Аннотация результатов, полученных в 2021 году
Подготовлен обзор современных российских и зарубежных источников научной литературы по способам и методикам влияния акустико-механических воздействий на процессы криоконсервации клеток животных и рыб, теоретические исследования по подбору параметров электро-механического воздействия на репродуктивные клетки рыб. Среди наиболее важных и прорывных направлений исследований является использование в технологии низкотемпературного консервирования репродуктивных клеток новых электрофизических методов. Результаты различных исследований показывают, что применение ультразвука, акустического воздействия, высокого давления, электрических и магнитных полей, а также биологических белков для содействия или ускорения процесса замораживания демонстрирует большой потенциал технологий низкотемпературного консервирования репродуктивных клеток рыб. Для исследования применения пьезоактуаторов в технологии низкотемпературного консервирования репродуктивных клеток (спермы) рыб была разработана теоретическая модель создания акустическо-механического воздействия на этапе эквилибрации при проведении процесса криоконсервации. Объектом акустическо-механического воздействия являлась суспензия – смесь биологического материала (репродуктивных клеток, спермиев) с криозащитной средой (криопротектором). Создана уникальная теоретическая модель акустическо-механического воздействия и интеллектуального управления процесса подготовки к криоконсервации и глубокого замораживания репродуктивных клеток рыб (сперма). В основе разработанной модели заложены механические, электрические параметры пьезоактуатора, создающего акустико-механические вибрации в заданном объеме пространства в виде поверхностных и объемных отраженных волн от биологического материала. При этом учитываются: - механические свойства суспензии (смеси криопротектора и биоматериала); – механические и электрические параметры самого пьезоактуатора; - геометрические и механические параметры емкости, в которой находится суспензия (смесь криопротектора и биоматериала). Математическая модель воздействия пьезоактуатора на репродуктивные клетки рыб при криоконсервации построена в рамках механики сплошной среды. Для этого использованы уравнения механики деформируемого твердого тела (в частности линейной теории упругости и электроупругости) и уравнения движения жидких и газообразных сред (в акустическом приближении). Созданная теоретическая модель при проведении численных экспериментов позволила учесть: механические и электрические параметры самого пьезоактуатора, создающего акустическо-механическое воздействие; геометрические параметры пьезоактуатора; геометрические и механические параметры сосуда с суспензией, на которую направлено акустическо-механическое воздействие; параметры создаваемого акустическо-механического воздействия в заданном объеме пространства; проявление поверхностных эффектов в виде волн, отраженных от стенок сосуда и свободной поверхности суспензии; наличие отраженных объемных волн от самого биоматериала. В результате использования разработанной модели были подобраны наиболее оптимальные геометрические и электрические параметры акустико-механического воздействия (частота воздействия, разметы емкости и диаметр пьезоактуатора) для создания максимально эффективного воздействия на суспензию (смесь клеток с криопротектором) при подготовке к криоконсервации. Достоверность численных экспериментов, основанных на построенной теоретической модели, была подтверждена натурными экспериментами. Разработанная теоретическая модель может быть использована при подборе наиболее оптимальных и эффективных параметров акустико-механического воздействия при проведении не только лабораторных, но промышленных процессов криоконсервации репродуктивных клеток. Проведено тестирование разных конструкций пьезоактуаторов и численные эксперименты в исследуемой среде. Для решения данной задачи и с целью возможностей практического использования данных моделей были исследованы различные подходы, реализован связанный акустический, вибромеханический и гидродинамический анализ, основанный на свойствах среды, конечно-элементных подходах к протекающим гидродинамическим процессам и разработки интеллектуальных сопряжениях программных средств, основанных на конечно-элементных и конечно-объемных аппроксимациях и соответствующих алгоритмах. Численные эксперименты проводились на основе конечно-элементной формулировке построенной теоретической модели. Численная реализация проводилась в программных комплексах конечно-элементного анализа ANSYS и ACELAN. При проведении численных экспериментов строились графические зависимости от радиуса пьезоэлемента: – частоты резонанса; – частоты антирезонанса; – коэффициента электромеханической связи (КЭМС), определенного по Мэзону через частоты резонанса и антирезонанса. Так же строились зависимости от частоты колебаний: формы колебаний сосуда с суспензией; величины радиального смещения (по модулю); величины вещественной части радиального смещения; величины мнимой части радиального смещения; распределение скоростей в суспензии; распределение давления в суспензии; действительной и мнимой частей потенциала скоростей; осевой и радиальной составляющей скорости. При проведении численных экспериментов варьировались размеры пьезоэлементов. Кроме того, были рассмотрены емкости разных размеров. Анализ полученных результатов показывает, что существует радиус пьезоэлемента, при котором КЭМС (коффициент электро - механической связи) принимает максимальное значение на первой изгибной моде. Использование данного размера пьезоэлемента позволит наиболее эффективно возбуждать акустические волны в суспензии. В результате численных экспериментов получено распределение изолиний в объеме, занимаемом суспензией, вблизи резонансной частоты первой изгибной моды. Выполненный анализ полученных результатов свидетельствует о наличии положительной и отрицательной составляющей вертикальной и горизонтальной скорости. Это явление обусловлено влиянием отраженных волн в виде возникающих поверхностных и объемных эффектов. Таким образом, возникновение отраженных волн должно вызвать перемешивание суспензии внутри объема стакана, что будет способствовать улучшению процесса проникновения крио-протектора в клетки на этапе эквилибрации. Разработаны и испытаны несколько лабораторных образцов пьезоактуаторов различных конфигураций с определенными механическими и электрическими параметрами для целей криоконсервации на основе ранее разработанных теоретических моделей. Для определения максимально эффективного воздействия криозащитной среды на биологический материал (половые клетки) изготовлены лабораторные образцы, различающиеся местами расположения пьезоактуаторов: Пьезоактуатор №1 (внешний) представляет собой круглую пластинку с элементом из пьезокерамики PZT-4 толщиной 0,003 м, диаметром 0,02 м прикрепленную с внешней стороны ко дну стандартного стеклянного лабораторного низкого градуированного стакана B-1-50 XC. По электрическим проводам на электроды подается переменная разность потенциалов по гармоническому закону с амплитудой V_0. Дно стакана и пьезоэлемент образуют полупассивный биморф, поэтому приложение переменной разности потенциалов на электроды пьезоэлемента приводит к поперечным колебаниям дна емкости. Эти колебания создают акустическое поле в суспензии криопротектора и биоматериала, которое воздействует на репродуктивные клетки. Пьезоактуатор №2 представляет собой полый пьезокерамический цилиндр, расположенный внутри стакана с суспензией. Рабочим элементом пьезоактуатора является элемент из пьезокерамики PZT-4. Вектор предварительной поляризации пьезокерамики направлен по радиусу цилиндра. Электроды продеты через полипропиленовую крышку и выведены на цилиндрические поверхности пьезоактуатора. По электрическим проводам на электроды подается переменная разность потенциалов по гармоническому закону с амплитудой V_0. Приложение переменной разности потенциалов на электроды пьезоэлемнта приводит к радиальным колебаниям цилиндрического пьезоактуатора. Эти колебания создают акустическое поле в суспензии криопротектора и биоматериала, которое воздействует на репродуктивные клетки. В результате численных экспериментов определены оптимальные геометрические размеры. Натурные эксперименты подтвердили полученные результаты. Получены результаты влияния воздействия пьезоактуаторов на качество подготовки растворов криоконсерваторов с биообъектом и последующей динамики криозаморозки в процессе низкотемпературного консервирования. Эксперименты экустико-механического воздействия разной частоты, при напряжении 10-15 В, в течение 1 минуты позволило получить положительные результат в варианте с частотой 500 Гц. Репродуктивные клетки стерляди (спермии) имели высокие показатели выживаемости, при активности 30% в сравнении с нативной спермой без акустико-механического воздействия. Микроскопическое исследование спермиев в опытном варианте показало, что клетки не имели повреждений, а время жизни при поступательном движении составляло 180 сек. Следует отметить, что акустико-механическое воздействие не только позволит снизить время проникновения криопротектора внутрь клеток, защитить их от токсического воздействия веществ, входящих в состав протекторов, сохранить репродуктивные клетки после дефростации с высокими показателями выживаемости. Ссылки на информационные ресурсы в сети Интернет (url-адреса), посвященные проекту: https://donstu.ru/news/nauka/uchenye-dgtu-i-yunts-ran-issleduyut-vliyanie-akustiko-mekhanicheskogo-vozdeystviya-na-reproduktivnye/ https://ria.ru/20210513/dgtu-1732007353.html https://rostovnadonu.bezformata.com/listnews/vozdeystviya-na-reproduktivnie/93740093/

Аннотация результатов, полученных в 2022 году
Все пункты плана выполнены в полном объеме; достигнуты следующие индикаторные показатели: опубликованы 4 статьи (Scopus); результаты исследований доложены на 7-х международных и 4-х Всероссийских конференциях. Полученные в рамках выполнения гранта научные результаты являются новыми, оригинальными и ранее не описанными. В результате исследований была преобразована математическая модель воздействия пьезоактуатора на репродуктивные клетки рыб при криоконсервации с учетом температуры происходящих процессов за счет использования уравнения Менделеева-Клапейрона, основное уравнение молекулярно-кинетической теории газа, основное уравнение термодинамики равновесных процессов. Граничные условия математической модели дополнены условиями, определяющими взаимодействие потока тепла с границами сосуда, а также находящимися в потоке телами. Проведено компьютерное моделирование процесса криоконсервации на основе упрощенной математической модели задачи Стефана. В модели использовали уравнение теплопроводности, в котором моделирование процесса фазового перехода твердое тело-жидкость осуществляется с помощью задания скачка теплоемкости в виде дельта-функции. Моделируется учет теплоты фазового перехода, при этом сама подвижная граница этого перехода не строится, а найдена как изотерма. Разработана компьютерная программа на основе этой математической модели с использованием метода конечных элементов. Проведен численный эксперимент, в котором решена нестационарная задача описывающая процесс кристаллизации. На всех границах рассматриваемой области (кроме одной) задается низкая температура -196 градусов Цельсия, что моделирует помещение емкости с раствором в жидкий азот. Получены результаты: распределение температуры по объему лабораторного стакана с суспензией (биологический материал и криопротектор) по радиусу; распределение температуры по объему лабораторного стакана с суспензией вдоль вертикальной оси; изменение температуры в отдельных точках с течением времени. Анализ проведенных расчетов показывает, что учет изменения теплоемкости значительно влияет на распределение температуры по объему стакана пезоактаутора. Разработана математическая модель диффузии компонент криоагента сквозь мембрану клетки. Модель строится на основе двух этапов. Решена задача об установившихся колебаниях и определяется распределение скоростей в растворе, которые создаются действием пьезоактуатора. Рассмотрена начально-краевая задача для двух уравнений массопереноса для двухкомпонентной жидкости (криопротектор и содержимое клетки). Решалась нестационарная задача с начальным распределением криопротектора во внешней области клетки. Исследован вопрос проникновения криопротектора сквозь мембрану и его накопление внутри клетки в зависимости от параметров процесса (частоты, амплитуды скорости, направления скорости и др.). С этой целью разработана компьютерная модель процесса и ее численная реализация методом конечных элементов. Проведены численные эксперименты, которые показали, что наиболее существенную роль в процессе проникновения криопротектора внутрь клетки играет модуль скорости и ее направление. Построена математическая модель движения спермиев в двигающейся среде криопротектора, описываемой уравнениями турбулентности: уравнением Навье-Стокса; уравнением неразрывности. Для проведения численных экспериментов выбрана к-е модель. Для описания движения спермиев в движущейся среде (суспензии) последовательно использованы разные механические модели: модель материальной точки (спермий представляется в виде материальной точки); модель абсолютно твердого тела (спермий представляется в виде твердого тела эллипсообразной формы); модель гидроаэродинамическая (движение спермия представляется как движение твердой частицы в воздушном потоке и описывается уравнениями Навье-Стокса). Сформулированная начально-краевая задача не допускает аналитического решения и должна решаться численно в программном комплексе конечно-элементного анализа. Для этого на основе построенной математической модели разработана конечно-элементная компьютерная программа. Впервые установлено, что акустико - механическое воздействие на замораживаемый материал с определенными параметрами частоты и времени воздействия способствует увеличению сохранности репродуктивных клеток рыб, увеличению активности спермиев до 90% живых клеток с поступательным движением при времени движения 19 минут. Проведенные эксперименты по оплодотворению икры стерляди дефростированной спермой показали, что клетки после акустико механического воздействия с частотой 500 Гц показали наилучшие результаты в сравнении с контролем. Определено оптимальное время аккустико - механического воздействия, которое составило 1 минуту.

Аннотация результатов, полученных в 2023 году
1. Проведены исследования влияния акустическо-механического воздействия пьезоактуаторов с разработанными оптимальными параметрами (частота, длинна волны, время воздействия) на выживаемость репродуктивных клеток разных видов осетровых рыб: русского осетра (Acipenser gueldenstaedtii Brandt et Ratzeburg, 1833) сибирского осетра (Acipenser baeri Brandt ) и белуги (Huso huso Linnaeus, 1758). Исследование широкого диапазона частот воздействия от 200 Гц до 600 Гц с интервалом в 100 Гц и два варианта 1кГц и 2кГц в течение 1-ой минуты в период эквилибрации (соприкосновения протектора с биологическим материалом) показало, что самая высокая выживаемость клеток была отмечена при частоте воздействия 400 Гц и 500 Гц при напряжении 15 В. Высокая выживаемость спермиев белуги отмечена при воздействии частотой 400 Гц и 500Гц, которая составила 54% и 67,5%, при времени подвижности 420с и 450с, соответственно. Отмечено, что у русского и сибирского осетров спермии после воздействия имели высокую выживаемость при частоте воздействия 400 Гц, от 68 до 70% живых активных клеток, показатели выживаемости были выше чек в контроле. В результате исследований установлены оптимальные параметры акустико-механического воздействия на клетки осетровых рыб при частоте 400 Гц напряжении 15В при времени воздействия в течение 1-й минуты. Разработан алгоритм выбора оптимальных параметров управления процессом замораживания с применением пьезоактуаторов при акустико-механическом воздействии для интеллектуального управления процессом замораживания репродуктивных клеток рыб. 2. Исследованы морфофизиологические изменения спермиев русского осетра (Acipenser gueldenstaedtii Brandt et Ratzeburg, 1833) и стерляди (Acipenser ruthenus Linnaeus, 1758) после глубокого замораживания, выявлены наиболее распространенные повреждения, такие как слипание спермиев, поломка или отсутствие жгутиков. Установлено, что у дефростированных спермиев русского осетра замороженных с использованием акустико-механического воздействия количество морфологически поврежденных клеток было меньше на 4-5%, у стерляди на 3-5%, в сравнении с изменениями у спермиев, замороженных по стандартной методике. После воздействия процент активно движущихся спермиев у русского осетра был высоким от 48% до 69%, у стерляди от 42 % до 71%, в контроле, 37 % и 40 %, соответственно. Оценка времени подвижности спермиев после активации показала, что подвергавшиеся воздействию клетки перед глубокой заморозкой начали двигаться через 30-45 с, имели четко выраженное поступательное движение. Время движения у русского осетра находилось в пределах от 360 до 620 с, на 20 % выше контроля, у стерляди в пределах 380с до 640с на 15 % выше. Оценка фертильности спермиев при оплодотворении яйцеклеток русского осетра и стерляди показала, что спермии имели высокую способность к оплодотворению, процент оплодотворения яйцеклеток русского осетра составил 70%, стерляди 75%. 3. На основе разработанного алгоритма для создания программного модуля выполнялось математическое моделирование акустическо-механического воздействия пьезоактуатора на смесь репродуктивных клеток и криопротектора для этого была создана математическая модель воздействия пьезоактуатора на клетки рыб при криоконсервации и построена в рамках механики сплошной среды. Построенная модель представляет собой начально-краевую задачу и в общем случае её решение может быть получено только численно с использованием соответствующих программных комплексов конечно-элементного анализа. Проведенная серия численных экспериментов позволила выполнить модальный анализ, найти резонансные частоты, определить коэффициент электромеханической связи в зависимости от радиуса пьезоэлемента. На основании построенной математической модели построена компьютерная модель в программном комплексе свободно распространяемого программного обеспечения конечно-элементного анализа ACELAN. Показано, что в компьютерной модели в визуальном режиме варьируется радиус пьезокерамической пластины (пьезоактуатора) и в зависимости от выбранного радиуса пьезоэлемента полупассивный биморф генерирует различные акустические поля, а они определяют частоты резонанса, антирезонанса и коэффициента электромеханической связи. Для компьютерной модели процесс проникновения диффузии через мембрану клетки был описан системой дифференциальных уравнений, основанных на законах Фика и уравнением состояния среды. Построена континуальная осесимметричная математическая модель процесса кристаллизации с учётом фазового перехода, но без явного выделения фазовой границы с учетом того, что теплоемкость на фронте свободной границы (границе фазового перехода) изменяется по закону, учитывающему размытость этой границы. 4. Проведены исследования по оплодотворению нативной икры криоспермой, замороженной с применением акустико-механического воздействия показали высокие результаты, процент оплодотворения был в контроле 82%, в опыте 69%, выход свободных эмбрионов в контроле составил 75%, в опыте 60%. Отмечено, что свободные эмбрионы после вылупления и личинки после перехода на активное питание полученные из консервированной спермы по развитию не отличались от потомства, полученного из нативной спермы. Показано, что после выхода свободных эмбрионов из оболочек количество уродливых личинок, было небольшое, в опыте 1,5%, в контроле 1%. В результате показано, что из дефростированной спермы получается полноценное потомство. Свободные эмбрионы по массе достоверно не отличались от контроля, достоверные отличия (р<0,05) были отмечены после перехода личинок на активное питание при массе 21,28±1,01 мг и длине 14,30±0,40 мм в контроле, и опыте при массе 23,02±0,37, длине 15,03±0,42 мм. 5. Оценка полученного потомства от криоконсервированной и дефростированной спермы проведенная в тесте «открытое поле» по изменению двигательной активности молоди стерляди при ответной реакции на различного рода раздражители (удар, звук и свет), выявила изменения в поведении молоди после перехода молоди на активное питание. Установлено, что в группах опыта достоверных отличий между вариантами полученных средних значений АО (ориентировочная активность) и ФА (фоновая активность) не отмечено. Проведение теста «открытое поле» показало, что реактивность ЦНС ранней молоди стерляди полученной от дефростированной спермы, не отличалась от контрольной группы, но показатели ориентировочной и фоновой активности были выше, и молодь быстрее адаптировалась к новым условиям. Молодь в опытных группах быстрее реагировала на разные раздражители и в некоторых группах имела достоверные отличия от контроля. Динамика двигательной активности демонстрировала более интенсивную реакцию молоди в опыте на раздражители, что имеет большое значение при адаптации молоди к разным условиям водной среды. 6. Подготовлена и подана заявка на патент полезной модели «Установка для акустическо-механического воздействия при низкотемпературном консервировании». 7. Подготовлена и подана заявка на патент «Способ акустико-механического воздействия при низкотемператуном консервировании».