КАРТОЧКА ПРОЕКТА ФУНДАМЕНТАЛЬНЫХ И ПОИСКОВЫХ НАУЧНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ,
ПОДДЕРЖАННОГО РОССИЙСКИМ НАУЧНЫМ ФОНДОМ

Информация подготовлена на основании данных из Информационно-аналитической системы РНФ, содержательная часть представлена в авторской редакции. Все права принадлежат авторам, использование или перепечатка материалов допустима только с предварительного согласия авторов.

 

ОБЩИЕ СВЕДЕНИЯ


Номер 21-15-00188

НазваниеРоль посттрансляционного ацетилирования и деацетилирования сигнальных белков и факторов транскрипции в ишемической пенумбре после фототромботического инсульта

РуководительДемьяненко Светлана Викторовна, Доктор биологических наук

Организация финансирования, регион федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего образования "Южный федеральный университет", Ростовская обл

Период выполнения при поддержке РНФ 2021 г. - 2023 г. 

Конкурс№55 - Конкурс 2021 года «Проведение фундаментальных научных исследований и поисковых научных исследований отдельными научными группами».

Область знания, основной код классификатора 05 - Фундаментальные исследования для медицины, 05-106 - Нейробиология

Ключевые словаишемический инсульт, негистоновые белки, деацетилазы гистонов, ацетилтрансферазы гистонов, селективные ингибиторы деацетилаз гистонов

Код ГРНТИ76.29.51


 

ИНФОРМАЦИЯ ИЗ ЗАЯВКИ


Аннотация
В своем докладе "Предотвращение хронических заболеваний: жизненно важное вложение средств" ВОЗ требует глобальных действий для остановки пандемии инсульта. Более 5 миллионов человек каждый год умирает от инсульта и этот показатель продолжает расти. Успехи в сфере диагностики и профилактики заболевания способствуют снижению количества смертей после инсульта. Однако, следует признать, что фармакологическая терапия инсульта ограничена. Использование тромболитиков в первые часы и нейропротекторов во время восстановительного периода после инсульта малоэффективно и вызывает побочные эффекты. Растущий объем знаний о биохимических процессах, череду которых вызывают ишемические повреждения, указывают на важную роль пострансляционных модификаций факторов транскрипции и сигнальных белков в реакциях клеток мозга на стресс. Ацетилирование/деацетилирование негистоновых белков, которое осуществляют ацетилтрансферазы (HAT) и деацетилазы гистонов (HDAC), при инсульте почти не изучено. Исследования, проведенные коллективом в 2014-2016 годах позволили выделить важнейшие факторы транскрипции и сигнальные белки, которые, как мы предполагаем, могут ацетилироваться/деацетилироваться изоформами HAT/HDAC, что в таком случае выступает дополнительным уровнем регуляции их активности. Основываясь на результатах работы коллектива в 2016-2020 годах удалось выявить возможные изоформы HDAC и HAT, которые могут участвовать в ацетилировании/деацетилировании регуляторных белков в разные периоды после инсульта. По результатам работы в рамках настоящего проекта удастся охарактеризовать ацетилирование/деацетилирование факторов транскрипции c-Myc, E2F1, p53 и киназ Akt и ERK1 в разных типах клеток мозга в острейший и восстановительный периоды после фототромботического инсульта. Результаты, полученные в ходе выполнения проекта, лягут в основу исследования ацетилома клеток мозга после инсульта. Позволят по-новому взглянуть на молекулярные механизмы ингибиторов HDAC. Будут способствовать разработке субстрат, а возможно и тканеспецифичных селективных ингибиторов HDAC с выраженной эффективностью, для лечения инсульта.

Ожидаемые результаты
На первом этапе проекта в 2021-2022 годах будет проведено исследование экспрессии и внутриклеточной локализации факторов транскрипции c-Myc, E2F1, p53 и киназ Akt и ERK1 в нейронах, астроцитах, макрофагах и микроглии пенумбры в острейший и ранний восстановительный периоды после ишемического инсульта. Будут изучены белок-белковые взаимодействия факторов транскрипции c-Myc, E2F1, p53 и киназ Akt и ERK1 с различными изоформами HAT и HDAC, а также HDAC I класса с HDAC II класса. Полученные данные позволят определить какие негистоновые регуляторные белки или же сами HDAC способны ацетилироваться/деацетилироваться в клетках мозга в разные периоды времени после ишемического инсульта. После выявления пар белков «субстрат-фермент» на втором этапе исследования будет определена ацетилазная/деацетилазная активность изоформ HAT и HDAC в отношении конкретного белка и проведен поиск сайтов ацетилирования этого белка. Это позволит при помощи доступных селективных ингибиторов изоформ HDAC на следующем этапе исследования перейти к установлению зависимости между ацетилированием регуляторного белка и его активностью в отношении нижестоящих мишеней, а также апоптозом клеток пенумбры после фототромботического инсульта. С практической точки зрения предполагаемые результаты лягут в основу осмысленного выбора селективных ингибиторов HDAC и разработки новых субстрат и тканеспецифичных ингибиторов HDAC для лечения инсульта, а, возможно, и рака. Сфокусированность проекта на механизма ацетилирования негистоновых белков, которые во многом определяют гомеостаз клеток мозга при ишемии, позволит по-новому взглянуть на функции деацетилаз и ацетилаз гистонов, которые могут быть более обширными, чем регуляция транскрипции. Результаты работы проекта будут оригинальны и научно значимы, поскольку процессы ацетилирования/деацетилирования регуляторных белков находятся в самом начале пути изучения.


 

ОТЧЁТНЫЕ МАТЕРИАЛЫ


Аннотация результатов, полученных в 2021 году
В последние годы инсульт вышел на первое место среди причин смертности в России. Каждый год жертвами инсульта становятся около 500 тысяч российских граждан (28%), опережая инфаркт миокарда (20%) и онкологические заболевания (14%). Более 80% всех инсультов – это ишемические инсульты, вызванные окклюзией мозговых артерий, за считанные минуты приводящей к нарушению кровоснабжения, дефициту кислорода и глюкозы, некрозу и инфаркту нервной ткани. Разработка новых подходов к поиску эффективных нейропротекторов требует более глубокого и всестороннего изучения молекулярных процессов внутриклеточных регуляций, лежащих в основе механизмов нейродегенерации и нейропротекции. Ацетилирование / деацетилирование гистонов и негистоновых белков с участием гистондеацетилаз (HDAC) и гистонацетилтрансфераз (HAT) играет важную роль в регуляции экспрессии генов и внутриклеточной сигнализации. Исследования, направленные на изучение ацетилирования/деацетилирования негистоновых белков в клетках мозга являются крайне перспективными (https://doi.org/10.3390/ijms22157947). Однако, работ, посвященных изучению этих процессов при инсульте – практически нет. Известно, что HDAC и HAT широко представлены в мозге, при этом роль разных изоформ HDAC в выживании и смерти клеток мозга после инсульта неоднозначна (https://dx.doi.org/10.3390%2Fijms22157947). Исследования последних лет показали, что некоторые гистондеацетилазы участвуют в защитных процессах, а другие, наоборот, могут способствовать гибели клеток. Это зависит от типа клеток, их внутриклеточной локализации и характера посттрансляционных модификаций белков. При выполнении нами проекта РНФ (14-15-00068) были выделены факторы транскрипции и сигнальные белки, участвующие в регуляции выживания и смерти клеток пенумбры после фототромботического инсульта (ФТИ), ацетилирование/деацетилирование которых может менять дальнейшую судьбу клеток. Кроме того, нам удалось выявить возможные изоформы HDAC и HAT, которые могут участвовать в ацетилировании/деацетилировании регуляторных белков в разные периоды после инсульта (РНФ 18-15-00110; https://doi.org/10.4103/1673-5374.303024). Основываясь на полученных результатах, мы предполагаем, что одним из главных механизмов такой избирательности HDAC может являться многоуровневый контроль активности факторов транскрипции и сигнальных белков путем их посттрансляционной модификации. В настоящей работе мы исследовали внутриклеточную локализацию и паттерн экспрессии факторов транскрипции с-Myc, Е2F1, p53 и сигнальных белков ERK1/2 и Akt в нейронах, астроцитах, макрофагах и микроглии пенумбры в острейший и ранний восстановительный периоды после ФТИ. Результаты оценки уровня p53, E2F1, c-Myc, Akt и ERK1/2, полученные методом вестерн-блота и иммунофлуоресцентного анализа в целом подтвердили результаты наших протеомных исследований (https://doi.org/10.1007/s12035-016-0191-x). Наибольшие изменения содержания изученных белков происходят через 4 часа после ФТИ и только высокий уровень р53 сохраняется и в ранний восстановительный период после инсульта. Е2F1, p53, ERK1/2 и Akt активно экспрессировались в нейронах. С-Myc удалось обнаружить только в единичных нейронах пенумбры. Уровень Е2F1, ERK1/2 и Akt увеличивался в астроцитах, а факторы транскрипции р53 и Е2F1, могут участвовать в регуляции фенотипа микроглии. Изучение внутриклеточной локализации белков показало, что все они могут находиться как в ядрах, так и в цитоплазме клеток пенумбры и, несомненно, выполняемые ими функции напрямую будут зависеть от их локализации. C помошью иммунофлуоресцентной микроскопии мы оценили взаимодействие p53, E2F1, c-Myc, Akt и ERK1/2 с гистондеацетилазами HDAC1, HDAC2, HDAC3, HDAC4, HDAC5, HDAC6, HDAC8, Sirt1, Sirt2 и гистонацетилтрансферазами HAT1, p300 и PCAF с целью поиска пар белков «субстрат-фермент». Оказалось, что ацетилирование р53 в клетках пенумбры как через 4 часа, так и через 7 суток после ФТИ может осуществлять гистонацетилтрансфераза PCAF. В качестве деацетилаз могут выступать гистондеацетилазы I класса – HDAC1 и HDAC2; II класса – HDAC5 и HDAC6 и III класса – Sirt1. Для подтверждения белок-белковых взаимодействий между р53 HDAC1, HDAC2 и HDAC5 мы использовали технологию Duolink PLA (метод близкого лигирования) с последующим считыванием результатов с помощью флуоресцентной микроскопии. Полученные результаты показали, что р53 непосредственно взаимодействует с HDAC1, HDAC2 и HDAC5. Если участие HDAC1 и HDAC2 в деацетилировании р53 ранее было показано на онкотрансформированных клетках (https://doi.org/10.3390/ijms22157947), то способность HDAC5 взаимодействовать с р53 показана впервые. PCAF также, вероятно, способна ацетилировать фактор транскрипции E2F1 и Akt. При этом деацетилировать E2F1 могут как HDAC1, HDAC2, HDAC8, так и Sirt1. Солокализация ERK1/2 с HDAC5 и HDAC6, а Akt с HDAC5, HDAC6, HDAC8 и Sirt1 указывает на возможное их участие в деацетилировании киназ причем как через 4 часа, так и в период восстановления. Учитывая тот факт, что в настоящее время информация о взаимодействии c-Myc, E2F1, p53, Akt и ERK1/2 с ацетилтрансферазами или деацетилазами гистонов в клетках мозга после ишемии отсутствует, то практически все полученные нами данные являются новыми. Поиск изоформ HAT и HDAC, способных ацетилировать/ деацетилировать сигнальные белки и факторы транскрипции, которые регулируют апоптоз и другие важные функции клеток мозга после инсульта, будет способствовать разработке эффективных нейропротекторов для лечения последствий инсульта в разные периоды заболевания (https://ria.ru/20211124/yufu-1759813362.htm).

 

Публикации

1. Демьяненко С.В. Роль ацетилирования негистоновых белков в регуляции апоптоза клеток мозга при ишемии Рецепторы и внутриклеточная сигнализация : Сборник статей, С. 521-525 (год публикации - 2021)

2. Демьяненко С.В., Дзреян В.А., Шарифулина С.А. Histone Deacetylases and Their Isoform-Specific Inhibitors in Ischemic Stroke Biomedicines, 9(10):1445 (год публикации - 2021) https://doi.org/10.3390/biomedicines9101445

3. Демьяненко С.В., Шарифулина С.А. The Role of Post-Translational Acetylation and Deacetylation of Signaling Proteins and Transcription Factors after Cerebral Ischemia: Facts and Hypotheses. International Journal of Molecular Sciences, 22(15):7947 (год публикации - 2021) https://doi.org/10.3390/ijms22157947

4. Ид М.A., Демьяненко С.В., Калюжная Ю.Н. Histone deacetylation on the first day after a photothrombotic stroke in rats International Journal of Stroke, 16(2S):59-59 (год публикации - 2021)

5. Ид М.А., Демьяненко С.В., Узденский А.Б. Role of sirtuins 1, 2 and 6 in damage and recovery of peri-infarction zone cells after photothrombotic stroke International Journal of Stroke, 16 (2S): 90-90 (год публикации - 2021)

6. - Российские ученые изобрели "коктейль" для восстановления после инсульта РИА Новости, - (год публикации - )

7. - В ЮФУ работают над созданием лекарств для терапии инсульта 1rnd.ru - Сайт города Ростова-на-Дону, - (год публикации - )

8. - Учёные из ЮФУ создали "коктейль" для восстановления после инсульта LIFE, - (год публикации - )

9. - Как восстановиться после инсульта: ученые изобрели «коктейль» Новости Mail.ru, - (год публикации - )

10. - Учёные из ЮФУ создали “коктейль” для восстановления после инсульта Новости РОССИЯ – HAYKNEWS, - (год публикации - )

11. - Учёные из ЮФУ создали «коктейль» для восстановления после инсульта Новости Екатеринбурга, - (год публикации - )

12. - В ЮФУ работают над созданием лекарств для терапии инсульта Белокалитвинский информационный портал "Перекресток", - (год публикации - )

13. - Как восстановиться после инсульта: ученые изобрели "коктейль" Новостное агентство Sputnik, - (год публикации - )

14. - Учёные из ЮФУ создали "коктейль" для восстановления после инсульта Seldon.News (СЕЛДОН НОВОСТИ), - (год публикации - )

15. - Российские ученые изобрели "коктейль" для восстановления после инсульта МИА «Россия сегодня», - (год публикации - )

16. - Учёные из ЮФУ создали «коктейль» для восстановления после инсульта Новости науки и медицины, - (год публикации - )

17. - Российские ученые изобрели “коктейль” для восстановления после инсульта RegionDV.com - Новости в стране и мире, - (год публикации - )

18. - Российские ученые изобрели "коктейль" для восстановления после инсульта РНФ Российский научный фонд, - (год публикации - )


Аннотация результатов, полученных в 2022 году
Ацетилирование остатков лизина гистоновых и негистоновых белков регулирует важнейшие функции клеток. Ацетилтрансферазы гистонов (НАТ) переносят ацетильные группы от ацетил-коэнзима А на ε-аминогруппу остатков лизина, а гистондеацетилазы (HDAC) катализируют удаление ацетильных групп. На клеточных и животных моделях ишемии было показано, что ингибиторы HDAC защищают нервные клетки и способствуют их восстановлению после инсульта, увеличивая транскрипцию и синтез белков. Однако неселективные ингибиторы HDAC не пригодны для длительного использования ввиду высокой цитотоксичности. На модели фототромботического инсульта (ФТИ) у грызунов было показано, что гистондеацетилазы HDAC1, HDAC2, HDAC6, HDAC8, но не HDAC3, HDAC4, HDAC5 или немитохондриальные сиртуины (SIRT1, 2 и 6) участвуют в нейродегенеративных процессах в ишемической пенумбре (РНФ №18-15-00110). HDAC1, HDAC2 и HDAC6 представляют собой молекулярные мишени для нейропротекторной терапии инсульта. Как показали исследования, большинство HDAC и HAT способны перемещаться между ядром и цитоплазмой клеток мозга, участвуя в регуляции активности не только гистонов, но и сигнальных белков. Протеомный анализ изменения уровня более 700 белков в ткани периинфарктной области ФТИ позволил выделить основные сигнальные белки и факторы транскрипции, участвующие в выживании и апоптозе нервных клеток (РНФ №14-15-00068). Глобальными регуляторами апопоза клеток ишемической пенумбры являются связанные между собой факторы транскрипции р53, с-Myc и E2F1. В свою очередь активация протеинкиназ ERK 1, 2 и 5 или Akt способствует выживанию клеток мозга после ишемии. Активность, клеточное распределение, связывание с ДНК и межбелковые взаимодействия факторов транскрипции и сигнальных белков зависит от паттернов их ацетилирования. Однако изучение посттрансляционного ацетилирования/деацетилирования негистоновых белков находится в самом начале. Наши исследования показали, что изменения уровня р53, E2F1, ERK1/2 и Akt наблюдаются уже через 4 часа после ФТИ, а в нейронах уровень р53 и Akt остается высоким и в период восстановления. С помощью базы данных UniProt (http://www.uniprot.org/) и программы GPS-PAIL 2.0 (http://pail.biocuckoo.org/online.php) удалось идентифицировать возможные сайты ацетилирования и ацетилтрансферазы белков р53, c-Myc и E2F1. In vivo было показано, что ФТИ вызывает рост ацетилирования р53 по лизину 373 в ядрах нейронов и по лизину 320 (318) в цитоплазме нейронов перифокальной области ФТИ. При этом уровень ацетилирования р53 по лизинам 120 или 382 не изменяется. Наиболее выраженные изменения ацетилирования р53 по лизинам 320 и 373 наблюдаются через 24 часа после ишемии, а высокий уровень ацетилирование р53 по лизину 320 сохраняется и в период репарации. Молекулярно-динамическая симуляция показала, что ацетилирование р53 по лизину 320 приводит к более компактной конформации р53, что может способствовать его транслокации из ядра в цитоплазму. Методами Duolink PLA (метод близкого лигирования) и ко-иммунопреципитации было установлено, что р53 непосредственно взаимодействует с ацетилтрансферазами PCAF и в меньшей степени с р300. Ацетилтрансфераза HAT1, скорее всего, не участвует в ацетилировании р53 по лизинам 320 и 373. Деацетилируют р53 по лизину 320 HDAC1 и HDAC6, но не HDAC2. Ингибиторно-активаторный анализ показал, что ацетилирование р53 по лизину 320 не только способствует транслокации белка в цитоплазму нейронов и обратно после инсульта, но и отвечает за нейропротекцию, опосредованную ингибиторами HDAC I класса и HDAC6, которая была показана нами ранее на модели ФТИ (РНФ №18-15-00110). Напротив, деацетилирует р53 по лизину 373 в основном HDAC2 и в меньшей степени SIRT1. Эксперименты с ингибиторами р53 (пифитрин α и μ), активатором р53 WR1065 и ингибитором HDAC2/3 MI192 показали, что ацетилирование р53 по К373 повышает стабильность белка, способствует транслокации р53 в ядра нейронов и росту апоптоза нейронов после ФТИ. Таким образом, ацетилирование р53 по лизину 320 более предпочтительно для нервных клеток, поскольку связано с выживанием и восстановлением функций нейронов, а разработка селективных ингибиторов HDAC1, которые отсутствуют в настоящее время, перспективно для нейропротекторной терапии. В дальнейшем необходимо установить, какая изоформа HAT ацетилирует р53 по лизину 320, а какая по лизину 373. Это позволит направленно стимулировать ацетилирование р53 по лизину 320. Фактор транскрипции c-Myc стимулирует экспрессию p53 и E2F1. Было изучено изменение уровня ацетилирования с-Myc по лизинам в положении 148 (N-концевой домен трансактивации) и 323 (последовательность ядерной локализации). Наиболее значительные изменения ацетилирования с-Myc по К148 (149), но не по лизину 323 наблюдались в цитоплазме нейронов перифокальной области в первые сутки после ФТИ. Однако пока неясно, как ацетилирование с-Myc по лизину 148 влияет на выживаемость и апоптоз клеток ишемической пенумбры.

 

Публикации

1. Дзреян В.А., Ид М.И., Родькин С.В., Питинова М.А., Демьяненко С.В. E2F1 Expression and Apoptosis Initiation in Crayfish and Rat Peripheral Neurons and Glial Cells after Axonal Injury International journal of molecular sciences, том 23(8), 4451 (год публикации - 2022) https://doi.org/10.3390/ijms23084451

2. Ид М.А., Дзреян В.А., Демьяненко С.В. Sirtuins 1 and 2 in the Acute Period After Photothrombotic Stroke: Expression, Localization and Involvement in Apoptosis Frontiers in physiology, том 13:782684 (год публикации - 2022) https://doi.org/10.3389/fphys.2022.782684

3. Ли Я., Гу Ч., Лин Ш., Чен Л., Дзреян В.А., Ид М.А., Демьяненко С.В., Хе Б. Histone Deacetylases as Epigenetic Targets for Treating Parkinson's Disease Brain sciences, том 12(5):672 (год публикации - 2022) https://doi.org/10.3390/brainsci12050672

4. Гузенко В.В., Калюжная И.Н., Демьяненко С.В. E2F1 acetylation regulates apoptosis of perifocal region cells after photothrombotic stroke Saratov Fall Meeting2022/Symposium Optics and Biophotonics, Saratov Fall Meeting2022/Symposium Optics and Biophotonics, Sep 26 – Sep 30. 2022 (год публикации - 2022)

5. Демьяненко С.В., Гузенко В.В., Батальщикова С.А. Участие деацетилаз гистонов в регуляции активности белка р53 в острый и ранний восстановительный периоды после инсульта Гены & Клетки. Материалы V национального конгресса по регенеративной медицине, Vol. XVII, №3, 2022, с. 68. (год публикации - 2022)

6. Демьяненко С.В., Узденский А.Б. Процессы ацетилирования и деацетилирования в нейронах и астроцитах пенумбры после ишемического инсульта Acta Naturae, Том 2. – М.: Издательство «Перо», с.246 (год публикации - 2021)

7. Ид М., Батальщикова С., Гузенко В., Демьяненко С. Evaluation of p53 expression and interaction with HDAC2 in the acute period after photothrombotic stroke in rats E-Book of Abstracts of the FENS Forum 2022, France, Paris. - 2022. p.3387 (год публикации - 2022)

8. Ид М., Дзреян В., Гузенко В., Батальщикова С., Демьяненко С Intracellular localization and expression of c-myc, E2F1, and p53 in the perifocal region after ischemic stroke in rats International Journal of Stroke, том 17(3S): 203 (год публикации - 2022) https://doi.org/10.1177/17474930221125973

9. Ид М., Хайтин А., Питинова М., Калюжная Ю., Демьяненко С. Colocalization of p53 with histone deacetylases in the perifocal region 24 hours after photothrombotic stroke in rats International Journal of Stroke, том 17(3S): 202 (год публикации - 2022) https://doi.org/10.1177/17474930221125973

10. - Мозг, инсульт, нервные клетки и речной рак: что изучают нейробиологи ЮФУ Пресс-центр ЮФУ, - (год публикации - )

11. - Научные сотрудники лаборатории «Молекулярная нейробиология» Академии биологии и биотехнологии ЮФУ приняли участие в юбилейном V Национальном конгрессе по регенеративной медицине Сайт Академии биологии и биотехнологии ЮФУ, - (год публикации - )

12. - Открытая лекция ведущего научного сотрудника лаборатории молекулярной нейробиологии ЮФУ Демьяненко Светланы Викторовны Сайт Научно-технологического центра биомедицинской фотоники, - (год публикации - )

13. - Открытая лекция ведущего научного сотрудника лаборатории молекулярной нейробиологии ЮФУ Светланы Демьяненко Seldon.News, - (год публикации - )

14. - Открытая лекция ведущего научного сотрудника лаборатории молекулярной нейробиологии ЮФУ Светланы Демьяненко Сайт Орловского государственного университета имени И.С. Тургенева, - (год публикации - )


Аннотация результатов, полученных в 2023 году
Факторы транскрипции p53, c-Myc и E2F, а также киназы Akt1 и ERK1/2 представляют собой важные узлы интеграции нескольких внутриклеточных сигнальных каскадов и являются глобальными регуляторами апоптоза (см. источник: https://www.mdpi.com/1422-0067/22/15/7947). Эти белки принадлежат к группе многофункциональных белков с внутренне неупорядоченной структурой, активность, внутриклеточная локализация, взаимодействия с белками-партнерами которых существенно зависит от посттрансляционных модификаций (см. источник: https://elibrary.ru/item.asp?id=42791400). Настоящее исследование посвящено разбору механизмов регуляции активности этих белков путем посттрансляционного ацетилирования. Ишемия, индуцированная фототромбозом сосудов коры мозга у крыс, увеличивала уровень ацетилирования фактора транскрипции p53 по лизинам 320 и 373 в нейронах перифокальной области фототромботического инфаркта (ФТИ). Ацетилирование лизина 320 фактора транскрипции p53, осуществляемое ацетилтрансферазой PCAF (KAT2B), способствует перемещению p53 между ядром и цитоплазмой в нейронах пенумбры ФТИ, накапливаясь преимущественно в цитоплазме [см. источник: https://link.springer.com/article/10.1007/s12975-023-01183-z]. Согласно данным ингибиторного анализа, ацетилирование лизина 320 представляет собой предпочтительный процесс по сравнению с ацетилированием лизина 373, поскольку оно способствует выживанию и восстановлению функций нейронов пенумбры после инсульта. В цитоплазме нейронов перифокальной области ФТИ наблюдается увеличение уровня ацетилирования фактора транскрипции c-Myc по лизину 148, но не по лизину 323. Результаты молекулярно-динамического моделирования выявили ключевую роль лизина 148 c-Myc в стабилизации пространственной структуры данного белка. Ацетилирование лизина 148 c-Myc способствует перестройке альфа-спиралей белка относительно друг друга, формируя новый паттерн для его связывания с регуляторными или функциональными белков-партнерами. Данная гипотеза была подтверждена нами с использованием моделей докинга. Исследования in silico демонстрируют, что ацетилирование лизина 148 в c-Myc приводит к дестабилизации молекулы белка и может предотвращать образование комплекса с МAX, в то время как это не влияет на его способность взаимодействия с α-тубулином. Эти предположения были подтверждены результатами Duolink PLA , где количество взаимодействий между c-Myc и MAX оказалось значительно выше, чем между ацетилированным c-Myc по лизину 148 и MAX. Методами Duolink PLA и иммунопреципитации было показано, что после ФТИ фактор транскрипции c-Myc подвергается ацетилированию ацетилтрансферазами p300 (KAT3B) и, в меньшей степени, PCAF, как в ядрах, так и в цитоплазме нейронов. Сиртуин 2 (SIRT2) деацетилирует в основном c-Myc, ацетилированный по лизину 148 в цитоплазме, в то время как HDAC2 деацетилирует c-Myc, ацетилированный по лизину 323 в ядрах нервных клеток. Результаты ингибиторного анализа указывают на то, что ацетилирование c-Myc по лизину 148 и его цитоплазматическая локализация более предпочтительны, поскольку они содействуют выживанию нейронов в перифокальной области ФТИ, в отличие от ацетилирования ядерного c-Myc по лизину 323. В клетках перифокальной области ФТИ уровень ацетилирования фактора транскрипции E2F1 по лизинам 117 и 125 значительно не менялся ни в первые сутки после повреждения, ни в период восстановления. Ацетилирование E2F1 ацетилтрансферазой PCAF по лизину 125, но не по лизину 117, приводит к структурным изменениям в белке, закрывая его трансактивационный домен и мешая связыванию с регуляторными белками. На клеточной модели окислительного стресса, вызванного фотодинамическим воздействием, добавление ингибитора PCAF эмбелина c ингибитором E2F1 HLM006474 в среду инкубации приводит к значительному снижению апоптоза и процента некротических клеток SH-SY5Y, подавляя связывание E2F1 с ДНК и сдерживая его экспрессию. Динамика ацетилирования протеинкиназы В (Akt1) и регулируемых внеклеточными сигналами киназ ERK1/2 после ишемии различна. Уровень ацетилирования Akt1 в первые сутки после ФТИ снижается, способствуя увеличению активности фермента. В отличие от этого, ацетилирование ERK1/2 увеличивается в первые сутки после ФТИ и остается высоким в ранний восстановительный период. Ацетилирует Akt1 ацетилтрансфераза PCAF, тогда как ERK1/2 ацетилируется p300, что снижает активность обеих киназ. Деацетилирование киназ осуществляется HDAC6.

 

Публикации

1. Гузенко В.В., Бачурин С.С., Хайтин А.М., Дзреян В.А., Калюжная Ю.Н., Хэ Б., Демьяненко С.В. Acetylation of p53 in the Cerebral Cortex after Photothrombotic Stroke Translational Stroke Research, online (год публикации - 2023) https://doi.org/10.1007/s12975-023-01183-z

2. Дзреян В.А., Гузенко В.В., Батальщикова С.А. АЦЕТИЛИРОВАНИЕ И ДЕАЦЕТИЛИРОВАНИЕ ФАКТОРОВ ТРАНСКРИПЦИИ P53 И E2F1 В КЛЕТКАХ ПЕРИФЕРИЧЕСКОЙ НЕРВНОЙ СИСТЕМЫ ПОСЛЕ ПЕРЕРЕЗКИ СЕДАЛИЩНОГО НЕРВА Рецепторы и внутриклеточная сигнализация : сборник статей, Пущино, 22–26 мая 2023 года, Рецепторы и внутриклеточная сигнализация : сборник статей, Пущино, 22–26 мая 2023 года. – С. 43-49. (год публикации - 2023)

3. Хайтин А.М., Бачурин С.С., Демьяненко С.В. Ацетилирование фактора транскрипции c-Myc при ишемическом инсульте Рецепторы и внутриклеточная сигнализация : Сборник статей Международной конференции, Пущино, 22–26 мая 2023 года / Под редакцией А.В. Бережнова, В.П. Зинченко. Том 2. – Серпухов: Типография Пятый Формат, 2023. – С. 502-505., Рецепторы и внутриклеточная сигнализация : Сборник статей Международной конференции, Пущино, 22–26 мая 2023 года / Под редакцией А.В. Бережнова, В.П. Зинченко. Том 2. – Серпухов: Типография Пятый Формат, 2023. – С. 502-505. (год публикации - 2023)

4. Бабенко В.А., Федулова К.С., Силачев Д.Н., Рахими-Могаддам П., Калюжная Ю.Н., Демьяненко С.В., Плотников Е.Ю. The Role of Matrix Metalloproteinases in Hemorrhagic Transformation in the Treatment of Stroke with Tissue Plasminogen Activator Journal of Personalized Medicine, 13(7), 1175 (год публикации - 2023) https://doi.org/10.3390/jpm13071175

5. Дзреян В.А., Демьяненко С.В. Роль посттрансляционного ацетилирования и деацетилирования белков в апоптозе нейронов периферической нервной системы Биологические мембраны: Журнал мембранной и клеточной биологии, T. 40, № 6, стр. 415-431 (год публикации - 2023) https://doi.org/10.31857/S0233475523060038

6. Калюжная Ю.Н., Хайтин А.М., Демьяненко С.В. Modeling transient ischemic attack via photothrombosis Biophysical Reviews, 15, 1279–1286 (год публикации - 2023) https://doi.org/10.1007/s12551-023-01121-1

7. Батальщикова С.А., Куницына А.Е., Демьяненко С.В., Зубцов В.С. Effect of p53 Acetylation at Lysines 320 and 373 on Apoptosis in Cells of Peri-infarct Area after Photothrombosis International Journal of Stroke, International Journal of StrokeVolume 18, Issue 3_suppl, October 2023, Page 353 © 2023 World Stroke Organization, Article Reuse Guidelines https://doi.org/10.1177/17474930231192010 (год публикации - 2023) https://doi.org/10.1177/17474930231192010

8. Гузенко В.В., Батальщикова С.А., Демьяненко С.В., Зубцов В.С. Acetylation of p53 in the First Day and Early Recovery Period after Photothrombotic Stroke in Rats International Journal of Stroke, International Journal of StrokeVolume 18, Issue 3_suppl, October 2023, Pages 352-353 © 2023 World Stroke Organization, Article Reuse Guidelines https://doi.org/10.1177/17474930231192010 (год публикации - 2023) https://doi.org/10.1177/17474930231192010

9. Демьяненко С.В., Бачурин С.С., Гузенко В.В. Изменение конформации белка р53, ацетилированного по лизину 320, но не по лизину 373, способствует его переходу в цитоплазму и защищает нейроны перифокальной области фототромботического инсульта VII Съезд биофизиков России : Сборник научных трудов. В 2-х томах, Краснодар, 17–23 апреля 2023 года. Том 2. – Краснодар: Кубанский государственный технологический университет, 2023. – 382 с., VII Съезд биофизиков России : Сборник научных трудов. В 2-х томах, Краснодар, 17–23 апреля 2023 года. Том 2. – Краснодар: Кубанский государственный технологический университет, 2023. – С. 174-175. (год публикации - 2023) https://doi.org/10.26297/SbR6.2023.001

10. Дзреян В.А., Гузенко В.В., Калюжная Ю.Н., Романченко Е.Д. Деацетилирование фактора транскрипции E2F1 с участием гистондеацетилазы 1 при аксотомии периферических нервов VII Съезд биофизиков России : Сборник научных трудов. В 2-х томах, Краснодар, 17–23 апреля 2023 года. Том 2. – Краснодар: Кубанский государственный технологический университет, 2023. – 382 с., VII Съезд биофизиков России : Сборник научных трудов. В 2-х томах, Краснодар, 17–23 апреля 2023 года. Том 2. – Краснодар: Кубанский государственный технологический университет, 2023. – С. 168-169 (год публикации - 2023) https://doi.org/10.26297/SbR6.2023.001

11. Дзреян В.А., Калюжная Ю.Н., Батальщикова С.А. Изменения экспрессии белка предшественника бета-амилоида, ADAM10, BACE1 и компонентов γ-секретазного комплекса пресенилина 1 и никастрина в спинномозговых ганглиях крыс после перерезки седалищного нерва VII Съезд биофизиков России : Сборник научных трудов. В 2-х томах, Краснодар, 17–23 апреля 2023 года. Том 2. – Краснодар: Кубанский государственный технологический университет, 2023. – 382 с., VII Съезд биофизиков России : Сборник научных трудов. В 2-х томах, Краснодар, 17–23 апреля 2023 года. Том 2. – Краснодар: Кубанский государственный технологический университет, 2023. – С. 179-180 (год публикации - 2023) https://doi.org/10.26297/SbR6.2023.001

12. Куницына А.Е., Романченко Е.Д. Нейропротекторное действие экзогенного Hsp70 после повреждения седалищного нерва Фундаментальная наука и клиническая медицина - человек и его здоровье : Материалы XXVI Международной медико-биологической конференции молодых исследователей, Санкт-Петербург, 22 апреля 2023 года – 852 с., Том XXVI. – Санкт-Петербург: Общество с ограниченной ответственностью Издательский дом «Сциентиа», 2023. – С. 542-543. (год публикации - 2023) https://doi.org/10.32415/scientia_978-5-6049390-4-8

13. Хайтин А.М., Зубцов В.С., Батальщикова С.А., Демьяненко С.В. Acetylation of c-Myc Transcription Factor in Cells of Peri-infarct Area after Photothrombotic Stroke in Rats International Journal of Stroke, International Journal of StrokeVolume 18, Issue 3_suppl, October 2023, Page 353 © 2023 World Stroke Organization, Article Reuse Guidelines https://doi.org/10.1177/17474930231192010 (год публикации - 2023) https://doi.org/10.1177/17474930231192010


Возможность практического использования результатов
Проведенные в ходе проекта исследования могут использоваться в медицинских технологиях повышения выживаемости нейронов пенумбры и снижение функционального дефицита после ишемического инсульта. Среди результатов, полученных в ходе реализации проекта, для разработки медицинских технологий могут быть использованы следующие наработки: 1) Выявленные молекулярные мишени, такие как ацетилтрансферазы р300, PCAF и деацетилазы гистонов HDAC1, HDAC2 и HDAC6, для которых показана значительная роль в регуляции гибели и выживания нейронов на моделях ишемии in vitro и in vivo. 2) Модели in silico, клеточные и животные модели, разработанные в ходе проекта для проведения поисковых исследований и установления вклада мультифункциональных белков с неупорядоченной структурой в регуляцию не только процессов острого повреждения клеток, но и при других системных заболеваниях. 3) Оценка возможности использования существующих и использующихся в настоящее время для лечения рака селективных ингибиторов деацетилаз гистонов HDAC6 для терапии инсульта, а также обоснование необходимости разработки селективных ингибиторов HDAC1 и HDAC2, которых в настоящее время нет. На основании результатов проекта создан научный и технологический задел для разработки новых терапевтических подходов, на основе посттранскрипционной регуляции функций ключевых белков с неупорядоченной структурой, что необходимо для успешного лечения системных заболеваний, таких как инсульт, не связанных с изменением генома.