КАРТОЧКА ПРОЕКТА ФУНДАМЕНТАЛЬНЫХ И ПОИСКОВЫХ НАУЧНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ,
ПОДДЕРЖАННОГО РОССИЙСКИМ НАУЧНЫМ ФОНДОМ

Информация подготовлена на основании данных из Информационно-аналитической системы РНФ, содержательная часть представлена в авторской редакции. Все права принадлежат авторам, использование или перепечатка материалов допустима только с предварительного согласия авторов.

ОБЩИЕ СВЕДЕНИЯ

Номер 21-44-07002

НазваниеАрхитектура и механизмы клеточного узнавания бактериофагов - рациональные подходы к созданию систем управления хозяйской специфичностью

РуководительСоколова Ольга Сергеевна, Доктор биологических наук

Организация финансирования, регион Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования «Московский государственный университет имени M.В.Ломоносова», г Москва

Период выполнения при поддержке РНФ

2021 г. - 2023 г.

Конкурс№59 - Конкурс 2021 года «Проведение фундаментальных научных исследований и поисковых научных исследований международными научными коллективами» (совместно с Министерством сельского, лесного и рыбного хозяйства Японии - MAFF/AFFRCS).

Область знания, основной код классификатора 04 - Биология и науки о жизни, 04-202 - Протеомика; структура и функции белков

Ключевые словакрио-электронная микроскопия, анализ изображений, атомная структура, сельское хозяйство, аквакультура, бактериофаги, хозяйская специфичность, фаготерапия

Код ГРНТИ34.15.31

СтатусУспешно завершен

ИНФОРМАЦИЯ ИЗ ЗАЯВКИ

Аннотация
В условиях интенсивного ведения животноводства и рыбоводства высокая концентрации животных на ограниченных территориях приводит к взрывному росту бактериальных инфекций, приносящих значительные экономические потери. При этом многолетнее бесконтрольное применение антибиотиков в практике сельского хозяйства привело к появлению полирезистентных штаммов зоопатогенных бактерий, устойчивых к целым группам антибиотиков. Для решения задачи предотвращения вспышек бактериальных заболеваний в сельском хозяйстве необходима разработка альтернативных и/или дополняющих технологий. Одной из перспективных в данном направлении технологий является биологический контроль популяций патогенов препаратами на основе бактериофагов - вирусов патогенных бактерий. Эти препараты недороги в производстве и не накапливаются в конечной продукции, однако способны при этом эффективно контролировать популяции патогенных организмов. Для целей фагопрофилактики и фаготерапии вирусы могут быть отобраны из объектов окружающей среды, либо получены направленным изменением фагов-платформ, активных против интересующих групп микроорганизмов, методами генной инженерии и синтетической биологии. Второй вариант является наиболее перспективным, т.к позволяет проводить тонкую настройку бактериофагов под конкретные задачи и целевые организмы. Однако для этой цели такие фаги-платформы должны быть максимально полно (в том числе структурно) охарактеризованы. В рамках настоящего проекта планируется объединить опыт и комплементарные компетенции ряда научных групп - МГУ им. М.В. Ломоносова, ФИЦ Биотехнологии РАН и OIST (Япония) с целью создания научного задела для рационального дизайна бактериофагов, предназначенных для разработки препаратов для профилактики и терапии бактериальных инфекций сельскохозяйственных животных и рыб. В частности, планируется провести поиск и комплексную (прежде всего структурную) характеристику ряда потенциальных фагов-платформ, обеспечивающих возможность дальнейшей таргетной разработки на их основе антибактериальных препаратов для целей сельского хозяйства (животноводства и рыбоводства). В рамках проекта планируется структурная характеристика двух бактериофагов кишечной палочки, имеющих уникальную структурную организацию: миовируса Rb43 (Т-четный фаг) и сифовируса Dt57C (Т-нечетный фаг), выделенного в отдельное семейство благодаря уникальной организации его адгезинов, придающих фагу лучшую адаптацию к преодолению вязкости окружающей среды, а также ряда новых фагов, аэромонад, паразитирующих на аквакультуре. Структурные исследования будут проведены при помощи метода криоэлектронной микроскопии - единственного на сегодняшний день структурного метода, позволяющего непосредственно изучать молекулярную архитектуру вирионов высокого разрешения. Результаты проекта не только расширят мировые знания о взаимодействии бактериофагов и их хозяев, а также о молекулярных механизмах инфицирования последних, но и потенциально будут востребованы в области разработки компонентов фаговой терапии. Научная новизна исследования определяется прежде всего новизной самих объектов исследования (бактериофагов и их адсорбционных аппаратов), что определяет соответствие планируемых к получению данных мировому уровню.

Ожидаемые результаты
В рамках проекта планируется провести комплексное - биохимическое, молекулярно-биологическое и, прежде всего, структурное исследование ряда практически важных для фаговой терапии бактериофагов и связанных с ними молекулярных структур, что позволит с высокой точностью описать механизмы непосредственного взаимодействия вирусной частицы фага с поверхностными структурами бактериальной клетки - первичными и вторичными рецепторами. Для проведения исследований отобраны два бактериофага E.coli, являющиеся представителями Т-четных и Т-нечетных семейств и представляющие тем самым удобную модель для рациональной разработки на их основе фаговых-платформ с модифицируемой специфичностью. Также в рамках исследования будут отобраны и комплексно охарактеризованы не менее двух фагов аэромонад - известного патогена представителей аквакультуры. Этот зоопатоген отличается рядом важных факторов патогенности, из которых главным является наличие паракристаллического А-слоя на поверхности бактерии, определяющего патогенные свойства бактерии. Структурная информация о молекулярной организации аппарата адсорбции отобранных бактериофагов аэромонад к внешней плазматической мембране бактерии в настоящее время отсутствует и ее получение откроет большие перспективы для рационального применения бактериофагов для сдерживания инфекций, вызванных аэромонадами в условиях аквакультуры. Основными ожидаемыми результатами проекта являются: - Развёрнутая физиолого-биохимическая характеристика двух колифагов Rb43 и Dt57C и не менее двух новых фагов аэромонад. - Пространственные структуры вирионов бактериофагов Rb43, Dt57C и отобранных фагов аэромонад (полученные методом криоЭМ) с акцентом на тонкую структуру их адсорбционных аппаратов, определяющих в числе прочего фаговую специфичность. - Структуры адгезинов изучаемых колифагов высокого разрешения, полученные методом рентгеноструктурного анализа. Практическая значимость планируемых научных результатов очевидна, прежде всего с точки зрения полученных в ходе выполнения проекта структурных данных, имеющих прямое значение для разработки рациональных подходов к фаготерапии и фагопрофилактике. Кроме этого, такие данные значительно расширят существующие фундаментальные знания о биологических структурах, участвующих в процессах узнавания вирусами прокариот клеток хозяев (прежде всего патогенных). Научная новизна исследования определяется как новизной ряда объектов исследования (фагов аэромонад), так и новизной планируемых к получению структурных данных высокого разрешения о уже известных объектах (колифагах и их структурных компонентов). Актуальность, новизна и научная значимость целей и задач исследования определяют мировой уровень планируемых к получению результатов.

ОТЧЁТНЫЕ МАТЕРИАЛЫ

Аннотация результатов, полученных в 2021 году
При поддержке РНФ в сотрудничестве с японскими коллегами исследовались бактериофаги DT57С и RB43. Для дальнейших структурных исследований нами получены препараты фага DT57C c интактными латеральными фибриллами и фага RB43. Определена кинетика адсорбции фагов DT57С и RB43. Фрагмент генома фага RB43, кодирующий предполагаемый адгезин длинных хвостовых фибрилл, был клонирован в экспрессионный вектор pRSF Duet и ко-экспрессирован с общим шапероном фибрилл Т-четных фагов gp57A. Коэкспрессия с gp57 позволила перевести компоненты комплекса во фракцию растворимых белков, начата работа по оптимизации экспрессии. Получены высококачественные микрофотографии исследуемых фагов с помощью негативного контрастирования. Подтверждены характеристики препаратов, необходимые для криоэлектронного исследования и подобраны параметры витрификации изучаемых колифагов и получены их витрифицированные образцы. Японским партнером проведены первые реконструкции капсида и хвоста фага DT57С. Получены субнанометровые разрешения: 4.3 и 8.5 ангстрем для реконструкций капсида и хвоста, соответственно. Проведены дополнительные исследования распознавания клеточной поверхности RB49-подобными фагами и разработан метод исследования нуклеиновых кислот в капсиде фагов с помощью аналитической электронной микроскопии. В результате создан значительный научный задел для будущих исследований по тематике настоящего проекта. Полученные нами результаты были опубликованы в рецензируемых журналах, доложены на международных конференциях.

Публикации

1. Трифонова Т.С., Моисеенко А.В., Буркальцева М.В., Шабурова О.В., Шайтан А.К., Крылов В.Н., Соколова О.С. Картирование ДНК в капсиде гигантского бактериофага phiEL (Сaudovirales: Myoviridae: Elvirus) с помощью аналитической электронной микроскопии Вопросы вирусологии, Т. 66, № 6 (год публикации - 2021) https://doi.org/10.36233/0507-4088-80

2. A. Голомидова, А. Кащенко, Е. Куликов, С. Токарева, Л. Юхименко, О.С. Соколова, А. Летаров Novel giant Citrobacter braakii bacteriophages Molecular Biology of the Cell, Vol. 32, No. 22, P. 381 (год публикации - 2021) https://doi.org/10.1091/mbc.E21-11-0545

3. Татьяна Трифонова, Андрей Моисеенко, Ольга Шабурова, Мария Буркальцева, Виктор Крылов, Ольга Соколова Analysis of Phosphorus Distribution in Giant Bacteriophage Capsid by Electron Energy Loss Spectroscopy International Journal of Biomedicine, т. 11(Suppl 1), с. S33 (год публикации - 2021) https://doi.org/10.21103/IJBM.11.Suppl_1.P47

Аннотация результатов, полученных в 2022 году
В 2022 г. нами получена структурная модель бактериофага DT57C, включающая почти все элементы (кроме рецептор-распознающего белка), необходимые для инфекционности этого вируса как минимум на некоторых штаммах хозяев. В структуре бактериофага был обнаружен ряд интересных особенностей, отличающий этот вирус (и группу Т5-подобных фагов, к которой он относится) от ранее охарактеризованных в структурном отношении вирусов бактерий. К таким участкам относится молекулярная организация соединения головки и хвоста фага (шейки вириона), а также базальной пластинки (наконечника) хвоста. Полученные данные позволяют определить количество цепей белка-рулетки (tape measure protein), который у фага DT57C представлен тримером. Наиболее ярким результатом можно считать расшифровку необычной молекулярной архитектуры присоединения латеральных хвостовых фибрилл (ЛХФ) фага, которые образуют сложное переплетение на уровне третичной структуры с глобулярным белком, 12 субъединиц которого образуют кольцо вокруг базальной пластинки фага в месте присоединения ЛХФ. Хотя на некоторых штаммах хозяев инфекция фагом DT57C возможна и без участия ЛХФ, эти структуры обеспечивают возможность размножения вируса на природных штаммах E. coli, поверхность которых защищена О антигеном. Поэтому исследования ЛХФ имеют существенное значение с точки зрения практического применения бактериофагов и возможной искусственной модификации их хозяйской специфичности. Сами ЛХФ фага за пределами участка их присоединения, обладают большой подвижностью, поэтому не видны на полученной реконструкции. Однако из ранее полученных данных известно, что у фага DT57C эти фибриллы имеют разветвленный характер и состоят из присоединенного к базальной пластинке белка LtfA и более короткого белка LtfB, присоединяемого к LtfA. Помимо упомянутого места прикрепления LtfA, реконструированного с высоким разрешением, мы обнаружили примыкание к базальной пластинке других фибрилл, изображение которых остается размытым и имеет низкую плотность. По-видимому, этот результат свидетельствует о том, что у некоторых частиц LtfB может быть повернут в сторону базальной пластинки и контактировать с ним в области С-конца (положение “руки в боки”). Это позволило нам предположить, что фаг DT57C обладает элементарным сенсором окружающей среды, который в определенных (неблагоприятных?) условиях ослабляет адсорбцию фага. Подобные сенсоры были ранее описаны у фага Т4 и некоторых иных вирусов бактерий, но их присутствие в группе Т5-подобных бактериофагов не предполагалось. Результаты поставленных нами биологических эксперименты согласуются в предположением о наличии сенсора, однако окончательное подтверждение и определение природного сигнала, детектируемого этим механизмом, потребует дополнительных исследований в следующем году. Помимо перечисленных исследований нами был проведен ряд подготовительных работ, необходимых для выполнения исследований, запланированных в следующем году. В частности, получены очищенные препараты двух бактериофагов аэромонад для структурных исследований (одного из них можно отнести к гигантским фагам) , получены препараты изолированных хвостов, созданы генно-инженерные конструкции и получены рекомбинантные фаговые белки.

Публикации

1. Александр Д. Ефимов, Алла К. Голомидова, Евгений Е. Куликов, Илья С. Белалов, Павел А. Иванов, Андрей В. Летаров RB49-like Bacteriophages Recognize O Antigens as One of the Alternative Primary Receptors Int. J. Mol. Sci., V. 23(19), 11329 (год публикации - 2022) https://doi.org/10.3390/ijms231911329

2. Рафаэль Айала, Евгений Куликов, Алла Голомидова, Андрей Моисеенко, Маттиас Вольф, Андрей В. Летаров, Ольга С. Соколова 3D Structure of the Tail Complex of E. coli Bacteriophage DT57C Microscopy and Microanalysis, Microsc. Microanal. 28 (Suppl 1), 2022, p. 1156-1158 (год публикации - 2022) https://doi.org/10.1017/S1431927622004858

3. Соколова О.С. Editorial: Methods in structural biology: Cryo-EM Front. Mol. Biosci., 9:1041373 (год публикации - 2022) https://doi.org/10.3389/fmolb.2022.1041373

Аннотация результатов, полученных в 2023 году
При поддержке РНФ в сотрудничестве с японскими коллегами из OIST (Окинава, Япония) исследовались бактериофаги DT57С и RB43. Определена кинетика адсорбции фагов DT57С и RB43. Фрагмент генома фага RB43, кодирующий предполагаемый адгезин длинных хвостовых фибрилл, был клонирован и ко-экспрессирован с общим шапероном фибрилл Т-четных фагов gp57A. Получена методом крио-ЭМ единичных молекул на данный момент самая крупная реконструкция целого хвостатого вируса RB43. Выдвинута и подтверждена гипотеза о присутствии у фага DT57C сенсора, модулирующего адсорбцию. Проведена реконструкция всех частей фага DT57C (капсид, портал, хвост, базальная пластинка). Атомные модели были построены de novo с использованием AlphaFold и вписаны в электронные плотности. Определена структура хвоста, портала и капсида гигантского бактериофага, причём разрешения карт плотности для икосаэдрического капсида и портального комплекса являются наилучшими среди всех опубликованных на текущий момент структур гигантских бактериофагов. Результаты исследований были доложены на международных конференциях и опубликованы в рецензируемых научных журналах с высоким импакт-фактором.

Публикации

1. Илья Сироткин, Андрей Моисеенко, Дарья Антонова, Мария Якунина, Фуксин Ванг, Чжэн Лю, Ольга Соколова Helical Reconstruction of the Giant Bacteriophage AR9 tail at Subnanometer Resolution Microscopy and Microanalysis,, 29S1, 2023, 934–935 (год публикации - 2023) https://doi.org/10.1093/micmic/ozad067.464

2. Рафаэль Айала, Майя Стрит, Андрей Моисеенко, Евгений Куликов, Александр Кузнецов, Ольга С. Соколова, Маттиас Вольф, Андрей Летаров. Reconstruction of the Entire RB43 Bacteriophage by Single Particle Cryo-EM Microscopy and Microanalysis, 29(S1), 2023, 928–929 (год публикации - 2023) https://doi.org/10.1093/micmic/ozad067.460

3. Рафаэль Аяла, Андрей В. Моисеенко, Тинг-Хуа Чен, Евгений Е. Куликов, Алла К. Голомидова, Филипп С. Орехов, Майя А. Стрит, Ольга С. Соколова, Андрей В. Летаров, Маттиас Вольф Nearly complete structure of bacteriophage DT57C reveals architecture of head-to-tail interface and lateral tail fibers Nature Communications, - (год публикации - 2023)

4. Сироткин И., Моисеенко А., Соколова О. THREE-DIMENSIONAL CRYO-ELECTRON MICROSCOPY RECONSTRUCTION OF THE TAIL OF GIANT BACTERIOPHAGE AR9 Riccem2023 book of abstracts, стр 44 (год публикации - 2023)

5. Сироткин И.А., Моисеенко А.В. Трехмерная реконструкция гигантского бактериофага AR9 методом криоэлектронной микроскопии Материалы Международного молодежного научного форума «ЛОМОНОСОВ-2023», стр 1 (год публикации - 2023)

Возможность практического использования результатов
Полученные результаты исследования LTF фага DT57C и обнаружение молекулярного сенсора, модулирующего адсорбционную специфичность этого вируса открывают новые возможности для создания гибридных фибрилл с целью инженерии спектров хозяев этих бактериофагов. С учетом того, что рецептор-распознающие домены белков LtfA и LtfB гомологичны, полученные структуры LtfB могут быть интерпретированы и для соответствующего фрагмента LtfA. Соответственно, открывается возможность идентификации непосредственно рецептор-сзвязывающего участка с целью его комбинаторного изменения без поиска донорных гомлогичных доменов. Также полученная структура позволит предсказывать потенциальную совместимость с рецептор-распознающими модулями других структурных типов. Особенности устройства LTF и физиология инфекции фага DT57C делают данный объект привлекательной моделью для отработки таких манипуляций и оптимизации самого связывания. Эти возможности возникают из-за того, что при изменении одного из белков разветвленной LTF фаги могут быть отобраны и будут жизнеспособны, если даже второй белок не будет полностью функционален. Впоследствии будет возможность добиться лучшей эффективности связывания измененного белка с помощью дополнительных генно- инженерных манипуляций или путем постепенного улучшения функции в ходе эволюции в лабораторном микрокосме. В случае фагов с единственным белком, связываюшим первичный рецептор, как например, у фага Т4, любое вторжение в структуру этого адгезина должно сразу же обеспечивать высокую эффективность инфекции нового штамма хозяина, поскольку иначе рекомбинантный фаг будет нежизнеспособен.