Аннотация результатов, полученных в 2021 году
В последние годы инсульт вышел на первое место среди причин смертности в России. Каждый год жертвами инсульта становятся около 500 тысяч российских граждан (28%), опережая инфаркт миокарда (20%) и онкологические заболевания (14%). Более 80% всех инсультов – это ишемические инсульты, вызванные окклюзией мозговых артерий, за считанные минуты приводящей к нарушению кровоснабжения, дефициту кислорода и глюкозы, некрозу и инфаркту нервной ткани. Разработка новых подходов к поиску эффективных нейропротекторов требует более глубокого и всестороннего изучения молекулярных процессов внутриклеточных регуляций, лежащих в основе механизмов нейродегенерации и нейропротекции. Ацетилирование / деацетилирование гистонов и негистоновых белков с участием гистондеацетилаз (HDAC) и гистонацетилтрансфераз (HAT) играет важную роль в регуляции экспрессии генов и внутриклеточной сигнализации. Исследования, направленные на изучение ацетилирования/деацетилирования негистоновых белков в клетках мозга являются крайне перспективными (https://doi.org/10.3390/ijms22157947). Однако, работ, посвященных изучению этих процессов при инсульте – практически нет. Известно, что HDAC и HAT широко представлены в мозге, при этом роль разных изоформ HDAC в выживании и смерти клеток мозга после инсульта неоднозначна (https://dx.doi.org/10.3390%2Fijms22157947). Исследования последних лет показали, что некоторые гистондеацетилазы участвуют в защитных процессах, а другие, наоборот, могут способствовать гибели клеток. Это зависит от типа клеток, их внутриклеточной локализации и характера посттрансляционных модификаций белков. При выполнении нами проекта РНФ (14-15-00068) были выделены факторы транскрипции и сигнальные белки, участвующие в регуляции выживания и смерти клеток пенумбры после фототромботического инсульта (ФТИ), ацетилирование/деацетилирование которых может менять дальнейшую судьбу клеток. Кроме того, нам удалось выявить возможные изоформы HDAC и HAT, которые могут участвовать в ацетилировании/деацетилировании регуляторных белков в разные периоды после инсульта (РНФ 18-15-00110; https://doi.org/10.4103/1673-5374.303024). Основываясь на полученных результатах, мы предполагаем, что одним из главных механизмов такой избирательности HDAC может являться многоуровневый контроль активности факторов транскрипции и сигнальных белков путем их посттрансляционной модификации. В настоящей работе мы исследовали внутриклеточную локализацию и паттерн экспрессии факторов транскрипции с-Myc, Е2F1, p53 и сигнальных белков ERK1/2 и Akt в нейронах, астроцитах, макрофагах и микроглии пенумбры в острейший и ранний восстановительный периоды после ФТИ. Результаты оценки уровня p53, E2F1, c-Myc, Akt и ERK1/2, полученные методом вестерн-блота и иммунофлуоресцентного анализа в целом подтвердили результаты наших протеомных исследований (https://doi.org/10.1007/s12035-016-0191-x). Наибольшие изменения содержания изученных белков происходят через 4 часа после ФТИ и только высокий уровень р53 сохраняется и в ранний восстановительный период после инсульта. Е2F1, p53, ERK1/2 и Akt активно экспрессировались в нейронах. С-Myc удалось обнаружить только в единичных нейронах пенумбры. Уровень Е2F1, ERK1/2 и Akt увеличивался в астроцитах, а факторы транскрипции р53 и Е2F1, могут участвовать в регуляции фенотипа микроглии. Изучение внутриклеточной локализации белков показало, что все они могут находиться как в ядрах, так и в цитоплазме клеток пенумбры и, несомненно, выполняемые ими функции напрямую будут зависеть от их локализации. C помошью иммунофлуоресцентной микроскопии мы оценили взаимодействие p53, E2F1, c-Myc, Akt и ERK1/2 с гистондеацетилазами HDAC1, HDAC2, HDAC3, HDAC4, HDAC5, HDAC6, HDAC8, Sirt1, Sirt2 и гистонацетилтрансферазами HAT1, p300 и PCAF с целью поиска пар белков «субстрат-фермент». Оказалось, что ацетилирование р53 в клетках пенумбры как через 4 часа, так и через 7 суток после ФТИ может осуществлять гистонацетилтрансфераза PCAF. В качестве деацетилаз могут выступать гистондеацетилазы I класса – HDAC1 и HDAC2; II класса – HDAC5 и HDAC6 и III класса – Sirt1. Для подтверждения белок-белковых взаимодействий между р53 HDAC1, HDAC2 и HDAC5 мы использовали технологию Duolink PLA (метод близкого лигирования) с последующим считыванием результатов с помощью флуоресцентной микроскопии. Полученные результаты показали, что р53 непосредственно взаимодействует с HDAC1, HDAC2 и HDAC5. Если участие HDAC1 и HDAC2 в деацетилировании р53 ранее было показано на онкотрансформированных клетках (https://doi.org/10.3390/ijms22157947), то способность HDAC5 взаимодействовать с р53 показана впервые. PCAF также, вероятно, способна ацетилировать фактор транскрипции E2F1 и Akt. При этом деацетилировать E2F1 могут как HDAC1, HDAC2, HDAC8, так и Sirt1. Солокализация ERK1/2 с HDAC5 и HDAC6, а Akt с HDAC5, HDAC6, HDAC8 и Sirt1 указывает на возможное их участие в деацетилировании киназ причем как через 4 часа, так и в период восстановления. Учитывая тот факт, что в настоящее время информация о взаимодействии c-Myc, E2F1, p53, Akt и ERK1/2 с ацетилтрансферазами или деацетилазами гистонов в клетках мозга после ишемии отсутствует, то практически все полученные нами данные являются новыми. Поиск изоформ HAT и HDAC, способных ацетилировать/ деацетилировать сигнальные белки и факторы транскрипции, которые регулируют апоптоз и другие важные функции клеток мозга после инсульта, будет способствовать разработке эффективных нейропротекторов для лечения последствий инсульта в разные периоды заболевания (https://ria.ru/20211124/yufu-1759813362.htm).

Аннотация результатов, полученных в 2022 году
Ацетилирование остатков лизина гистоновых и негистоновых белков регулирует важнейшие функции клеток. Ацетилтрансферазы гистонов (НАТ) переносят ацетильные группы от ацетил-коэнзима А на ε-аминогруппу остатков лизина, а гистондеацетилазы (HDAC) катализируют удаление ацетильных групп. На клеточных и животных моделях ишемии было показано, что ингибиторы HDAC защищают нервные клетки и способствуют их восстановлению после инсульта, увеличивая транскрипцию и синтез белков. Однако неселективные ингибиторы HDAC не пригодны для длительного использования ввиду высокой цитотоксичности. На модели фототромботического инсульта (ФТИ) у грызунов было показано, что гистондеацетилазы HDAC1, HDAC2, HDAC6, HDAC8, но не HDAC3, HDAC4, HDAC5 или немитохондриальные сиртуины (SIRT1, 2 и 6) участвуют в нейродегенеративных процессах в ишемической пенумбре (РНФ №18-15-00110). HDAC1, HDAC2 и HDAC6 представляют собой молекулярные мишени для нейропротекторной терапии инсульта. Как показали исследования, большинство HDAC и HAT способны перемещаться между ядром и цитоплазмой клеток мозга, участвуя в регуляции активности не только гистонов, но и сигнальных белков. Протеомный анализ изменения уровня более 700 белков в ткани периинфарктной области ФТИ позволил выделить основные сигнальные белки и факторы транскрипции, участвующие в выживании и апоптозе нервных клеток (РНФ №14-15-00068). Глобальными регуляторами апопоза клеток ишемической пенумбры являются связанные между собой факторы транскрипции р53, с-Myc и E2F1. В свою очередь активация протеинкиназ ERK 1, 2 и 5 или Akt способствует выживанию клеток мозга после ишемии. Активность, клеточное распределение, связывание с ДНК и межбелковые взаимодействия факторов транскрипции и сигнальных белков зависит от паттернов их ацетилирования. Однако изучение посттрансляционного ацетилирования/деацетилирования негистоновых белков находится в самом начале. Наши исследования показали, что изменения уровня р53, E2F1, ERK1/2 и Akt наблюдаются уже через 4 часа после ФТИ, а в нейронах уровень р53 и Akt остается высоким и в период восстановления. С помощью базы данных UniProt (http://www.uniprot.org/) и программы GPS-PAIL 2.0 (http://pail.biocuckoo.org/online.php) удалось идентифицировать возможные сайты ацетилирования и ацетилтрансферазы белков р53, c-Myc и E2F1. In vivo было показано, что ФТИ вызывает рост ацетилирования р53 по лизину 373 в ядрах нейронов и по лизину 320 (318) в цитоплазме нейронов перифокальной области ФТИ. При этом уровень ацетилирования р53 по лизинам 120 или 382 не изменяется. Наиболее выраженные изменения ацетилирования р53 по лизинам 320 и 373 наблюдаются через 24 часа после ишемии, а высокий уровень ацетилирование р53 по лизину 320 сохраняется и в период репарации. Молекулярно-динамическая симуляция показала, что ацетилирование р53 по лизину 320 приводит к более компактной конформации р53, что может способствовать его транслокации из ядра в цитоплазму. Методами Duolink PLA (метод близкого лигирования) и ко-иммунопреципитации было установлено, что р53 непосредственно взаимодействует с ацетилтрансферазами PCAF и в меньшей степени с р300. Ацетилтрансфераза HAT1, скорее всего, не участвует в ацетилировании р53 по лизинам 320 и 373. Деацетилируют р53 по лизину 320 HDAC1 и HDAC6, но не HDAC2. Ингибиторно-активаторный анализ показал, что ацетилирование р53 по лизину 320 не только способствует транслокации белка в цитоплазму нейронов и обратно после инсульта, но и отвечает за нейропротекцию, опосредованную ингибиторами HDAC I класса и HDAC6, которая была показана нами ранее на модели ФТИ (РНФ №18-15-00110). Напротив, деацетилирует р53 по лизину 373 в основном HDAC2 и в меньшей степени SIRT1. Эксперименты с ингибиторами р53 (пифитрин α и μ), активатором р53 WR1065 и ингибитором HDAC2/3 MI192 показали, что ацетилирование р53 по К373 повышает стабильность белка, способствует транслокации р53 в ядра нейронов и росту апоптоза нейронов после ФТИ. Таким образом, ацетилирование р53 по лизину 320 более предпочтительно для нервных клеток, поскольку связано с выживанием и восстановлением функций нейронов, а разработка селективных ингибиторов HDAC1, которые отсутствуют в настоящее время, перспективно для нейропротекторной терапии. В дальнейшем необходимо установить, какая изоформа HAT ацетилирует р53 по лизину 320, а какая по лизину 373. Это позволит направленно стимулировать ацетилирование р53 по лизину 320. Фактор транскрипции c-Myc стимулирует экспрессию p53 и E2F1. Было изучено изменение уровня ацетилирования с-Myc по лизинам в положении 148 (N-концевой домен трансактивации) и 323 (последовательность ядерной локализации). Наиболее значительные изменения ацетилирования с-Myc по К148 (149), но не по лизину 323 наблюдались в цитоплазме нейронов перифокальной области в первые сутки после ФТИ. Однако пока неясно, как ацетилирование с-Myc по лизину 148 влияет на выживаемость и апоптоз клеток ишемической пенумбры.

Аннотация результатов, полученных в 2023 году
Факторы транскрипции p53, c-Myc и E2F, а также киназы Akt1 и ERK1/2 представляют собой важные узлы интеграции нескольких внутриклеточных сигнальных каскадов и являются глобальными регуляторами апоптоза (см. источник: https://www.mdpi.com/1422-0067/22/15/7947). Эти белки принадлежат к группе многофункциональных белков с внутренне неупорядоченной структурой, активность, внутриклеточная локализация, взаимодействия с белками-партнерами которых существенно зависит от посттрансляционных модификаций (см. источник: https://elibrary.ru/item.asp?id=42791400). Настоящее исследование посвящено разбору механизмов регуляции активности этих белков путем посттрансляционного ацетилирования. Ишемия, индуцированная фототромбозом сосудов коры мозга у крыс, увеличивала уровень ацетилирования фактора транскрипции p53 по лизинам 320 и 373 в нейронах перифокальной области фототромботического инфаркта (ФТИ). Ацетилирование лизина 320 фактора транскрипции p53, осуществляемое ацетилтрансферазой PCAF (KAT2B), способствует перемещению p53 между ядром и цитоплазмой в нейронах пенумбры ФТИ, накапливаясь преимущественно в цитоплазме [см. источник: https://link.springer.com/article/10.1007/s12975-023-01183-z]. Согласно данным ингибиторного анализа, ацетилирование лизина 320 представляет собой предпочтительный процесс по сравнению с ацетилированием лизина 373, поскольку оно способствует выживанию и восстановлению функций нейронов пенумбры после инсульта. В цитоплазме нейронов перифокальной области ФТИ наблюдается увеличение уровня ацетилирования фактора транскрипции c-Myc по лизину 148, но не по лизину 323. Результаты молекулярно-динамического моделирования выявили ключевую роль лизина 148 c-Myc в стабилизации пространственной структуры данного белка. Ацетилирование лизина 148 c-Myc способствует перестройке альфа-спиралей белка относительно друг друга, формируя новый паттерн для его связывания с регуляторными или функциональными белков-партнерами. Данная гипотеза была подтверждена нами с использованием моделей докинга. Исследования in silico демонстрируют, что ацетилирование лизина 148 в c-Myc приводит к дестабилизации молекулы белка и может предотвращать образование комплекса с МAX, в то время как это не влияет на его способность взаимодействия с α-тубулином. Эти предположения были подтверждены результатами Duolink PLA , где количество взаимодействий между c-Myc и MAX оказалось значительно выше, чем между ацетилированным c-Myc по лизину 148 и MAX. Методами Duolink PLA и иммунопреципитации было показано, что после ФТИ фактор транскрипции c-Myc подвергается ацетилированию ацетилтрансферазами p300 (KAT3B) и, в меньшей степени, PCAF, как в ядрах, так и в цитоплазме нейронов. Сиртуин 2 (SIRT2) деацетилирует в основном c-Myc, ацетилированный по лизину 148 в цитоплазме, в то время как HDAC2 деацетилирует c-Myc, ацетилированный по лизину 323 в ядрах нервных клеток. Результаты ингибиторного анализа указывают на то, что ацетилирование c-Myc по лизину 148 и его цитоплазматическая локализация более предпочтительны, поскольку они содействуют выживанию нейронов в перифокальной области ФТИ, в отличие от ацетилирования ядерного c-Myc по лизину 323. В клетках перифокальной области ФТИ уровень ацетилирования фактора транскрипции E2F1 по лизинам 117 и 125 значительно не менялся ни в первые сутки после повреждения, ни в период восстановления. Ацетилирование E2F1 ацетилтрансферазой PCAF по лизину 125, но не по лизину 117, приводит к структурным изменениям в белке, закрывая его трансактивационный домен и мешая связыванию с регуляторными белками. На клеточной модели окислительного стресса, вызванного фотодинамическим воздействием, добавление ингибитора PCAF эмбелина c ингибитором E2F1 HLM006474 в среду инкубации приводит к значительному снижению апоптоза и процента некротических клеток SH-SY5Y, подавляя связывание E2F1 с ДНК и сдерживая его экспрессию. Динамика ацетилирования протеинкиназы В (Akt1) и регулируемых внеклеточными сигналами киназ ERK1/2 после ишемии различна. Уровень ацетилирования Akt1 в первые сутки после ФТИ снижается, способствуя увеличению активности фермента. В отличие от этого, ацетилирование ERK1/2 увеличивается в первые сутки после ФТИ и остается высоким в ранний восстановительный период. Ацетилирует Akt1 ацетилтрансфераза PCAF, тогда как ERK1/2 ацетилируется p300, что снижает активность обеих киназ. Деацетилирование киназ осуществляется HDAC6.