КАРТОЧКА ПРОЕКТА ФУНДАМЕНТАЛЬНЫХ И ПОИСКОВЫХ НАУЧНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ,
ПОДДЕРЖАННОГО РОССИЙСКИМ НАУЧНЫМ ФОНДОМ

Информация подготовлена на основании данных из Информационно-аналитической системы РНФ, содержательная часть представлена в авторской редакции. Все права принадлежат авторам, использование или перепечатка материалов допустима только с предварительного согласия авторов.

 

ОБЩИЕ СВЕДЕНИЯ

Номер 18-15-00313

НазваниеРазработка фотофармакологических подходов для коррекции тормозных процессов в центральной нервной системе при неврологических заболеваниях

РуководительБрежестовский Петр Дмитриевич, Доктор биологических наук

Организация финансирования, регион федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Казанский государственный медицинский университет" Министерства здравоохранения Российской Федерации, Республика Татарстан (Татарстан)

Период выполнения при поддержке РНФ 2021 г. - 2022 г. 

Конкурс Конкурс на продление сроков выполнения проектов, поддержанных грантами Российского научного фонда по приоритетному направлению деятельности Российского научного фонда «Проведение фундаментальных научных исследований и поисковых научных исследований отдельными научными группами» (28).

Область знания, основной код классификатора 05 - Фундаментальные исследования для медицины, 05-106 - Нейробиология

Ключевые словаГенетически кодируемые сенсоры ионов; хлорный гомеостаз; трансгенные мыши; нейродегенеративные заболевания; болезнь Альцгеймера; фотофармакология; синаптическая передача; срезы мозга; рецептор-управляемые ионные каналы; ГАМК рецепторы; глициновые рецепторы.

Код ГРНТИ34.39.17

СтатусУспешно завершен

 

ИНФОРМАЦИЯ ИЗ ЗАЯВКИ

Аннотация
Проект Российского научного фонда, выполняемый в Институте нейронаук Казанского Государственного Медицинского Университета, направлен, прежде всего, на поиск и исследование новых фотоуправляемых соединений регулирующих тормозную активность мозга (фотофармакология), а также создание моделей для неинвазивной регистрации внутриклеточных ионов с помощью генетически кодируемых светорегулируемых биосенсоров (оптосенсорика). В процессе реализации проекта за 2018-2020 годы, в рамках фотофармакологии, были синтезированы и отобраны три новых химических фотохромных соединения, способные, при освещении разными длинами волн света, изменять активность двух основных классов тормозных рецепторов нервной системы: рецепторов ГАМК и глицина. Это –химические конструкции: Azo-NZ1 - молекула, состоящая из азобензена и нитро-диазепама; Glyght – молекула, синтезированная на основе 7-амино-нитразепама и 2-нитропиридина, а также фульзазепам – потенциатор ГАМК рецепторов, который синтезирован на основе нитразепама и фототохрома фульзимида. Эти соединения представляет большой интерес, поскольку могут быть основой для создания эффективных светоуправляемых аллостерических потенциаторов и ингибиторов тормозных ГАМК и глициновых рецепторов, в частности, модуляторов синаптической передачи на ранних стадиях постнатального развития и, возможно, усиления тормозной ГАМК-эргической активности. Эти управляемые светом молекулярные переключатели являются перспективными для модуляции синаптических процессов в различных моделях нейропатологий. Однако необходимы дополнительные исследования действия этих фотохромных соединений на нейрональную активность и модуляцию синаптической передачи в срезах мозга, а также на специфичность действия. В рамках развития другого направления, оптосенсорики, были созданы линии трансгенных мышей позволяющие неинвазивный анализ ионов Cl- и Н+ в нейронах мозга трансгенных мышей. Используя метод CLARITY, была создана карта экспрессии генетически кодируемого сенсора Cl- и Н+ (ClopHensor) в мозге трансгенных мышей. Также проведён предварительный анализ изменений внутриклеточных концентраций этих ионов, вызванных частотной стимуляцией синаптической передачи в срезах мозга. Эта новая линия трансгенных мышей является важным и перспективным инструментом для неинвазивного анализа внутриклеточных концентраций ионов и активности нейрональных сетей в экспериментальных моделях нервных патологий. Этот анализ представляет большой интерес, поскольку в основе развития многих патологий нервной системы лежит дисбаланс возбуждения и торможения в нейрональных сетях, в том числе - вследствие нарушения функций тормозных ГАМК-ергических и глицинергических синапсов и изменений внутриклеточных концентраций ионов, прежде всего ионов хлора. Выяснение ионных градиентов, а также эффективности действия фотохромов, которые модулируют функции быстрых тормозных синапсов, может принести важную информацию для перспективной стратегии создания высокоэффективных, локально действующих фармакологических соединений. В общем, эти исследования являются важными и перспективными, поскольку создание фотохромных лигандов - одно из направлений, создающих базу для развития терапевтических подходов «медицины будущего». Управляя активностью фотохромных лигандов можно обеспечивать локальное и быстрое управление различными макромолекулярными структурами организма обеспечивая высокую целенаправленность действия светоуправляемых химических соединений.

Ожидаемые результаты
В результате реализации планируемых задач: 1. Будет проведён анализ действия новых фото-управляемых соединений, модулирующих активность рецепторов ГАМК и глицина. Будут выяснены возможные побочные эффекты их действия, влияние на кинетику и амплитуду вызванных синаптических токов, а также миниатюрных токов через постсинаптические рецепторы глутамата, ГАМК и глицина. 2. В срезах мозга трансгенных мышей экспрессирующих биосенсор Cl- и Н+ (ClopHensor) будет проведен: - анализ изменений ионных градиентов нейронов, вызванных синаптической стимуляцией в срезах мозга в контроле и при действии антагонистов постсинаптических рецепторов; - анализ изменений концентраций Cl- и Н+ в пресинаптических нервно-мышечных окончаниях. 3. Будет проведён анализ действия фотохромных соединений в моделях эпилепсии in vitro: (i) электрофизиологическая регистрация синаптических токов; (ii) анализ изменения внутриклеточных концентраций ионов хлора и водорода на срезах мозга трансгенных мышей в норме и при моделях эпилептических кризов. Этот анализ представляет большой интерес, поскольку в основе развития многих патологий нервной системы лежит дисбаланс возбуждения и торможения в нейрональных сетях, в том числе - вследствие нарушения функций тормозных ГАМК-ергических и глицинергических синапсов и изменения концентраций ионов хлора. 4. Будет исследована возможность применения фотохромного соединения для коррекции нейрональных функций в бета-амелоидной модели болезни Альцгеймера. 5. Будет проведён анализ побочных эффектов действия ультрафиолетовой стимуляции. Это - важная проблема, поскольку новые фотохромы переключаются в цис-конфигурацию короткими волнами (380нм). Однако известно, что ультрафиолетовое (УФ) воздействие, в зависимости от интенсивности и длительности воздействия, может изменять свойства многих белков. Поэтому, необходимо провести исследования, чтобы выяснить пределы интенсивности и длительности УФ воздействия и выработать безопасные протоколы экспериментальной работы. 6: Будут созданы новые отечественные программы для контроля осветителями и анализа флуоресцентных сигналов. Это также очень важная задача, поскольку методы неинвазивного анализа функций клеток с использованием светочувствительных флуоресцентных зондов приобретают всё более широкое применение, а отечественные программы приёма и анализа этих сигналов практически отсутствуют. Проведённые исследования позволят значительно расширить и прояснить возможности двух приоритетных направлений: фотофармакологии и оптосенсорики. Новые линии трансгенных мышей уже переданы в несколько лабораторий, научных и медицинских центров России и в будущем будут использоваться для неинвазивного анализа ионов в клетках нервной системы. Полученные нами фотохромные соединения при более расширенном анализе будут служить базой для создания фармакологических соединений, действующих высокоизбирательно, локально и в строго контролируемые временные интервалы.

 

ОТЧЁТНЫЕ МАТЕРИАЛЫ

Аннотация результатов, полученных в 2021 году
Проводимые в 2021 году исследования были сосредоточены на развитии двух направлений: фотофармакологии и оптосенсорики. Первое (фотофармакология) нацелено на поиск и исследование новых фотоуправляемых соединений, регулирующих тормозную активность мозга, а второе (оптосенсорика) – на создание моделей для неинвазивной регистрации внутриклеточных концентраций ионов с помощью генетически кодируемых биосенсоров, собранных на основе флуоресцентных белков. В рамках фотофармакологии проводился анализ специфичности действия разработанного нами соединения Glyght, которое, как было показано ранее, является эффективным фотоуправляемым модулятором глициновых рецепторов. Этот класс рецепторов принадлежит к семейству Цис-петельных трансмембранных белков и обеспечивает торможение в спинном мозге, сетчатке, а также в некоторых отделах мозга человека и животных. Чтобы выяснить эффекты соединения на близкие по структуре и функциям ГАМК-рецепторы, были проведены эксперименты на нейронах срезов мозга мышей с регистрацией вызванных синаптических токов. Показано, что Glyght не модулирует напрямую работу ГАМК рецепторов. Также в опытах с парной фасилитацией выяснено, что Glyght не влияет на выброс квантов нейромедиатора. Эти результаты доказывают высокую избирательность действия нового фотоуправляемого соединения, Glyght, на глицинергические синапсы в нервной системе млекопитающих. В рамках другого направления, оптосенсорики, проводилась регистрация внутриклеточных концентраций ионов хлора (Cl-) и водорода (H+) в нейронах мозга и пресинаптических нервно-мышечных окончаниях трансгенных мышей, экспрессирующих специфический флуоресцентный биосенсор ClopHensor, позволяющий проводить одновременную и неинвазивную регистрацию концентраций этих ионов. Эффективность и надежность ClopHensor была проверена в различных экспериментальных условиях. Анализировали изменения ионов в нейронах срезов гиппокампа при деполяризации, вызванной повышением ионов калия, а также высокочастотной синаптической стимуляцией коллатералей Шаффера. Показано, что кинетика восстановления внутриклеточной концентрации ионов хлора после высокочастотной стимуляции примерно в 4.5 раз быстрее, чем кинетика восстановления pH. Внутриклеточные концентрации ионов хлора и водорода были также проанализированы в условиях с измененным содержанием Ca2+, Cl-, K+ и Na+ в наружном растворе. Полученные результаты освещают различные пути регуляции равновесия Cl- и H+ в нейронах и демонстрируют, что разные транспортные системы вовлечены в поддержание гомеостаза этих ионов. Было выяснено, что ClopHensor экпрессируется не только в нейронах мозга, но также в периферических нервах, обеспечивая визуализацию нервных окончаний. В рамках задач данного проекта мы оценили возможность измерения уровней хлора и pH в двигательных нервных окончаниях трансгенных мышей. Проведенные опыты показали, что стимуляция двигательного нерва приводит к снижению интенсивности флуоресценции препарата при облучении светом с длиной волны 514 нм. Эти изменения угнетаются при ингибировании выброса квантов нейромедиатора из пресинаптических окончаний с помощью блокатора кальциевых каналов, что свидетельствует о функциональной эффективности ClopHensor в исследуемом препарате. В целом эти этапы исследований по развитию двух экспериментальных направлений, фотофармакологии и оптоспенсорики, показали: (i) эффективность и избирательность действия фотохрома Glyght на синаптические токи в срезах мозга мышей; (ii) высокую надёжность и перспективность использования трансгенных мышей, экспрессирующих ClopHensor, для неинвазивного мониторинга внутриклеточных концентраций ионов хлора и водорода. Все этапы научной работы, заявленные в календарном плане на 2021 год успешно выполнены.

 

Публикации

1. Пономарева Д.Н., Петухова Е.О., Брежестовский П.Д. Simultaneous Monitoring of pH and Chloride (Cl-) in Brain Slices of Transgenic Mice International Journal of Molecular Sciences, - (год публикации - 2021)

2. Брежестовский П.Д., Пономарева Д.Н. Photochromic Modulation of Cys-loop Ligand-gated Ion Channels Journal of Evolutionary Biochemistry and Physiology, Vol. 57, No. 2, pp. 354–371. (год публикации - 2021) https://doi.org/10.1134/S0022093021020162

3. Петухова Е.О., Пономарева Д.Н., Мухамедьяров М.А., Брежестовский П.Д. Фотоуправляемая модуляция тормозных постсинаптических токов Самойловские чтения. Современные проблемы нейрофизиологии: сборник тезисов Всероссийской конференции с международным участием, посвященной 145-летию кафедры физиологии человека и животных. Казань: Издательство Казанского университета, С. 48-49. (год публикации - 2021)

4. Пономарева Д.Н., Петухова Е.О., Брежестовский П.Д. Фотоуправляемая модуляция глицинергических и ГАМК-ергических постсинаптических токов VIII МЕЖДУНАРОДНЫЙ МОЛОДЕЖНЫЙ НАУЧНЫЙ МЕДИЦИНСКИЙ ФОРУМ "БЕЛЫЕ ЦВЕТЫ", ПОСВЯЩЕННЫЙ 120-ЛЕТИЮ СТУДЕНЧЕСКОГО НАУЧНОГО ОБЩЕСТВА ИМЕНИ ИРИНЫ АНДРЕЕВНЫ СТУДЕНЦОВОЙ. Сборник статей по итогам конференции., С. 1120-1121 (год публикации - 2021)

5. Пономарева Д.Н., Петухова Е.О., Брежестовский П.Д. Применение фотофармакологических подходов для модуляции тормозных постсинаптических токов V Российский симпозиум с международным участием «Клеточная сигнализация: итоги и перспективы». Тезисы докладов., С. 92-93 (год публикации - 2021)

6. Пономарева Д.Н., Петухова Е.О., Брежестовский П.Д. Изменение внутриклеточной концентрации ионов хлора и водорода при высокочастотной стимуляции V Российский симпозиум с международным участием «Клеточная сигнализация: итоги и перспективы». Тезисы докладов., С. 94-95 (год публикации - 2021)

Аннотация результатов, полученных в 2022 году
В 2022 году продолжались исследования, направленные на развитие двух перспективных направлений: фотофармакологии и оптосенсорики. В рамках фотофармакологии проводился дополнительный анализ специфичности действия разработанного нами фотохромного соединения Glyght, которое, как было показано ранее, является эффективным фотоуправляемым модулятором глициновых рецепторов. Глициновые рецепторы обеспечивает быстрое синаптическое торможение в спинном мозге, сетчатке, а также в некоторых отделах мозга человека и животных. Нарушения функций этих рецепторов связано с развитием нервных патологий, включая гиперплексию и эпилепсию. Поэтому создание высокоизбирательных модуляторов этих рецепторов является важной задачей. Используя парную стимуляцию нервов, а также специфические антагонисты, было доказано, что Glyght не влияет на ГАМК-рецепторы и не модулирует кальциевую проводимость в пресинаптических окончаниях. Эти данные позволяют предполагать, что Glyght является перспективным фотохромным соединением, высокоизбирательно модулирующим функции глициновых рецепторов. В рамках выполнения задач по направлению оптосенсорики, помощью трансгенных мышей, экспрессирующих биосенсор Cl- и Н+ (ClopHensor) был проведен анализ: (i) изменений ионных градиентов нейронов, вызванных синаптической стимуляцией в срезах мозга; (ii) исследование хлорного и рН гомеостаза в 4-аминопиридиновой модели эпилепсии на срезах гиппокампа. Используя систему для регистрации флуоресцентных сигналов, на срезах мозга трансгенных мышей, экспрессирующих ClopHensor, проведён анализ действия специфического блокатора α-карбоангидразы, катализирующго реакцию гидратации CO2 до HCO3- на изменения внутриклеточного хлора и водорода при синаптической активации нейронов. Полученные результаты указывают на то, что бринзоламид вызывает: а) уменьшение базового уровня внутриклеточного Cl- и б) увеличение амплитуды рН-градиентов, вызванных синаптической стимуляцией. Проведены исследования по анализу изменений ионов Cl− и Н+ в условиях экспериментальной модели эпилепсии, сопровождающейся повышенной активностью нейрональных сетей. Полученные результаты позволили определить базовые значения концентраций Н+ и Cl-, а также характер изменений [Cl−]i и рН в модели возникновения эпилептический активности в нейронах срезов гиппокампа трансгенных мышей В целом эти этапы исследований по развитию двух направлений, фотофармакологии и оптоспенсорики показали: а) эффективность и избирательное действие фотохрома Glyght на синаптические токи в срезах мозга мышей; б) высокую надёжность использования трансгенных мышей, экспрессирующих генетически кодируемый сенсор для одновременной регистрации внутриклеточных концентраций ионов хлора и водорода; в) перспективность анализа ионного гомеостаза Cl− и Н+ в разных экспериментальны моделях, включая эпилепсию. Все основные этапы научной работы, заявленные запланированных на весь срок выполнения проекта выполнены. Основные результаты исследований опубликованы в работах: Int J Mol Sci. 2022 Sept 12;23:10553. doi: 10.3390/ijms231810553 Int J Mol Sci. 2021 Dec 18;22(24):13601. doi: 10.3390/ijms222413601 Biochem. Moscow Suppl. Ser. A. 2022 Aug 15:16:183–189. doi: 10.1134/S1990747822040080 J Evol Biochem Phys. 2022 Oct 31:58:1664–1673. doi:10.1134/S0022093022050349 Int J Mol Sci. 2022 Oct 26 :23 :12921. doi: 10.3390/ijms232112921

 

Публикации

1. Брежестовский П.Д. A Long-liver and a Knight of Science. To the 100th Anniversary of B. I. Khodorov Biochemistry (Moscow) Supplement Series A: Membrane and Cell Biology, 16(3):183-189. (год публикации - 2022) https://doi.org/10.1134/S1990747822040080

2. Давидюк Ю.Н., Юсупова А.Х., Петухова Е.О. Брежестовский П.Д. A Test System for Monitoring the Genetic Purity of Transgenic Mouse Lines Expressing Chloride and Hydrogen Biosensor Journal of Evolutionary Biochemistry and Physiology, 58, 1664–1673 (год публикации - 2022) https://doi.org/10.1134/S0022093022050349

3. Петухова Е.О., Пономарева Д.Н., Растлер К., Кониг В., Брежестовский П.Д. Action of the Photochrome Glyght on GABAergic Synaptic Transmission in Mouse Brain Slices International Journal of Molecular Sciences, 23(18): 10553. (год публикации - 2022) https://doi.org/10.3390/ijms231810553

4. Брежестовский П.Д., Пономарева Д.Н., Петухова Е.О. Photopharmacological and optosensoric analysis of neuronal functions Тезисы докладов. – СПб.: Институт эволюционной физиологии и биохимии им. И.М. Сеченова РАН., C. 130. (год публикации - 2022)

5. Петухова Е.О., Пономарева Д.Н., Брежестовский П.Д. Modulation of inhibitory processes in the brain by synthetic photoswitchable compounds Тезисы докладов. – СПб.: Институт эволюционной физиологии и биохимии им. И.М. Сеченова РАН., C. 107. (год публикации - 2022)

6. Пономарева Д.Н., Петухова Е.О., Брежестовский П.Д. Simultaneous monitoring of the intracellular Cl- and pH changes in neurons of transgenic mice Тезисы докладов. – СПб.: Институт эволюционной физиологии и биохимии им. И.М. Сеченова РАН., C. 149. (год публикации - 2022)

7. Матера К., Брежестовский П.Д. Light-Controlled Modulation and Analysis of Neuronal Functions International Journal of Molecular Sciences, 23(21):12921 (год публикации - 2022) https://doi.org/10.3390/ijms232112921

Возможность практического использования результатов
не указано