Аннотация результатов, полученных в 2021 году
1) С помощью электрофизиологического метода патч-кламп на корково-гиппокампальных срезах мозга крыс были изучены изменения возбудимости нейронов энторинальной коры, происходящие во время генерации эпилептиформных разрядов. Была охарактеризована динамика проводимости мембраны как в режиме генерации иктальных разрядов, так и в режиме эпилептического статуса с продолжительной генерацией коротких залпов активности. Было обнаружено, что в обоих случаях проводимость мембраны увеличивается преимущественно за счет активации калиевых каналов, причём в режиме эпилептического статуса эта активация зависит от входа ионов кальция внутрь нейронов и приводит к шунтированию инициации последующих эпилептиформных событий, тем самым определяя частоту разрядов. Эти эффекты были описаны математической моделью. В частности, модель воспроизводит нетривиальный эффект учащения разрядов при уменьшении возбуждения, опосредующего вход кальция. По результатам работы была опубликована статья [Amakhin DV, Soboleva EB, Chizhov AV, Zaitsev AV. Insertion of Calcium-Permeable AMPA Receptors during Epileptiform Activity In Vitro Modulates Excitability of Principal Neurons in the Rat Entorhinal Cortex. International Journal of Molecular Sciences. 2021; 22(22):12174. https://doi.org/10.3390/ijms222212174]. В режиме генерации иктальных разрядов был изучен эффект аппликации монензина, антипортера ионов натрия и протонов. Приводя к накопления ионов натрия внутри клеток, монензин способствует активации натрий-калиевой АТФазы (помпы), которая, согласно нашей гипотезе (http://doi.org/10.12751/nncn.bc2021.p025), играет одну из ключевых ролей в завершении иктальных разрядов и формировании межразрядных интервалов. Наши предварительные эксперименты подтвердили, что монензин препятствует генерации иктальных разрядов и способствует переходу в режим генерации интериктальных разрядов. 2) Мы опробовали новый оптогенетический инструмент, разработанный в МФТИ, - светоуправляемую натриевую помпу KR2. Обнаружены эффекты влияния на активность отдельных нейронов и сетевую эпилептиформную активность, причём выявлены как анти-, так и проэпилептические эффекты. В дальнейших экспериментах будут изучены механизмы, лежащие в основе наблюдаемых эффектов. Сопоставление с противоположным агентом – монензином – и математической моделью позволит проверить гипотезу о ключевой роли натрий-калиевой помпы и возможности предотвращать иктальные разряды, активируя помпу. 3) Мы разработали компьютерную программу, позволяющую реализовывать протоколы динамической стимуляции, когда моменты подачи стимула в реальном времени зависят от регистрируемой активности. Были опробованы протоколы электрической стимуляции, связанной с регистрациями полевых потенциалов и стимуляцией светом в оптогенетических экспериментах с внутриклеточными регистрациями. В первом случае, для режима эпилептического статуса были получены предварительные результаты по измерению функции фазовой восприимчивости (phase response curve), характеризующей способность колебательной системы реагировать на стимул, подаваемый в разную фазу между разрядами. Согласование этих данных с упомянутой математической моделью позволит лучше понять спонтанный механизм генерации разрядов и выработать алгоритм управления. В случае оптогенетических экспериментов со светоуправляемой натриевой помпой KR2, мы показали работоспособность стимуляции и, подавая стимулы в конце каждого разряда в режиме эпилептического статуса, предварительно обнаружили изменение формы разрядов при сохранении их частоты. 4) Мы построили биофизически подробную модель распространяющихся иктальных разрядов и описали механизм их медленного распространения со скоростью меньше 1 мм/с. Было показано, что в основе распространения фронта иктального разряда лежит локальная синаптическая передача с последующей локальной экструзией ионов калия из нейронов, тогда как диффузия ионов калия во внеклеточном пространстве происходит медленнее и не влияет на скорость иктального разряда. Результаты изложены в статье, находящейся на рассмотрении в журнале. 5) Мы рассмотрели вопрос, касающийся интерпретации методики имиджинга. Изменение яркости отраженного от нейронов света во время генерации эпилептиформных разрядов может быть связано с изменением механического напряжения мембран и их деформацией при прохождении электрических сигналов. Мы построили простую математическую модель деформации мембраны под воздействием электрического импульса (https://doi.org/10.1007/978-3-030-91581-0_22), которая согласуется с литературными экспериментальными данными. 6) Мы сравнили особенности развития эпилептиформной активности у здоровых крыс и крыс на разной стадии эпилептогенеза (в латентную и хроническую фазы литий-пилокарпиновой модели височной эпилепсии) при одновременной записи полевых потенциалов в переживающих срезах мозга в поле СА1 гиппокампа и в глубоких слоях энторинальной коры. Мы показали, что локальные энторинальные и гиппокампальные сети демонстрируют разные, но стереотипные паттерны остро развивающейся эпилептиформной активности в здоровой ткани мозга. Эти паттерны не изменяются в мозге крыс, перенесших эпилептический статус. Энторинальная кора генерирует, в основном, тонико-клонические события. В то же время, гиппокамп показывает различные паттерны ответа у крыс разного возраста. Гиппокамп молодых крыс (Р 21) на ранней стадии развития эпилептиформной активности генерирует иктальные события, а на поздней - интериктальные. У взрослых крыс (Р55) основным паттерном ответа являются интериктальные разряды, а также иктальные, приходящие из других областей мозга. В целом в срезах мозга крыс, переживших эпилептический статус, выявлено снижение количества событий и их спектральной плотности во всем диапазоне частот. Показано, что эпилептический статус сильно снижает нейротрансмиссию и синаптическую пластичность в гиппокампе. Эти характерные особенности локальной эпилептиформной активности могут быть полезны для раскрытии механизмов генерации эпилептической активности и работы мозга при его нормальном функционировании.

Аннотация результатов, полученных в 2022 году
В 2022 г были продолжены исследования нейронных механизмов эпилептической активности и поиск способов управления ею. Последнее подразумевает поиск возможных путей перевода аномальной синхронизованной активности нейронов во время эпилептического приступа в менее опасные формы, которые хуже распространяются по нейронной сети, или в меньшей мере провоцируют дальнейшие патологические пластические изменения. Для этого исследование проводится на модельных объектах – срезах энторинальной коры головного мозга грызунов, в которых с помощью совокупности хемоконвульсантов воспроизводится аномальная эпилептическая активность. В отчетном году было показано, что определенные подтипы калиевых каналов (кальций-зависимые калиевые каналы малой проводимости и АТФ-зависимые калиевые каналы) препятствуют возникновению деполяризационного блока генерации потенциалов действия у пирамидных нейронов во время эпилептоподобного состояния. Активация АТФ-зависимых калиевых каналов способствует более быстрому завершению залпа эпилептиформной активности. Также было установлено, что активность HCN-каналов способствует снижению интенсивности эпилептиформной активности. Этот эффект реализуется за счет двух механизмов: за счет поддержания проводимости мембраны на высоком уровне и, предположительно, за счет увеличения периода повышенной активности нейрональной натрий-калиевой АТФазы после эпилептического разряда. Были исследованы особенности формирования повторно-индуцированной эпилептиформной активности в поле СА1 гиппокампа и в глубоких слоях энторинальной коры. Мы показали, что локальные энторинальные и гиппокампальные нейронные сети генерируют стереотипные паттерны индуцированной с помощью хемоконвульсантов эпилептиформной активности как в ткани мозга здоровых крыс, так и крыс с хронической эпилепсией. При этом в энторинальной коре преобладают продолжительные иктальные (тонико-клонические) события, а в гиппокампе происходит регулярная генерация коротких разрядов. Полученные данные об особенностях локальной эпилептиформной активности свидетельствуют о том, что хроническая эпилепсия снижает активность гиппокампальной сети из-за повреждения клеток и их гибели. Это приводит к ослаблению влияния гиппокампа на энторинальную кору. Эти результаты важны как с точки зрения борьбы с эпилепсией, так и с точки зрения понимания принципов работы мозга при его нормальном функционировании. Сравнение математических моделей с экспериментальными данными выявило необходимость пересмотра существующих моделей единичного нейрона. Было установлено, что ни одна из известных моделей не согласуется с должной точностью, если сравнение проводится одновременно по нескольким критериям, а нейрон в качестве стимула получает не только ток, но и синаптическую проводимость. Мы предложили своё решение этой проблемы в виде относительно простой математической модели с традиционными и модифицированными уравнениями для проводимостей ионных каналов. Наша модель с точность лучшей, чем у известных моделей, воспроизводит ограниченный диапазон стимулирующих токов и проводимостей, при котором наблюдается генерация потенциалов действия; не завышает частот спайкования; и показывает более реалистичную форму мембранного потенциала между спайками. Предложенная модель единичного нейрона позволила модифицировать популяционную модель, применяемую для моделирования сетевых процессов, в который возбуждение нейронов может достигать границы деполяризационного блока. Одним из перспективных оптогенетических инструментов управления активностью нейронов является светоуправляемая натриевая помпа KR2 (Kovalev et al., 2019). Она представляет собой белок, гены которого доставляются в нейроны с помощью вирусного вектора, способный выкачивать ионы натрия из клетки при подаче на него светового стимула. В ходе работы по гранту РНФ анализировалась возможность применения этого инструмента для воздействия на эпилептическую активность. Для этого были изучены свойства трансмембранных токов, возникающих в нейронах коры головного мозга, экспрессирующих этот белок. Показано, что в ответ на остановку светостимуляции KR2 происходит активация HCN-каналов провоцирующая синаптическую активность в нейронной сети. С помощью математического моделирования, основанного на полученных экспериментальных данных, было показано, что потенциальные антиэпилептические эффекты определяются как гиперполяризующим током помпы, так и вызванным гиперполяризацией снижением концентрации внеклеточного калия, тогда как проэпилептические эффекты связаны с уменьшением внутриклеточной концентрацией ионов натрия и дезактивацией Na-K насоса. На данный момент продолжается разработка протоколов управления различными типами эпилептиформной активности с использованием этого инструмента. Результаты исследований опубликованы в следующих статьях: Chizhov et al., 2022; Ictal wavefront propagation in slices and simulations with conductance-based refractory density model. PLoS Computational Biology. https://journals.plos.org/ploscompbiol/article?id=10.1371/journal.pcbi.1009782 Soboleva et al., 2022, Modulation of seizure-like events by the small conductance and ATP-sensitive potassium ion channels. BBRC. https://www.sciencedirect.com/science/article/abs/pii/S0006291X22010270 Kotikova and Chizhov, 2022, Hyperbolic equations for neuronal membrane deformation waves accompanying an action potential. BBRC https://www.sciencedirect.com/science/article/abs/pii/S0006291X21017630 Kotikova et al., 2023, Shunting Effect of Synaptic Channels Located on Presynaptic Terminal. Advances in Neural Computation, Machine Learning, and Cognitive Research VI. Neuroinformatics 2022. Studies in Computational Intelligence https://link.springer.com/chapter/10.1007/978-3-031-19032-2_23

Аннотация результатов, полученных в 2023 году
В 2023 г были продолжены исследования клеточных механизмов эпилептического припадка и поиск способов его подавления. Исследование проводилось с применением in vitro моделей острого судорожного состояния – срезах энторинальной коры головного мозга грызунов, в которых эпилептическая активность воспроизводится с помощью хемоконвульсантов. В ходе работы получены экспериментальные свидетельства в пользу гипотезы влияния HCN-каналов на динамику работы натрий-калиевой АТФазы в паузах между эпилептиформными разрядами. Вход ионов натрия через эти каналы в периоды продолжительной следовой гиперполяризации способствует более продолжительному поддержанию гиперактивности натрий-калиевой АТФазы в паузу между разрядами. Эффект блокады HCN-каналов на динамику активности натрий-калиевой АТФазы может быть окклюдирован повышением внутриклеточной концентрации ионов натрия и имитирован локальной аппликацией блокатора данного фермента. Было изучено участие в процессе генерации эпилептиформной активности нескольких типов ионных каналов, активность которых зависит от внутриклеточной концентрации ионов кальция: кальций-зависимые калиевые каналы (SK и IK-типов) и TRPM-каналов. Показано, что вовлеченность кальций-зависимых калиевых каналов зависит от продолжительности паттерна эпилептиформной активности. Для непродолжительных разрядов активация этих каналов не влияет на процесс терминации эпилептиформного разряда, тогда как более продолжительный залп способствовал сильной активации этих каналов. Что касается TRPM-каналов, то нам удалось показать, что их активность необходима для инициализации эпилептиформной активности в энторинальной коре, но не важна для ее поддержания. В рамках исследования возможности изменения эпилептиформной активности путем экстраклеточной стимуляции было показано, что эффективность электрической стимуляции в режиме квазипериодической генерации коротких разрядов зависит от того, в какую фазу между разрядами подаются стимулы. Мы разработали метод анализа и в сравнении экспериментов с математическими моделями изучили фазовую чувствительность нейросети к стимуляции. Этот результат позволяет оптимизировать стимуляцию в режиме обратной связи. Биофизически реалистичное моделирование сетевой активности требует реалистичности от модели единичного нейрона по критериям, которые ранее не предъявлялись. Мы предложили новый вариант однокомпартментной модели, количественно согласованной с нашими данными экспериментальных регистраций методом динамического патч-клампа в пирамидном нейроне, в частности, с двумерными характеристиками, в которых параметры спайкования зависят не только от синаптического тока, но и от синаптической проводимости [Chizhov et al. // Biol. Cybernetics 2023]. Были продолжены исследования возможности подавления эпилептиформной активности с помощью оптогенетической стимуляции. Показано, что новый инструмент оптогенетики - светоуправляемая натриевая помпа KR2 – способен влиять на эпилептические разряды. Был подобран режим светостимуляции, который приводит к нарушению генерации иктальной активности в энторинальной коре и замещению ее на менее тяжелую форму – регулярную генерацию непродолжительных эпилептиформных разрядов. Эффект реализуется за счет рикошетной деполяризации, опосредованной HCN-каналами [Trofimova et al. // Molecular Neurobiology, Accepted]. Механизмы эффекта натриевой помпы KR2 также были реализованы в математической модели. Были объяснены как анти-, так и проэпилептические эффекты KR2. Кроме того, модель предсказывает сильное антиэпилептическое действие гипотетической оптоуправляемой натрий-калиевой помпы, что указывает на актуальность разработки такого инструмента подавления патологической активности. Применяя фотостимуляцию KR2 в режиме с обратной связью, в определенную фазу после очередной короткой вспышки, мы наблюдали непрекращающийся режим генерации интериктально-подобной активности, которая предотвращает появление иктальных разрядов.