Аннотация результатов, полученных в 2021 году
Проект направлен на исследование феномена специфического для митохондриальных белков увеличения/снижения их содержания в скелетной мышце, вызванного хронически повышенным и пониженным уровнем двигательной активности и старением и сопряженного с изменением структурно-функционального состояния митохондриального ретикулума. На первом этапе работы по Проекту были запланировано проведение экспериментов, направленных на изучение влияния шаперонов семейства Hsp70 на скелетную мышцу при старении и при хроническом увеличении уровня двигательной активности. Это семейство состоит из нескольких гомологичных белков; это означает, что подавление активности одного из генов этого семейства может быть компенсировано другими его членами. Поэтому для оценки роли белков семейств HSP70 в регуляции биогенеза митохондрий и фенотипа мышц была использована модель – линия Drosophila melanogaster Hsp70- (Df(3R)Hsp70A, Df(3R)Hsp70B) с нокаутом 6 (из тринадцати) генов этого семейства, а также контрольная родительская линия w1118. На первом этапе работы по Проекту было запланировано проведение экспериментов с мухами и коллекционирование образцов мушиных конечностей для последующего протеомного анализа скелетных мышц мух на втором этапе работы. Помимо этого, были запланирована отработка методик по масс-спектрометрическому и протеомному анализу, проведение подготовительных работ по организации исследования с участием молодых и пожилых добровольцев, а также отработка методики измерения функциональных возможностей митохондрий и их системы защиты от избыточной продукции активных форм кислорода, связанной с АТФ-трансферазами, в образцах мышечной ткани от пожилых добровольцев. Исследования по изучению эффектов старения и хронического снижения двигательной активности на регуляцию содержания белков в скелетной мышце человека запланированы на второй и третий этапы работы по Проекту. Согласно заявке на первом этапе были выполнены следующие работы: I. Были отработаны протоколы культивирования мух разных линий и тестирования их локомоторной активности (скорость бега мух по вертикали), а также сконструировано устройство для ежедневных локомоторных тренировок мух. Показано, что продолжительность жизни мутантной линии не отличается от контрольной линии, но при этом локомоторная активность (скорость бега по вертикали) у мух линии Hsp70- в два раза ниже, чем у контроля. Для исследования этого феномена была отработана процедура препарирования конечностей (состоящих преимущественно из хитина и скелетных мышц) и отработаны протоколы выделения их них белков и РНК для количественно (с изобарической меткой) масс-спектрометрического и транскриптомного анализа (РНК секвенирование). При сопоставлении протеома мышц старых мух (47 дней) обоих линий было показано, что, в соответствии с нашей гипотезой, нокаут белков семейства Hsp 70 снижает концентрацию цитохрома с и 5-ти белков цитохром с оксидазы – терминального и скорость лимитирующего (IV-го) комплекса электрон-транспортной цепи митохондрий, а также ферментов пентоз-фосфатного шунта, регуляторов синтеза и деградации гликогена. Тогда как, увеличение концентрации было найдено для карнитин-пальмитоилтрансферазы I – митохондриального транспортера жирных кислот и для ферментов бета-окисления. Логичным продолжением этой части работы является сопоставление различий в протеоме и транскриптоме мышц молодых особей разных линий, демонстрирующих выраженные различия в локомоторной активности, а также исследование возраст-зависимых изменений для каждой из линий. Эти исследования (протеомный и транскриптомный анализ образцов, полученных на текущем этапе работы) запланированы на второй год работы по Проекту. II. Были проведены подготовительные работы по организации исследований с участием молодых и пожилых добровольцев и отработаны экспериментальные программы обследования добровольцев. Взятие биопсических проб из m. vastus lateralis у молодых (25-40 лет) здоровых добровольцев запланировано нами в ГНЦ РФ Институте медико-биологических проблем РАН, а у пожилых (65-80 лет) добровольцев (пациенты, направленные на плановую операцию по замене коленного сустава) – в Университетской клинике Медицинского научно-образовательного центра МГУ имени М.В. Ломоносова. Для проведения этих работ на первом этапе работы была оформлена вся необходимая разрешительная документация. Помимо этого, были отработаны и оптимизированы протоколы для: 1) оценки доли мышц и жира на бедре (компьютерная томография), 2) выделения РНК, белков и митохондрий из скелетных мышц пожилых людей, характеризующихся увеличенным содержанием соединительной ткани, 3) оценки функциональных возможностей выделенных митохондрий: продукция перекиси водорода и дыхание митохондрий при добавлении субстратов для АТФ-трансфераз, локализованных на внешней мембране митохондрий (гексокиназа и креатинкиназа). Мы предположили, что при старении и при хронически сниженном уровне двигательной активности в скелетных мышцах людей будет происходить снижение активности механизма защиты от избыточной продукции активных форм кислорода, связанного с этими ферментами. В пилотном исследовании (пробы от двух пожилых и четырех молодых людей) были обнаружены выраженные возраст-зависимые изменения этих показателей. Согласно заявке, исследование этих показателей в пробах m. vastus lateralis у молодых людей (возраст 20-40 лет, 20 человек) и пожилых пациентов с хронически сниженной двигательной активностью (возраст 60-75 лет, 20 человек) будет проведено на втором этапе работы по Проекту.

Аннотация результатов, полученных в 2022 году
Проект направлен на исследование феномена специфического увеличения/снижения экспрессии митохондриальных белков в скелетной мышце при хронически повышенной/пониженной двигательной активности и старении. Для достижения поставленной цели мы исследовали: I) Влияние шаперонов семейства Hsp70 на экспрессию генов митохондриальных белков в скелетной мышце при хроническом увеличении двигательной активности и при старении. Была использована модель – линия Drosophila melanogaster Hsp70- (Df(3R)Hsp70A, Df(3R)Hsp70B) с нокаутом 6 (из 13) генов этого семейства (Gong and Golic 2004). Хроническое повышение двигательной активности у мух моделировалось с помощью вызванных (геотаксис-индуцированных) локомоций (Sujkowski and Wessells 2018); молекулярные исследования были выполнены на конечностях мух, состоящих, преимущественно, из мышц. На текущем этапе работы мы завершили проведение всех экспериментов с мухами и закончили все запланированные транскриптомные исследования. II) Влияние хронического воспаления, снижения двигательной активности и возраста на транскриптом (в том числе гены митохондриальных белков) и протеом скелетной мышцы человека. Было проведено комплексное исследование физиологических, биохимических и молекулярных показателей в биопсических пробах скелетных мышц (n=59) у молодых здоровых добровольцев, молодых и старых пациентов с первичным артрозом коленного/тазобедренного сустава – модель хронического воспаления и снижения двигательной активности (Callahan et al. 2014; Callahan et al. 2015; Miller et al. 2017). На текущем этапе работы мы досрочно завершили взятие всех запланированных биопсических проб (n=59), проведение физиологических и биохимических исследований у добровольцев, а также досрочно закончили все запланированные транскриптомные и протеомные исследования образцов скелетной мышцы человека. I. Влияние шаперонов семейства Hsp70 на экспрессию генов митохондриальных белков в скелетной мышце при хроническом увеличении двигательной активности и при старении. Используя модель D. melanogaster с множественным нокаутом мы впервые показали, что гены семейства Hsp70 определяют уровень работоспособности (скорость бега по вертикали) мух и регулируют их адаптацию (увеличение работоспособности) к хронически повышенной двигательной активности (20-дневные локомоторные тренировки, 1,5 ч в день). На уровне скелетных мышц конечностей этот эффект, в частности, связан с изменением экспрессии генов-регуляторов углеводно-жирового обмена и генов митохондриальных белков. Молекулярные механизмы шаперон-зависимого изменения экспрессии этих генов не ясны; изучение этих механизмов представляется перспективной задачей. Белки семейства Hsp70 выражено модулируют возраст-зависимые изменения транскриптома скелетных мышц мух, однако не оказывают заметного влияния на продолжительность жизни как в обычных условиях, так и при хроническом увеличении двигательной активности. II. Влияние хронического воспаления, снижения двигательной активности и возраста на генную экспрессию в скелетной мышце человека: поиск генов, ассоциированных со старением. При сопоставлении пожилых пациентов с молодыми здоровыми людьми были выявлены масштабные изменения транскриптома, ассоциированные с активацией провоспалительного ответа и подавлением биогенеза митохондрий, что согласуется с данными литературы по сравнению молодых здоровых и старых людей (de Magalhaes et al. 2009; Su et al. 2015; Voutetakis et al. 2015; Palmer et al. 2021). Оказалось, что большинство из этих изменений были обнаружены у молодых пациентов при сравнении со здоровым контролем, что связано с наличием хронического системного воспаления и снижением двигательной активности и свидетельствует о ключевой роли этих факторов в развитии старческого фенотипа скелетной мышцы. Сопоставление пожилых и молодых пациентов впервые позволило выявить возраст-зависимые изменения транскриптома при хроническом воспалении и снижении уровня двигательной активности, и затем выделить из них 135 генов, ассоциированных со старением (гены, однонаправленно изменяющие экспрессию в этом сравнении и при сопоставлении старых пациентов с молодым контролем). Изменение экспрессии генов, ассоциированных со старением, было связано с активацией репарации ДНК и подавлением экспрессии мРНК митохондриальных антиоксидантных ферментов и регуляторов сборки митохондриальных комплексов. Эти данные согласуются с нашими данными о возраст-зависимой активации продукции H2O2 выделенными митохондриями и поддерживают гипотезу о роли АТФ-трансферез, ассоциированных с митохондриальной мембраной (например, креатинкиназа), в возраст-зависимом увеличении генерации H2O2 митохондриями (Vyssokikh et al. 2020). Количественный масс-спектрометрический протеомный анализ позволил детектировать более 1000 белков во всех исследуемых образцах (n=59); первичный анализ данных вывил изменение экспрессии более 100 белков при сравнении старых пациентов и молодого контроля. Детальный анализ этих данных и их сопоставление с транскриптомными данными запланировано на следующий этап Проекта. Помимо этого, на третий этап запланировано проведение рибосомального профилирования (трансляция индивидуальных мРНК) на образцах скелетных мышц человека и сопоставление полученных данных с результатами транскриптомного и протеомного анализов (полученных на текущем этапе работы).

Аннотация результатов, полученных в 2023 году
В Проекте исследовались механизмы, регулирующие экспрессию генов в скелетной мышце (в частности, генов, кодирующих митохондриальные белки) при повышенном и пониженном уровне двигательной активности и старении. Для решения поставленной задачи были проведены исследования на мухах Drosophila melanogaster и с участием добровольцев. На третьем (заключительном) этапе работы был закончен сбор и обработка данных (масс-спектрометрический протеомный анализ и секвенирование РНК) по всем экспериментам; с помощью биоинформатических подходов проведен комплексный анализ всех данных, полученных за три года работы. Учитывая большой объем полученных данных, в отчете за третий этап работы представлены обобщенные за все годы работы результаты исследований на мухах, а данные исследований с участием добровольцев – ключевые результаты настоящего Проекта – в общем отчете за все этапы выполнения Проекта. В этой части работы были поставлены и успешно решены следующие задачи: 1) Изучить влияние нокаута шести генов семейства Hsp70 на транскриптом мышц ног и скорость локомоций Drosophila melanogaster при увеличении двигательной активности. 2) Изучить влияние нокаута шести генов семейства Hsp70 на возрастные изменения экспрессии генов в мышцах ног, скорости локомоций и продолжительности жизни Drosophila melanogaster. В последнее десятилетие Drosophila часто используется в качестве модели для изучения механизмов адаптации к физическим упражнениям (Sujkowski and Wessells 2018). Эксперименты с нокаутом генов играют важную роль для понимания их функции. Семейство Hsp70 (Hspa) состоит более чем из 10 генов; подавление экспрессии одного из них могут компенсировать другие гены этого семейства, что затрудняет интерпретацию результатов таких экспериментов. Поэтому для исследования влияния генов семейства Hsp70 (Hspa) на работоспособность и возрастные изменения транскриптома скелетных мышц мы использовали линию Drosophila melanogaster с нокаутом шести генов Hsp70 (Hsp70Aa, Hsp70Ab, Hsp70Ba, Hsp70Bb, Hsp70Bbb, Hsp70Bc), ортологов генов Hspa1a, Hspa1b, Hspa2 и Hspa8 млекопитающих. Для определения экспрессии генов мы выделяли РНК и белки из ног мух, состоящих преимущественно из мышечных пучков и хитинового каркаса (Soler et al. 2004) и использовали широкозахватные методы: РНК-секвенирование и количественный (с изобарической изотопной меткой) масс-спектрометрический анализ протеома. Кроме того, оценивали скорость локомоций (скорость перемещения вверх) в тесте на отрицательный геотаксис – показатель, характеризующий функциональное состояние и выносливость мух (Sujkowski and Wessells 2018), и продолжительность жизни мух с обычным и хронически повышенным уровнем двигательной (локомоторной) активности. Сначала было изучено влияние нокаута генов Hsp70 на скорость локомоций 7-и и 23-х суточных (молодых) мух и их способность адаптироваться к увеличению двигательной активности (локомоторные тренировки 1,5 ч/сут., 7 дней/нед., 3 нед.). Мы обнаружили, что молодые мухи Hsp70– (возраст 7 и 23 сут.) демонстрируют выраженное (в 2 раза) снижение скорости локомоций (рис. 2А) и масштабные изменения транскриптома скелетных мышц ног относительно контрольной линии w1118. Для выявления функций генов, ассоциированных со снижением скорости локомоций, были проанализированы мРНК, изменившие экспрессию в обеих временных точках. Среди них увеличили экспрессию гены, кодирующие регуляторы метаболизма ксенобиотиков (цитохромы P450) и антиоксидантного ответа (глутатион S-трансферазы), а снизили экспрессию гены, кодирующие различные трансмембранные белки и ферменты углеводного обмена (в частности, пентозофосфатного пути). Используя метод позиционных весовых матриц, мы показали, что изменения транскриптома у мух Hsp70– ассоциированы с активацией транскрипционных факторов, связанных с нарушением структуры фибрилл и ответом на тепловой шок (Hsf). Регулярные тренировки увеличили скорость локомоций только у мух линии w1118. Этот прирост был ассоциирован с кратковременным увеличением экспрессии генов после каждой тренировочной сессии, которое регулировалось транскрипционными факторами, связанными со стрессорным/иммунным (Hsf, NF-kB и т. д.) и ранним ответом генов. Напротив, мухи Hsp70– не отвечали на регулярные тренировки, что было связано с выраженным подавление ответа генов на однократную нагрузку. Таким образом, мы впервые продемонстрировали, что нокаут генов Hsp70 не только снижает физическую работоспособность, но и нарушает адаптацию к регулярным физическим тренировкам, что связано с изменениями в экспрессии генов скелетных мышц. Затем мы изучили влияние нокаута генов Hsp70 на возрастные изменения экспрессии генов в скелетных мышцах ног (7-, 23- и 47-е сутки жизни). У мух w1118 возрастное снижение скорости локомоций в тесте на отрицательный геотаксис сопровождалось выраженным изменением транскриптомного профиля скелетных мышц ног, носящим консервативный характер. У мух Hsp70– медианная продолжительность жизни была меньше, чем у контрольных мух; одновременно наблюдались комплексные изменения возрастной динамики транскриптома скелетных мышц. Количественный масс-спектрометрический анализ протеома выявил разнонаправленные изменения в содержании ключевых ферментов метаболизма глюкозы и окисления жиров (гликолиз, пентозофосфатный путь, цикл Кребса, бета-окисление и окислительное фосфорилирование) у 47-суточных мух Hsp70–относительно w1118. Такая дисрегуляция была ассоциирована с компенсаторным увеличением экспрессии других генов, кодирующих шапероны (малые Hsp, Hsp40, 60 и 70), которые регулируют специфичные наборы белков-мишеней. Совокупность полученных нами данных показывает, что нокаут шести генов Hsp70 несколько уменьшает медианную продолжительность жизни мух, но выраженно снижает скорость их локомоций, что может быть связано с комплексными изменениями транскриптома скелетных мышц ног и с разнонаправленными изменениями в содержании ключевых ферментов энергетического метаболизма.