКП, которое наблюдается только при организации ДНК в нуклеосому. Определены условия образования и характеристики жидкофазных конденсатов состава PARP1/свободная ДНК/нуклеосомы. Проанализировано влияние концентрации соли и температуры на фазовый переход в системе конденсатов. Методом FRAP проведена оценка подвижности нуклеосом и свободной ДНК внутри конденсатов.

 

Публикации

1. Величко А.К., Овсянникова Н., Петрова Н.В., Лужин А.В., Воробьева М., Гавриков А.С., Мишин А.С., Киреев И.И., Разин С.В., Кантидзе О.Л. Treacle and TOPBP1 control replication stress response in the nucleolus. Journal of Cell Biology, том 220. выпуск 8, e202008085 (год публикации - 2021).

2. Гераськина О., Малюченко Н., Студитский В., Кошкина Д., Феофанов А. Microscopic Analyses of Liquid-Liquid Phase Separation Induced by Linker Histone H1.0 International Journal of Biomedicine, том 11, доп. 1, с. S21-22 (год публикации - 2021).

3. Кос П.И., Галицына А.А., Ульянов С.В., Гельфанд М.С., Разин С.В., Чертович А.В. Perspectives for the reconstruction of 3D chromatin conformation using single cell Hi-C data PLoS Computational Biology, том 17, выпуск 11, e1009546 (год публикации - 2021).

4. Разин С.В., Юдинкова Е.С., Kantidze O.L., Яровая О.В. Co-Regulated Genes and Gene Clusters Genes, том 12, выпуск 6, статья 907 (год публикации - 2021).

5. Яровая О.В., Юдинкова Е.С., Величко А.К., Разин С.В. Manipulation of Cellular Processes via Nucleolus Hijaking in the Course of Viral Infection in Mammals Cells, том 10, выпуск 7, статья 1597 (год публикации - 2021).