Аннотация результатов, полученных в 2021 году
На момент окончания первого этапа выполнения проекта были получены культуры МСК из Вартонова студня пуповины, пульпы молочного зуба и жировой ткани, а также хондроциты из реберной дуги человека. Во всех исследованных культурах мезенхимальных стромальных клеток методом проточной цитофлуориметрии был выявлен высокий уровень экспрессии CD44, СD73, CD90, CD105. В то же время ни в одной из рассматриваемых культур не наблюдалось экспрессии CD34, CD45 или HLA-DR, являющихся маркерами гемопоэтических стволовых клеток. Мультипотентность исследованных культур была определена по способности клеток к дифференцировке in vitro в остеобласты, адипоциты и хондробласты. Скорость пролиферации и миграции полученных МСК сравнивали у культур второго, пятого и десятого пассажей. Была показана явная тенденция к снижению скоростей пролиферации и миграции клеток при длительном пассировании. Были отработаны методы получения трехмерных сфероидных культур, которые являются оптимальным вариантом трехмерного культивирования, позволяющим исключить взаимодействие клеток с пластиком при поддержании высокого уровня межклеточных взаимодействий. Были выбраны два метода получения сфероидов, как наиболее пригодные для выполнения запланированных в проекте работ, а именно, культивирование сфероидов в низкоадгезивных 96-луночных планшетах с полукруглым дном и культивирование сфероидов в агарозных 3D чашках Петри. Витальное окрашивание продемонстрировало высокий процент жизнеспособных клеток во всех образцах, единичные мертвые клетки присутствовали как в толще сфероидов, так и на их поверхности. Живые клетки вне сфероидов отсутствовали, тогда как присутствие единичных мертвых клеток свидетельствовало о способности полученных трехмерных структур отделять детрит, образующийся в результате естественной гибели отдельных клеток. Колориметрическая оценка уровня активности лактатдегидрогеназы позволила определить, что количество жизнеспособных клеток в сфероидах при продолжительном культивировании (до 10 суток) меняется незначительно. Параллельно в ходе реализации проекта было проведено исследование, направленное на определение оптимального протокола получения клеточного носителя - биологического миметика внеклеточного матрикса суставного хряща, являющегося, помимо клеток , вторым основным компонентом клеточно-инженерной конструкции. Был подобран оптимальный режим криопомола для получения максимального выхода микрочастиц 100-250 мкм. Возможность их инъекционного введения была подтверждена при прохождении микрочастиц через иглу с внутренним диаметром 540 мкм в составе суспензии. Было проведено сравнительное исследование влияния различных децеллюляризирующих техник, таких как, предварительная лиофилизация, соникация, резкие перепады температуры, обработка протеиназой и осмотический шок, в комбинации с традиционной обработкой детергентами на сохранность внеклеточного матрикса. Для дальнейших работ было выбрано три протокола, основанных на последовательной инкубации образцов в растворах поверхностно-активных веществ и ДНКазы I типа. Первый протокол дополнительно включал предварительное тройное сухое замораживание (-196°С) и оттаивание (37°С), второй протокол содержал стадию инкубации в растворе трипсина (0,05 %), а третий отличался использованием соникации при инкубации в растворах поверхностно-активных веществ. Эффективность децеллюляризации была подтверждена отсутствием ядерного материала в лакунах при окрашивании DAPI и содержанием ДНК в образцах на уровне менее 50 нг / мг ткани, что указывает на низкую иммуногенность полученных носителей. При гистологическом метода окрашивании альциановым синим гликозаминогликаны наблюдали лишь в образце, полученном с использованием соникации. Полученные данные были полностью подтверждены биохимическими исследованиями: в образцах, полученных с использованием соникации, наблюдали сохранение гликозаминогликанов в значительно большей степени (58±6 мкг/мг ткани), что более чем в 7 раз превышает содержание гликозаминогликанов для остальных исследованных режимов. Было показано, что содержание фибриллярного коллагена в 1 мг ткани при использовании режима с соникацией (417±47 мкг) значимо не изменяется по сравнению с исходным суставным хрящом свиньи (508±103 мкг), тогда как при остальных режимах оно значительно снижается. Таким образом, исследование образцов суставного хряща, децеллюляризованного по трем изученным протоколам децеллюляризации, с использованием биохимических методов, а также гистологического и флуоресцентного окрашивания, подтвердило эффективность освобождения матрикса от клеток и детрита и продемонстрировало различие степени сохранения основных структурных компонентов внеклеточного матрикса, гликозаминогликанов и фибриллярного коллагена, в зависимости от выбранного комплекса воздействий. Сравнительное исследование хондрогенной дифференцировки МСК при культивировании на полученных образцах клеточного носителя позволит оценить критичность потери компонентов внеклеточного матрикса при децеллюляризации. Биохимический анализ позволил определить, что полученный при лизировании пепсином микрочастиц децеллюляризованного хряща прегель в 1 мл содержал гликозаминогликаны в концентрации 0,31±0,03 мг и фибриллярный коллаген в концентрации 1,38±0,11 мг, что указывает на перспективность дальнейшей разработки технологии получения на его основе тканеспецефического геля. По оценке скорости седиментации микрочастиц децеллюляризованного хряща было выбрана оптимальная композиция гидрогеля (АО «БИОМИР сервис», Россия), обеспечивающая устойчивость композитного матрикса к оседанию частиц и равномерное распределение микрочастиц децеллюляризованного хряща по объему. Согласно исследованию in vitro цитотоксичности на культуре МСК жировой ткани человека и гемолитической активности, тканеспецифический матрикс из децеллюляризованного хряща свиньи обладает биосовместимыми свойствами.

Аннотация результатов, полученных в 2022 году
Целью второго этапа выполняемого проекта явился подбор оптимального состава клеточно-инженерной конструкции (КИК) для внутрисуставного введения. Для этого хондрогенный потенциал мезенхимальных стромальных клеток (МСК) из жировой ткани, Вартонова студня пуповины и пульпы молочного зуба человека был подвергнут разностороннему сравнительному анализу. При этом были параллельно применены два принципиально разных способа трехмерного культивирования МСК: в первом случае клетки были иммобилизованны на матриксах, полученных из децеллюляризированного хряща, а во втором на их основе были получены трехмерные сфероиды. В результате проведенного сравнительного анализа полученных образцов тканеинженерных конструкций гистологическими и иммуногистохимическими методами на предмет выявления в них продукции внеклеточного матрикса в ответ на индукцию хондрогенной дифференцировки был сделан вывод о том, что жировая ткань является предпочтительным среди рассмотренных источников МСК для применения в составе тканевого эквивалента хряща. Анализ методом ПЦР-РВ показал, что повышение уровня транскрипции всех трёх исследованных генов альфа-1-цепей коллагенов (COL1A1, COL2A1, COL10A1) происходит только в сфероидах из МСК жировой ткани, что говорит о более высоком хондрогенном потенциале МСК жировой ткани по сравнению с МСК Вартонова студня пуповины и МСК пульпы зуба. Таким образом по гистологической картине и данным количественной оценки экспрессии коллагена II типа сфероиды на основе МСК жировой ткани оказались наиболее близки к сфероидам из первичных хондроцитов, принятым за положительный контроль. Далее была исследована in vitro способность кондиционированной среды МСК Вартонова студня пуповины, МСК пульпы молочного зуба и МСК жировой ткани стимулировать пролиферацию хондроцитов человека в двумерных условиях. К 14 суткам конфлюэнтность монослоя в опытных группах не различалась и составляла 55% и 57%, что в 1,2 раза превышало площадь поверхности, занимаемой хондроцитами без добавления кондиционированной среды от МСК. Результаты проведенного для оценки скорости миграции хондроцитов скрэтч-теста показали, что среда, кондиционированная всеми из изучаемых типов МСК оказывает стимулирующее влияние на динамику этого процесса. Самое быстрое зарастание царапин в монослое хондроцитов наблюдалось при их культивировании в среде, кондиционированной МСК Вартонова студня пуповины Стимулирующее действие секретома МСК жировой ткани на пролиферативную активность хондроцитов было также подтверждено при культивирования клеток в хондрогенной среде на микрочастицах децеллюляризованного хряща в динамических условиях биореактора в течение 21 суток. Сокультивирование с МСК жировой ткани позволило повысить содержание ДНК в КИК с хондроцитами в 1,5 раза в сравнении с монокультурой. Динамические условия позволили дополнительно повысить количество хондроцитов в КИК в 2,2 раза, что может быть обусловлено не только улучшением питания клеток, транспорта к ним газов и выведения продуктов обмена веществ за счет перемешивания культуральной среды, но и запуском физиологических сигналов механотрансдукции. Параллельно были проведены исследования, направленные на определение оптимального состава клеточного носителя - биологического миметика внеклеточного матрикса суставного хряща, являющегося вторым основным компонентом КИК для регенерации поврежденного суставного хряща помимо клеток. Согласно исследованию пролиферативной активности МСК жировой ткани in vitro методом колориметрического анализа митохондриальных дегидрогеназ (PrestoBlueAssay)при культивировании на трех видах носителей, подходящих для инъекционного введения, децеллюляризованном хряще, коллагенсодержащем гидрогеле (АО «БИОМИР сервис», Россия) и комбинации децеллюляризованного хряща с гидрогелем, была продемонстрирована целесообразность включения в КИК тканеспецифического или гидрогелевого матриксов по отдельности. Установлено, что тканеспецифический микродисперсный матрикс из децеллюляризованных микронизированных фрагментов суставного хряща свиньи поддерживает жизнеспособность, адгезию и пролиферацию МСК жировой ткани человека, а также синтез ими ВКМ хрящевой ткани. Отметим, что многие группы ученых не относят потерю гликозаминогликанов (ГАГ) при децеллюляризации к недостаткам технологии, так как считают, что клетки способны быстро наработать ГАГ в ходе жизнедеятельности. Однако полученные в нашем исследовании факты опровергли данную гипотезу и подтвердили критичность сохранения состава внеклеточного матрикса для жизнеспособности и дифференцировки в хондрогенном направлении МСК жировой ткани человека. Доказано положительное влияние уровня ГАГ в децеллюляризованных микронизированных фрагментах суставного хряща на жизнеспособность МСК жировой ткани человека, в том числе, на синтез ГАГ и коллагена II типа в процессе хондрогенной дифференцировки клеток. МСК жировой ткани человека, культивированные на децеллюляризованном хряще, полученном с использованием резких изменений температуры или обработки трипсином, меньше пролиферировали и нарабатывали ГАГ и не синтезировали коллаген II типа. Напротив, способность экспериментального клеточного носителя, полученного с использованием соникации, поддерживать высокий уровень пролиферации и хондрогенную дифференцировку МСК жировой ткани человека, проявляющуюся в наработке внеклеточного матрикса с высоким содержанием ГАГ и коллагеном II типа, указывают на его потенциал для применения в регенеративной медицине. Полученные результаты позволили выбрать состав КИК для исследования терапевтической эффективности in vivo на третьем этапе проекта: МСК жировой ткани человека и тканеспецифический матрикс из микронизированного хряща свиньи, получаемый путем последовательной инкубации образцов в растворах поверхностно-активных веществ с использованием соникации и ДНКазы I типа.

Аннотация результатов, полученных в 2023 году
Целью третьего этапа НИР была оценка эффективности создаваемых клеточно-инженерных конструкций на основе инъекционных форм миметиков внеклеточного матрикса с мезенхимальными стромальными клетками в качестве средства восстановления суставных дефектов на in vivo модели, а именно кроликах с остеоартрозом. На 30 сутки после моделирования остеоартроза кроликам опытных групп в коленный сустав задней правой лапы были введены мезенхимальные стромальные клетки жировой ткани человека; микрогетерогенный коллагенсодержащий гидрогель отдельно или с мезенхимальными стромальными клетками жировой ткани человека; децеллюляризованным хрящом свиньи отдельно или с мезенхимальными стромальными клетками жировой ткани человека. Левый коленный сустав служил положительным контролем (модель остеоартроза). На 60 сутки после внутрисуставного введения животным опытных групп мезенхимальных стромальных клеток жировой ткани человека, децеллюляризованного хряща свиньи или микрогетерогенного коллагенсодержащего гидрогеля наблюдали признаки частичного восстановления хряща. После введения мезенхимальных стромальных клеткок жировой ткани человека вместе с децеллюляризованным хрящом свиньи через 60 суток признаки регенерации хряща отсутствовали. Показано стимулирующее действие внутрисуставного введения клеточно-инженерной конструкции, состоящей из микрогетерогенного коллагенсодержащего гидрогеля и мезенхимальных стромальных клеток жировой ткани человека на внутренний регенеративный потенциал поврежденной хрящевой ткани. После введения клеток на гидрогелевом носителе происходило увеличение количества клеток в поверхностном слое относительно контроля. В среднем слое хондроциты выстраивались в колонки-столбики. В глубоком слое наблюдали появление изогенных групп. Параллельно было проведено сравнение паракринного действия мезенхимальных стромальных клеток из пуповины, жировой ткани и пульпы зуба человека на хондроциты при непрямом сокультивировании. К 14 суткам значительных различий в пролиферации хондроцитов между опытными образцами не выявили, что указывает на одинаковое паракринное действие мезенхимальных стромальных клеток из пуповины, жировой ткани и пульпы зуба человека в условиях проведенного эксперимента. Исследован характер взаимодействия клеточных сфероидов с матриксами-носителями на основе децеллюляризованного суставного хряща и биополимерного микрогетерогенного коллагенсодержащего гидрогеля. Сфероиды на основе мезенхимальных стромальных клеток Вартонова студня пуповины и жировой ткани были нанесены на поверхность матрикса с последующей оценкой адгезии и распластывания. Для визуализации сфероидов использовалась сканирующая электронная микроскопия с прижизненным лантаноидным контрастированием. Полученные данные свидетельствуют об отсутствии цитотоксического эффекта у изучаемых материалов и их пригодности для тканевой инженерии. Кроме того, было продемонстрировано, что применение в качестве индуктора хондрогенной дифференцировки TGF-beta 3 в течение 21 суток обеспечивает более активную пролиферацию клеток и высокое содержание гликозаминогликанов во внеклеточном матриксе, но снижает наработку мезенхимальными стромальными клетками жировой ткани человека коллагена при хондрогенной диференцировке в сравнении с использованием TGF-beta 1. При этом образованный клетками коллаген в образцах, культивированных в присутствии TGF-beta 1 положительно окрашивался на коллаген II типа. Таким образом, оптимальным индуктором при формировании тканевого эквивалента суставного хряща на основе мезенхимальных стромальных клеток жировой ткани и микрочастиц децеллюляризованного хряща на 21 сутки культивирования в хондрогенной среде был выбран TGF-beta 1. В рамках третьего этапа было исследовано местное действие тканеспецифического матрикса на основе децеллюляризованного хряща, технология получения которого была разработана на предыдущих этапах. Отсутствие реакции мышечной ткани при имплантации образцов в течение 6 месяцев подтвердило соответствие тканеспецифического матрикса на основе децеллюляризованного хряща требованиям, предъявляемым к медицинским изделиям по ГОСТ ISO 10993-6-2011 «Исследования местного действия после имплантации». Дополнительно проведена оценка влияния внеклеточного матрикса стромы пуповины на пролиферативную активность хондроцитов. Полученные результаты показали наличие у экстракта матрикса стромы пуповины выраженного стимулирующего эффекта в отношении скорости роста культур хондроцитов при их экспансии в двумерных условиях.