Аннотация результатов, полученных в 2021 году
Целью нашего проекта является изучение механизмов возникновения и функционального значения структурной изменчивости генома, которая может модифицировать способность комаров быстро адаптироваться к природным условиям обитания. Для этого необходимо получить высококачественные референсные геномные сборки для An. messeae, An. beklemishevi и An. quadrimaсulatus, An. freeborni с помощью секвенирования Oxford Nanopore, Illumina и создания сверхдлинных скэффолдов, соответствующих по длине хромосомам, используя Hi-C. 1. Секвенирование и сборка генома малярийных комаров. На первом этапе работы была отработана методика выделения высокомолекулярной геномной ДНК в большой концентрации фенол-хлороформной экстракцией. В качестве материала были использованы определенные по видовому составу и полу замороженные на -70C куколки An. beklemishevi и An. messeae. Сбор имаго малярийных комаров проводили в населенных пунктах Колпашевского района Томской области в местах дневок самок, стайках для крупного рогатого скота и других домашних животных. Всего было получено 4 образца геномной ДНК по два для каждого вида An. beklemishevi и An. messeae (самцы и самки). Полученный образцы соответствуют всем требованиям (количество, чистота), предъявляемым к ДНК-библиотекам для секвенирования. Мы провели секвенирование Oxford Nanopore комаров An. freeborni и An. quadrimaсulatus и подготовили Hi-C библиотекy для An. quadrimaсulatus. An. quadrimaсulatus - наиболее близко-родственный вид к An. freeborni и изучаемых нами видов. Комары An. quadrimaсulatus были взяты из культуры, геномная ДНК была выделена и отсеквенирована Oxford Nanopore. Параллельно выли получены прочтения Hi-C из имаго An. quadrimaсulatus. Сборка генома An. quadrimaculatus осуществлялась посредством выравнивая прочтений Hi-C на геномные последовательности An.quadrimaculatus определённые методом Oxford Nanopore. Далее, с помощью свободно доступного программного обеспечения Juicertools проводилось построение карт Hi-C. Оценка библиотек Hi-C согласно стандартам ENCODE позволяет говорит о хорошем качестве проведения эксперимента Hi-C и возможности использования его результатов для сборки генома. Полученные выравнивания были поданы для обработки свободно доступному программному обеспечению 3D-DNA. Для хромосомы 3L был обнаружен особый паттерн контактов, сходный с паттерном локальных полиморфизмов на других хромосомах, однако он обладал рядом исключительных особенностей. Во-первых, паттерн локальных полиморфизмов характерен для регионов с низким покрытием прочтениями Hi-C, в то время как паттерн хромосомы 3L характерен для регионов с высоким покрытием. Во-вторых, локальные полиморфизмом покрывают не более 20% генома, в то время как паттерн хромосомы 3L покрывает 90-95% прочтений, входящих в хромосому 3L. Из литературных данных известно, что хромосома 3L у An. quadrimaculatus представлена в двух альтернативных вариантах, отличающихся массой перестроек. Мы предположили, что данный паттерн контактов (далее – паттерн глобальной глобального полиморфизма) наблюдается для прочтений, относящихся к разным вариантам хромосомы 3L (именуемых далее 3L1 и 3L2). Стоить отметить, что из-за особенностей организации хромосом 3R и 3L у An. quadrimaculatus оказалось невозможно собрать эти хромосомы в полном объёме. Хромосома 3R представлена 5 фрагментами. Фрагмент 3Ri – инвариантный длиной ~54 млн.п.о. захватывает большую часть хромосомы от теломеры к центромере. Фрагмент 3Ra представлен двумя альтернативными вариантами: 3Ra1 (~1.9 млн. п.о.) и 3Ra2 (~1.65 млн.п.о.). Данные фрагменты показывают сходство около 99% и главным образом различаются делецией в районе 1.2-1.5млн. п.о, в координатах 3Ra1. Фрагмент 3Rb непосредственно примыкает к центромере и представлен также представлен двумя альтернативными вариантами: 3Rb1 (1.1 млн. п.о) и 3Rb2 (1.08 млн.п.о.), показывающие сходство в 95%. Установить взаимосвязь между разными вариантами 3Ra и 3Rb не удалось из-за крайне незначительных отличий в числе контактов. 3L хромосомa была разделена на два альтернативных варианта: 3L1 (~40.8 млн. п.о.) и 3L2 (38.1 млн. п.о.). Эти варианты хромосома 3L демонстрируют 96% сходства при взаимном выравнивании. На текущий момент получены сборки для хромосом X, 2R, 2L и инвариантного участка хромосомы 3R. Для хромосомы 3L и вариабельная части хромосомы 3R дальнейшее улучшение сборки с использованием прочтений Hi-C не представляется возможным. Тем не менее, результаты построения карт Hi-C демонстрируют, что не смотря на все трудности, проведённым нами манипуляции не привели к существенному искажению геномных расстояний и позволили сохранить большую часть генома. 2. Разработка цитогенетической карты политенных хромосом клеток слюнных желез An. messeae. В качестве материала при разработке хромосомных карт высокого разрешения использовали слюнные железы личинок 4-го возраста и трофоциты яичников имаго An. messeae s. l., отловленных в природных популяциях Томской области. Видовую принадлежность личинок и имаго определяли с помощью анализа полиморфизма длин рестрикционных фрагментов региона ITS2. Сразу после приготовления препараты микроскопировали и получали микрофотографии политенных хромосом. Препараты хромосом микроскопировали с помощью AxioImager A1 (Carl Zeiss) в фазовом контрасте с объективом 100x. Изображения хромосом высокого разрешения были получены с помощью программного обеспечения AxioVision 4.9.1 (Carl Zeiss), а затем выпрямлены и обрезаны по методике, разработанной ранее для создания цитогенетических карт малярийных комаров. Для обработки изображений хромосом и конструирования карт использовали программы Helicon focus lite и Adobe Photoshop CC 2019. В ходе работы приготовлено более 30 препаратов неокрашенных политенных хромосом слюнных железы и более 20 препаратов политенных хромосом трофоцитов яичников. Получено 130 изображений хромосом слюнных желез и 35 изображений политенных хромосом трофоцитов яичников высокого качества, которые далее использованы для создания карт. Была создана карта хромосом слюнных желез An. messeae, которая включающая наиболее распространенные в инверсионные генотипы: XL11, 2R11, 2L00, 3R00, 3L00. Для трофоцитов яичников An. messeae, разработаны карты хромосомных плеч 2R11, 2L00, а также фрагмента 3L00. 3. Физическое картирование точек разрывов фиксированных перестроек и полиморфной инверсий в X хромосоме Anopheles messeae. В данной работе проводилось геномное картирование и с описанием окрестностей точек разрывов фиксированных перестроек и полиморфной инверсий X2 в Х хромосоме An. messeae с использованием в качестве референсного геном An. atroparvus (AatrE3). C помощью физического картирования ортологов генов An. atroparvus на цитогенетической карте An. messeae и проводилось уточнение координат точек разрывов фиксированных перестроек и полиморфной инверсии An. messeae на геномной карте An. atroparvus. 1. Фиксированные перестройки в Х хромосоме An. messeae – 2 вложенные одна в другую инверсии. X хромосомы трех близкородственных видов An. atroparvus, An. labranchiae и An. maculipennis не несут крупных (протяжённостью более 1 млн. п. н.) фиксированных хромосомных перестроек. В ходе настоящей работы было картировано 39 генов для определения точек разрывов фиксированных хромосомных перестроек у An. messeae в сравнении с порядком генов у An. atroparvus. Было картированы гены, фланкирующие четыре точки разрыва фиксированных хромосомных перестроек в Х хромосоме An. messeae на геномной карте An. atroparvus c разрешением от 7 до 15 тыс. п. н. Анализ перестроек синтенных блоков ограниченных этими точками разрыва с учётом их положения и ориентации у An. atroparvus и An. messeae в программе GRIMM показало что межвидовые различия в порядке генов в Х хромосомах у этих видов могли быть вызваны двумя вложенными одна в другую хромосомными инверсиями. Эта хромосомная перестройка приводит к изменению локализации и ориентации двух районов хромосом протяжённостью 500 тыс. п. н. и около 2 млн п. н. 2. В окрестностях точек разрывов фиксированных хромосомных перестроек Х хромосомы находятся мобильные генетические элементы. С помощью базы данных Gene Ontology была проанализирована онтология генов. находящихся в окрестностях четырёх точек разрывов инверсий. в окне около 100-200 тыс. п.н. Проанализированные данные демонстрируют, что точки разрывов находятся в окружении генов «домашнего хозяйства». Вблизи точек разрывов нам удалось обнаружить мобильные генетические элементы. принадлежащих классам Gypsy, R1, Tc-Mariner, Helitron и некоторым другим. Подтверждением уникальности события. в результате которого возникла одна из двух фиксированных инверсий, может быть принадлежность МГЭ в окрестностях обеих точек разрывов одному классу - Gypsy. 3. Окрестности точек разрывов фиксированных инверсий в Х хромосоме An. messeae находятся в одной группе сцепления у других видов малярийных комаров С помощью инструментов базы VectorBase было проанализировано: возникают ли разрывы в точках. фланкированных ортологами (обнаруженных нами) генов или их окрестностей. у других видов малярийных комаров. При анализе групп сцепления генов вблизи точек разрывов An. messeae и An. atroparvus у An. albimanus, An. arabiensis, An. coluzzii, An. funestus, An. gambiae, An. merus, An. sinensis. An. stephensi не было выявлено случаев. когда те же гены находились бы в других группах сцепления (синтенных блоках). 4. Одна из точек разрыва полиморфной инверсии X2 An. messeae расположена в окрестностях точки разрыва одной из фиксированных хромосомных перестроек. Было физически картировано 11 генов с целью определить гены. фланкирующие точки разрыва полиморфной инверсии X2 у An. messeae. Картирование проведено с разрешением около 15 тыс. п. н. для первой второй точек. Обнаружено. что вторая точка разрыва полиморфной инверсии фланкируется одним из генов, что и одна из фиксированных инверсий в Х хромосоме. Таким образом. обе точки разрыва расположены предположительно в диапазоне около 15 тыс. п. н. Первая же точка разрыва полиморфной инверсии локализуется в пределах одного из двух участков, положение которого меняется в ходе фиксированной перестройки Х хромосомы An. messeae. Таким образом положение точек разрыва трех хромосомных инверсий, которые сопровождали эволюцию Х хромосомы An. messeae укладывается в диапазон не более 2.5 млн п. н.. что составляет немногим более 10% длины.

Аннотация результатов, полученных в 2022 году
Проект направлен на изучение механизмов возникновения и функционирования хромосомных перестроек у малярийных комаров. Для выполнения проекта были разработаны привязанные к хромосомам геномные сборки малярийных комаров An. messeae, An. beklemishevi и An. freeborni используя такие инновационные технологии как секвенирование Oxford Nanopore, скэффолдинг Hi-C и физическое картирование геномов. За отчетный период получены следующие результаты. 1. Геномная сборка хромосомного уровня для An. freeborni и пространственная организации хроматина малярийных комаров. С помощью секвенирования Oxford Nanopore, Illumina и создания сверхдлинных скэффолдов, используя Hi-C, мы получили геномную сборку хромосомного уровня для An. freeborni. Для описания пространственной организации хроматина у An. freeborni и An. quadrimaculatus с помощью ПО juicertools были сгенерированы карты Hi-C, на основе которых проводилось выделение A/B-компартментов и доменов. Использование алгоритма ABCE позволило систематически выделить A/B компартменты для всех хромосом, что подтверждается достаточным коэффициентом корреляции между значением компартмента и плотностью генов. Нами было проведено сравнение силы компартментализации контактов, разделенных расстоянием менее 10 млн п.о. Т.к. ориентация хромосом по Раблю даёт наибольший вклад для контактов между удалёнными регионами, ожидалось, что для контактов на расстоянии менее 10 млн. п.о. силa компартментализации будет выше. Результаты подтвердили это предположение. Мы показали, что границы доменов значимо обогащены A-компартментом и генами. Данное сочетание является ожидаемым, так как величина компартмента коррелирует с плотностью генов. Более детальное исследование, проведённое на доменах длиной более 100 тысяч п.о., показывает сильные колебания значения компартмента в окрестностях границы домена. Это указывает на существование двух фракций доменов: более коротких, расположенных преимущественно в A-компартменте, и более длинных, в B-компартменте. Изучение распределение повторов разных классов относительно границ доменов позволило выявить обогащение границ доменов простыми повторами. 2. Эволюционное сравнение геномов An. quadrimaculatis, An. freeborni и An. atroparvus. В результате взаимного выравнивания исследуемых геномов удалось выявить 13 точек разрыва хромосом уникальных для An. quadrimaculatis, 7 точек разрыва хромосом уникальных для An. freeborni и 5 точек разрыва хромосом уникальных для An. atroparvus. Кроме этого для каждого вида было выявлено несколько десятков точек разрывов, встречающихся повторно и у иных видов комаров. 3. Физическая геномная карта X хромосомы и характеристика точек разрыва полиморфных инверсий XL1, XL2 у An. messeae. Мы провели физическое картирование Х хромосомы An. messeae методом флуоресцентной in situ гибридизации (FISH). Это позволило картировать точки разрывов полиморфной инверсий X1 An. messeae. Кроме того, мы провели геномное картирование на сборке AatrE3 референсного генома An. atroparvus. Было обнаружено, что в окрестности дистальной точки разрыва инверсии X1 у An. atroparvus располагаются гены белков, задействованных в процессах автофагии и везикулярного транспорта AATE012020 (vacuolar protein sorting), AATE006100 (vesicle transport protein SEC20) и белка секрета слюнных желез AATE010388 (salivary gland protein 1-like). Также в окрестности этой точки разрыва расположены гены, содержащие у An. messeae и An. daciae функционально значимые замены нуклеотидов: AATE013372, AATE017957, AATE015468. Мобильные элементы, обнаруженные вблизи дистальной точки разрыва инверсии Х1 принадлежали классам Gypsy, Bell, Ag-Jock. 4. Определение координат точек разрывов перестроек в Х хромосоме и перестройки 2R1 у Anopheles messeae. В результате физического картирования удалось определить примерные координаты (диапазон до 15 тысяч п.о.) точек разрывов 2 вложенных инверсий в Х хромосоме Anopheles messeae (4 точки разрыва). Методы физического картирования опирались на данные по сборке референсного генома Anopheles atroparvus (AatrE3). Для уточнения координат точек разрывов были использованы длинные прочтения, полученные с помощью секвенатора MinION. Инструмент blastn из command-line blast+ использовался для выравнивания участков генома Anopheles atroparvus (AatrE3) на библиотеку прочтений. Подбирались наиболее близкие гены к точкам разрывов. Так, удалось обнаружить, что в библиотеки длинных прочтений присутствуют прочтения, которые целиком содержат точку разрыва 2 (картированные гены Anopheles atroparvus AATE002183, AATE020848): в результате анализа выяснилось, что ген, фланкирующий точку разрыва слева не ортолог AATE002183 Anopheles atroparvus, а соседний ортолог AATE020008, расстояние между генами, сократили расстояния точки разрыва до 1400 нуклеотидов. Для точки разрыва 3 (картированные гены Anopheles atroparvus AATE000407, AATE016478) перенесена левая граница на ортолог гена AATE001433. Для точки разрыва 4 (картированные гены Anopheles atroparvus AATE016042, AATE009858) граница слева перенесена на ортолог гена AATE011784. Методами физического картирования ранее было установлено, что точка разрыва 2R1 Anopheles messeae располагается в окрестностях 12.5 Мб и 36.5 Мб на координатах 2R Anopheles atroparvus (AatrE3). Однако определенные координаты точки разрыва были не известны. С помощью библиотеки длинных прочтений Anopheles messeae, секвенирование на MinION, удалось обнаружить прочтения, описывающие окрестности точки разрыва Anopheles messeae. Удалось определить ортологи генов Anopheles atroparvus, которые содержат точку разрыва, также удалось найти прочтения, которые бы детально описывали точку разрыва. Так, координаты левой точки разрыва (на геноме Anopheles atroparvus AatrE3) находятся в окрестностях 12.603.160 внутри гена ААТЕ009822 (разорванный инверсией ген), а справа – 36.840.600 – внутри гена ААТЕ010343 (разорванный инверсией ген). 5. Анализ частоты генотипов инверсии X1 и Х2 в природных популяциях An. beklemishevi. Частоты гомозигот по инверсиям в X хромосомы в природных популяциях An. beklemishevi определялись c помощью метода FISH. C помощью микродиссекции и ПЦР был разработан флуоресцентный ДНК-зонд, маркирующий район 1а-3а Х стандартной хромосомы An. beklemishevi. Район включает только по одной, дистальной, точки разрывов полиморфных инверсий X1 и X2. После проведения FISH сo стандартной Х хромосомой сигнал непрерывный, однако у инвертированных вариантов хромосомы X1 и X2 меченный район разделяется на две части, специфичным образом для каждой инверсии, что позволяет легко определить генотип гомозигот Х11, Х22 или гемизигот. Материалом для исследования послужили выборки личинок малярийных комаров рода Anopheles, отловленных в естественных водоёмах на территории Сибири (Ямало-Ненецкого автономный округа (ЯНАО), Ханты-Мансийского автономный округ (ХМАО), Красноярский край (КК), Томская область (ТО) и Республика Алтай) в период с 2019 по 2021 годы. Была определена видовая принадлежность 685 личинок малярийных комаров из 8 природных популяций. Расстояние между самой северной (с. Шурышкары) и самой южной (с. Озерное) составляло почти 2000 километров. Обычно личинки An. beklemishevi обитают с An. messeae и An. daciae совместно, но на севере и в высокогорьях, как и в раннелетний период, можно встретить в основном особей только этого вида. Стандартный гомозиготный цитотип был найден во всех популяциях с явным преобладанием по сравнению с инвертированными гомозиготами. Инверсия Х1 в гемизиготном состоянии была обнаружена с частотами 3,6–3,9 % всего лишь в двух популяциях (с. Чоя и г. Стрежевой, респ. Алтай), тогда как гомозиготные особи с генотипом Х2 были найден в семи популяциях с частотами 7,2–33,33 % в предгорьях Алтая, средних (ТО и КК) и северных широтах (ХМАО) Сибири. Инверсии встречались также в гетерозиготном состоянии в тех же популяциях. Полученные с помощью примененного методического подхода результаты показали значительную долю гомо и гемизиготных особей по инверсиям, которые раньше описывали в основном в гетерозиготном состоянии.

Аннотация результатов, полученных в 2023 году
Проведена работа по изучению механизмов возникновения и функционирования хромосомных перестроек у малярийных комаров. Для комаров An. arabiensis, An. atroparvus, An. albimanus, An. merus, An. stephensi, An. coluzzii, An. freeborni, и An. funestus были отобраны сборки хромосомного уровня, полученные с помощью технологий «длинных прочтений» – Oxfrod Nanopore и PacBio. Для сравнительного анализа покрытия повторами разных групп в геномах Anopheles для каждой из отобранной сборки проводился анализ на покрытие генома повторами с помощью пайплайна EDTA. Для повторов каждой группы (TEs I, TEs II, Simple repeats, Unknown) строились графики распределения повторов этих типов для каждой из хромосом в окне 100 тыс. п. н. Также рассчитывались покрытия кодирующими последовтельностями окне того же размера для каждой из хромосом и для каждого из восьми видов Anopheles. В ходе анализа было проведено предсказание новых областей гетрохроматина в геномах комаров методом K-Means. Кроме того, был проведен анализ сателлитной ДНК у видов An.beklemishevi, An.messeae, An.atroparvus. An.dacieae, An.melanoon на основе прочтений Illumina инструментом RepeatExplorer2. Выяснилось, что представленность сателлитов определенных групп коррелирует с филогенетическим положением видов комаров, которые были установлены ранее (РНФ № 15-14-20011). Так, наиболее далекий вид от всех остальных по составу сателлитов – An. beklemishevi, поскольку его геном содержит лишь два типа сателлитов из числа широко представленных у группы. Виды-двойники An. daciae и An.messeae слабо отличаются друг от друга по сателлитному составу. У An.atroparvus имеются общие сателлиты с An. messeae и An.daciae, так и с An.melanoon, у которого имеются общие сателлиты со всеми другими видами. Таким образом, сателлитная ДНК относится к наиболее быстро эволюционирующему классу повторов у малярийных комаров. При анализе районов генома содержащие эволюционные перестройки были использованы не только координаты точек разрывов хромосом, которые произошли в ходе эволюции изучаемого вида, но и те, которые происходили у других видов, и которые по принципам синтении можно было перенести на целевой вид. Результаты межвидового сравнения показали, что чаще всего границы разрывов блоков синтении находятся в районах А-компартмента – транскрипционно активного хроматина, насыщенного генами. Для всех видов кроме An. albimanus обнаружилось выраженное уменьшение насыщенности точек разрывов блоков синтении простыми повторами. Для группы видов An. stephensi-An. coluzzii характерна более высокая насыщенность эволюционных точек разрывов перестроек ДНК-транспозонами и ретротранспозонами. Сравнение силы инсуляции пространственных контактов в границах синтенных блоков показало, что регионы разрывов блоков синтении отличаются более высокой инсуляцией, чем в среднем по геному, что указывает также на то, что границы синтенных блоков часто совпадают с границами ТАДов или находятся в их окрестности. При этом более древние эволюционные разрывы, ограничивающие, в среднем, более протяженные по длине компартменты, находятся в районах с более выраженной инсуляцией. Детальное сравнение положения границ доменов и синтенных блоков показало, что они более насыщены генами, чем случайный участок в геноме. Чтобы определить, что может являться направляющим фактором для формирования эволюционного разрыва хромосом – инсуляция пространственных контактов или транскрипционно-активный хроматин – был проведен анализ зависимости между длиной доменов и средним значением компартмента в них. Оказалось, что домены длиной менее 200 тыс. п. н. имеют выраженную принадлежность к A-компартменту и активному хроматину, а более длинные – к B-компартменту. То есть, выраженная инсуляция в районах разрывов синтенных блоков связана с тем, что они формируются в районах активного хроматина. Аналогично закономерности между нарушением синтении и представленностью повторами разных классов определяется теми повторами, которые расположены в активном хроматине. Таким образом, локализация точек эволюционных разрывов определяется прежде всего, положением активного хроматина хромосомных перестроек главным фактором, определяющим место формирования эволюционных разрывов хромосом, является принадлежность целевых регионов активному хроматину, тогда как прочие особенности этих районов – генетический состав и пространственная организация могут характеризовать отдельные филогенетические линии. https://news.tsu.ru/news/genetiki-tgu-vyyasnili-chto-malyariynye-komary-popali-v-evropu-iz-sibiri/