Аннотация результатов, полученных в 2021 году
Установлено, что микровезикулы, продуцируемые NK-клетками способны интернализироваться и передавать белок, меченный флуоресцентным красителем CFSE, в клетки трофобласта. Вместе с тем установлено, что микровезикулы клеток линии NK-92 не влияли на уровень экспрессии рецепторов CD54, CD105, CD126, CD130, CD181, CD119, CD120a, которые конститутивно экспрессируются трофобластом. Указанные рецепторы были выбраны исходя из предшествовавших наших работ, в которых мы установили принципиальную возможность изменения их экспрессии трофобластом в присутствии цитокинов. Полученный результат можно объяснить как отсутствие белков в составе микровезикул, способных изменять фенотип трофобласта, так и самой панелью использованных рецепторов: возможно, другие рецепторы изменяли свою экспрессию. Также микровезикулы клеток линии NK-92 не передают на мембрану клеток трофобласта рецепторы CD45 и CD56, характерные для естественных киллеров, но не экспрессируемых трофобластом. Ранее нами установлена передача панлейкоцитарного рецептора CD45 микровезикулами клеток линии NK-92 в состав цитоплазматической мембраны эндотелиальных клеток. Полученные данные в этой части работы свидетельствуют об отсутствии встраивания белков, входящих в состав цитоплазматической мембраны микровезикул клеток линии NK-92 в мембрану трофобласта и свидетельствует в пользу существования специфичных для каждого типа клеток механизма включения или невключения участков мембраны МВ в состав собственной цитоплазматической мембраны. Этот результат также может свидетельствовать в пользу разных механизмов транспорта содержимого в микровезикулах белка. Вероятно, в случае эндотелиальных клеток происходит слияние мембран МВ и цитоплазматической мембраны клетки, тогда как в случае трофобласта может происходить эндоцитоз МВ. Это предположение требует дополнительной проверки при помощи ковалентно меченных фосфолипидов. Несмотря на отсутствие изменения экспрессии рецепторов результатом воздействия МВ клеток линии NK-92 явилось их влияние на пролиферацию и миграцию клеток трофобласта. В результате культивирования клеток линии JEG-3 в присутствии одной и той же концентрации МВ клеток линии NK-92 установлено ингибирование пролиферации и увеличение миграции клеток линии JEG-3 за счет увеличения количества мигрировавших клеток и площади, занятой клетками, по сравнению с культивированием без МВ. Мигрирующая клетка не пролиферирует, что подтверждают наши данные. Таким образом, естественные киллеры за счет своих МВ способны снижать пролиферацию трофобласта и стимулировать его миграцию. Ранее это было показано только в случае прямого контакта естественных киллеров с трофобластом. Ответственными за полученные эффекты могут быть белки микровезикул, инициирующие активацию pSTAT3(Ser727)/STAT3 и MAPK сигнального пути и изменения экспрессии и активности каспаз в клетках линии JEG-3. Ранее нами в составе МВ клеток линии NK-92 при помощи масс-спектрометрии описано более 900 белков, входящих в их состав. Ответственными за реализацию обнаруженных нами эффектов могут быть каспазы и с-FLIP, изменение активности которых в трофобласте мы установили после действия на него МВ клеток линии NK-92. Так ранее установлено, что ограниченная активация каспаз до определенных фрагментов может быть ответственной за реализацию множества сценариев поведения клетки. С целью идентификации белков МВ, ответственных за биологические эффекты МВ в отношении трофобласта мы разделили при помощи хроматографии содержимое МВ на фракции и уже при помощи этих фракций пытались воздействовать на трофобласт. Как и нативные МВ, их фракции не влияли на фенотип клеток трофобласта. Нами изучено влияние клеток трофобласта на фенотип клеток линии NK-92 в условиях совместного культивирования в присутствии цитокинов IL-15 и IL-18 (выполнение этой задачи было запланировано на 2022 год (задача №6 в заявке), выполнена досрочно). культивирование клеток линии NK-92 в присутствии клеток трофобласта линии Jeg-3 стимулирует выраженное изменение фенотипа NK-клеток, сближая его с фенотипом dNK в присутствии клеток трофобласта. IL-15 вызывает увеличение количества NKG2D+ NK-клеток и интенсивности экспрессии ими CD127, IL-18 вызывает повышение количества NKp44+ NK-клеток, что свидетельствует о возможности приобретения NK-клетками ILC-подобного фенотипа под влиянием цитокинов IL-15 и IL-18. В присутствии клеток трофобласта линии Jeg-3 NK-клетки демонстрировали повышение интенсивности экспрессии NKG2D, что может отражать общую активацию NK-клеток с целью рецепции HLA-G на трофобласте и снижения цитотоксичности в отношения трофобласта Для расширения возможностей регуляции взаимодействий трофобласта и естественных киллеров за счет белков MICA и MICB нами проведен биоинформатический анализ опубликованных аллельных вариантов белков MICA и MICB человека. По всей длине экстраклеточных участков MICA и MICB расположены точечные аминокислотные замены и отсутствуют ярко выраженные вариабельные и консервативные домены. При этом аллельные последовательности MICB отличаются более высоким консерватизмом по сравнению с MICA. По результатам анализа сконструированы праймеры для выявления активности генов всех известных аллельных вариантов MICA и MICB и для амплификации последовательностей, кодирующих растворимую и мембранную формы белков MICA и MICB. Экспрессию генов MICA и MICB оценили в поддерживаемых в лаборатории клеточных культурах эндотелия (EA.hy926), меланомы (MeWo), глиом (T2, R1) и карцином (A549, HepG2, MCF-7, CaCO2). Уровень экспрессии находился на невысоком уровне и не зависел от гистогенетического происхождения клеток. Тепловой шок существенно повышал активность гена MICB почти во всех исследованных культурах. Экспрессия MICA при воздействии тепла существенно не менялась. В результате проведенных исследований подобраны матрицы для амплификации нуклеотидных последовательностей, кодирующих белки MICA и MICB — кДНК, синтезированная на основе мРНК подвергнутых тепловому шоку клеток HepG2 и MCF-7, соответственно. Клетки HepG2 несут аллель MICA*008, а клетки MCF-7 — аллель MICB*005, являющиеся одними из самых распространенных в европейской популяции. Полученные кДНК использовали для создания рекомбинантных плазмид на основе векторов pCEP4 и pQCXIP, содержащих последовательности, кодирующие растворимые или мембранные белки MICA и MICB, соответственно. В результате временной кальций-фосфатной трансфекции клеток млекопитающих НЕК-293 плазмидами pCEP4-MICA и pCEP4-MICB получены рекомбинантные белки MICA и MICB. Очистку белков из культуральных надосадков трансфицированных клеток HEK-293 проводили методом иммобилизованной металл-аффинной хроматографии. Наличие в полученных препаратах белков MICA и MICB подтвердили с помощью электрофореза, вестерн-блота и ИФА. С помощью плазмид pQCXIP-MICA и pQCXIP-MICB методом ретровирусной трансдукции на основе культуры крысиной глиомы С6 получили стабильные клеточные линии, экспрессирующие на мембране с высокой плотностью MICA (C6-MICA) или MICB (C6-MICB) человека. На основе созданных рекомбинантных белков и генно-модифицированных клеток разработаны тест-системы ИФА для выявления мышиных антител против MICA и MICB человека. С их помощью показано, что иммунизация мышей препаратами белков MICA или MICB человека вызывает у животных антительный ответ к соответствующему иммуногену. От иммунизированных мышей получены и заморожены клетки селезенки, которые будут использованы в последующей работе для получения гибридом-продуцентов моноклональных антител.

Аннотация результатов, полученных в 2022 году
Проведено сравнительное изучение влияние микровезикул (МВ) естественных киллеров (интактных и активированных TGFβ) на экспрессию serpin B6 и serpin B5, serpin B9 и степень активации каспаз. Установлено, что при сокультивировании трофобласта и естественных киллеров изменяется содержание серпина B9 в естественных киллерах. Ни естественные киллеры, ни микровезикулы не изменяют экспрессию серпинов и активность каспаз в клетках трофобласта. Установлено, что фракции лизатов клеток линии NK-92 изменяют экспрессию клетками трофобласта CD105 и TNFR2 и не влияют на экспрессию CD253, CD54, TRAIL-R1, TRAIL-R2 и TNFR1. При помощи ВЭЖХ проведено фракционирование лизатов микровезикул естественных киллеров. Установлено, что TGFβ, эндоглин и различные клоны моноклональных антител против эндоглина по-разному влияют на цитотоксичность естественных киллеров линии NK-92 в отношении клеток трофобласта. Данные о влиянии различных клонов моноклональных антител против эндоглина на цитотоксичность клеток линии NK-92 в отношении клеток трофобласта подтверждены на модели, в которой в качестве клеток-эффекторов вместо клеток линии NK-92 использовали мононуклеары периферической крови здоровых доноров. Полученный результат может быть использован в дальнейшем для коррекции цитотоксической активности етественных киллеров против различных клеток-мишеней. Оценка влияния моноклональных антител против CD105 на экспрессию smad в клетках линии NK-92 и в клетках линии JEG-3 после их совместного культивирования подтвердила изменение внутриклеточной сигнализации после обработки монокультур и сокультур TGFβ, эндоглином и различными клонами моноклональных антител против эндоглина. Параллельно установлено, что TGFβ и различные клоны моноклональных антител против эндоглина изменяют содержание в супернатантах моно- и сокультур клеток трофобласта и естественных киллеров. Суммируя данные, полученные в 2021 и в 2022 году по анализу влияния цитокинов, входящих в состав продуктов плацент 1 и 3 триместров необходимо отметить, что культивирование клеток линии NK-92 в присутствии клеток трофобласта линии Jeg-3 стимулирует выраженное изменение фенотипа NK-клеток, сближая его с фенотипом децидулаьных NK-клеток (dNK) в присутствии клеток трофобласта. IL-15 вызывает увеличение количества NKG2D+ NK-клеток и интенсивности экспрессии ими CD127, IL-18 вызывает повышение количества NKp44+ NK-клеток, что свидетельствует о возможности приобретения NK-клетками ILC-подобного фенотипа под влиянием цитокинов IL-15 и IL-18. IL-15 и IL-18 присутствуют в составе кондиционированных плацентами сред 1-го (КС1) и 3-го (КС3) триместров. В присутствии КС1 и клеток трофобласта линии Jeg-3 NK-клетки демонстрировали повышение интенсивности экспрессии NKG2D, что может отражать общую активацию NK-клеток в 1 триместре беременности, необходимую для ремоделирования стенки матки и формирования плаценты. В присутствии КС3 и клеток трофобласта линии Jeg-3 установлено снижение экспрессии NKG2D NK-клетками, что согласуется с представлениями о секреторной регуляторной функции NK-клеток матки в 3 триместре беременности. Данные об изменении цитотоксической активности NK-клеток в отношении клеток линии Jeg-3 в присутствии IL-15, IL-18 указывают на модулирование функции NK-клеток как цитокиновым микроокружением, так и непосредственно клетками-мишенями. Установлено, что применение препарата внутривенных иммуноглобулинов (ВВИГ) приводит к снижению цитотоксической активности NK-клеток в отношении клеток трофобласта in vitro. Эту модель можно использовать для оценки протективного эффекта ВВИГ в отношении клеток трофобласта в условиях их взаимодействия с NK-клетками на этапе подбора терапии при различных формах репродуктивной патологии, при которых планируется использование ВВИГ, в том числе при бесплодии. Нами обнаружена способность МВ естественных киллеров интернализоваться в моноцитоподобные клетки линии ТНР-1, оказывать влияние на их жизнеспособность, а также моделировать фенотипические и функциональные свойства. Полученные результаты доказывают способность МВ выступать в роли дополнительного механизма реализации иммуномодулирующих функций естественных киллеров в отношении моноцитарных клеток, что может служить отправной точкой в изучении роли различных типов внеклеточных везикул в отношении регуляции активности иммунных клеток. Получена новая панель МКАТ к маркерам клеточного стресса MICA и MICB, состоящая из 10 реагентов. МКАТ охарактеризованы с точки зрения их способности распознавать молекулы MICA/MICB, экспрессированные на мембране клеток (в том числе описано кросс-реактивное взаимодействие с этими АГ), структуры и взаимного расположения распознаваемых ими эпитопов. На основе созданных МКАТ разработано две двуцентровые системы ИФА, способные количественно определять растворимые формы MICA и MICB в диапазоне от 0.156 до 10 нг/мл и от 0.039 до 2.5 нг/мл, соответственно. Разработаны технологии очистки, стандартизации и хранения рекомбинантных калибраторов для этих систем.

Аннотация результатов, полученных в 2023 году
Установлено, что естественные киллеры и клетки трофобласта в условиях совместного культивирования изменяют фенотип друг друга. При этом трофобласт способен за счет изменения фенотипа и слущивания рецепторов со своей поверхности избегать цитотоксическо влияния со стороны естественных киллеров. Установлено, что молекулы MICA и MICB принимают активное участие в этом взаимодействии, подавляя экспрессию pAkt в клетках линии NK-92. Установлено, что микровезикулы клеток линии NK-92 вызывали активацию каспазы-8 в клетках трофобласта линии Jeg-3 с образованием промежуточного фрагмента и отсутствием конечного расщепления до активной каспазы-8. Значительных изменений содержания различных изоформ c-FLIP (FLIPL и FLIPs) в клетках линии Jeg-3 после их обработки микровезикулами NK-клеток, не обнаружено. Для сравнения, при дистантном взаимодействии клеток трофобласта с NK-клетками, смоделированной посредством системы transwell, в клетках линии Jeg-3 значительно увеличивалось содержание FLIPs. Продемонстрировано, что МВ NK-клеток способны передавать свое содержимое в клетку-мишень, в частности, содержащийся в них цитотоксический белок Гранзим B. При этом показано повышение активности каспазы-9 и каспазы-3 в клетках трофобласта. В отчетном году завершена детальная характеристика новой панели моноклональных антител (МКАТ) к молекулам MICA и MICB человека. Определена локализация эпитопов, распознаваемых этими реагентами, относительно двух функционально различных участков экстраклеточных доменов: α1α2 и α3. Создана широкая панель рекомбинантных аллельных вариантов молекул MICA и MICB, на основе которой составлены профили реактивности как самих МКАТ, так и основанными на них сэндвич-ИФА. Рассмотрена применимость созданных реагентов и тест-систем для изучения биологических образцов из европейской популяции. С использованием методов RT-PCR, проточной цитофлуориметрии и ИФА изучена экспрессия мРНК и белковых молекул MICA и MICB в клетках глиомы человека, а также оценена интенсивность шеддинга этих молекул. Показано, что эти клетки преимущественно экспрессируют молекулы MICA. Клетки, подвергнутые облучению или воздействию химиопрепарата, не проявляли изменений в уровнях экспрессии как мРНК, так и белковых молекул MICA/MICB. По всей видимости, описанные другими исследователями изменения в уровне экспрессии MICA/MICB вследствие воздействия химиопрепарата имеют транзиторный характер. Экспрессия генов, кодирующих эти молекулы, вероятно, возвращается к исходному уровню при выводе переживших клеток в массовую культуру. Экспериментально подтвержденных признаков экспрессии аннотированных в базе данных RefSeq альтернативных транскрипционных вариантов MICA также выявить не удалось. Клетки глиомы, несмотря на высокую плотность экспрессии MICA на мембране, обладают слабой интенсивностью образования растворимой формы этой молекулы. Этот признак также не изменялся у клеток, подвергнутых облучению или воздействию химиопрепарата. В экспериментальной модели, основанной на клетках глиомы крысы С6, экспрессирующих MICA, показано, что три МКАТ, направленные к α3-домену, способны к умеренному подавлению шеддинга этих молекул клетками. В то же время, эти же МКАТ усиливали интенсивность шеддинга MICВ в аналогичной модели. Таким образом, среди полученных МКАТ не выявлено реагентов, которые могли бы послужить прототипом для терапевтического препарата, ингибирующего шеддинг MICA/MICB и тем самым усиливающего чувствительность опухолевых клеток к распознаванию NK-клетками. Созданные в лаборатории сэндвич-ИФА для определения концентраций sMICA/sMICB, использовали для изучения прогностической ценности этих показателей при диагностировании двух патологий беременности (преэклампсии и преждевременного излития околоплодных вод) и одного онкологического заболевания (рака предстательной железы). Установлено, что женщины с умеренной или тяжелой формами преэклампсии обладали такими же уровнями sMICA/sMICB в периферической крови, что и женщины с нормальной гестацией. Напротив, пациентки с преждевременным излитием околоплодных вод имели повышенные концентрации sMICA и sMICB в плазме крови, а их суммарные уровни могут рассматриваться в качестве диагностического признака для этой патологии. Диапазон концентраций молекул sMICA/sMICB в плазме крови пациентов с раком предстательной железы варьировал от нескольких десятков пг/мл до сотен мкг/мл. Однако уровни этих молекул не были связаны с основными характеристиками заболевания, такими как степень злокачественности опухоли, наличием метастаз в регионарные лимфатические узлы или удаленных метастаз. Только уровень sMICA показал умеренную взаимосвязь с размером опухоли. Тем не менее, эти показатели эффективно прогнозировали выживаемость пациентов с раком предстательной железы.