Аннотация результатов, полученных в 2021 году
Основной целью проекта является экспериментальное доказательство влияния потенциально образующихся G-квадруплексных структур (на примере промоторной области гена TERT) на эффективность удаления геномных повреждений, локализованных внутри или в непосредственной близости от них, под действием ключевых систем репарации ДНК. 1. Показано, что в промоторах гена TERT различных млекопитающих находятся 3 консервативные последовательности, способные к образованию G-квадруплекса. В промоторе гена TERT человека выявлены 9 онкоассоциированных мутаций по информации из базы данных COSMIC. Три из онкоассоциированных мутаций находятся в одном из двух G-богатых районов промотора TERT, четыре - в другом, и только две такие мутации расположены вне G-богатых районов анализируемого промотора. В промоторах других семи онкогенов ни одна из онкоассоциированных мутаций из базы данных COSMIC не локализована в G-богатых районах TERT-промотора. 2. Сконструированы и синтезированы компоненты линейных одно- и двухцепочечных модельных систем, содержащих 68-звенные G-богатые участки нативного или мутированного промотора гена TERT, а также фрагменты ДНК, используемые в качестве контролей. Результаты, полученные методами химического пробинга (с ДМС в качестве модифицирующего реагента) и УФ-спектроскопии, подтверждают структуру из трех тандемно расположенных G4, которая образуется 12 G-трактами TERT-промотора человека в составе 96-98-звенных одноцепочечных моделей. Тпл мультиквадруплексной структуры составляет 53 градуса С в найденных экспериментальных условиях. Однонуклеотидные замены в некоторой степени нарушают локальную конформацию G4-ассоциата, но не разрушают его полностью. В линейной двухцепочечной модельной системе образующаяся квадруплексная структура закрепляется в двуспиральном ДНК-контексте, поскольку в матричной цепи отсутствует участок, комплементарный G4-образующей последовательности, и конкурирующий процесс образования Уотсон-Криковского дуплекса G4-мотивом заблокирован; при этом дуплексные участки, фланкирующие квадруплекс, стабилизируют всю систему. Сконструировано два типа матричных олигонуклеотидов — 36- и 34-звенные, которые отличались длиной олигонуклеотидного мостика, используемого вместо последовательности, комплементарной 68-звенному G4-мотиву, а также первичной структурой в области сочленения дуплексных и квадруплексных доменов. Показано, что в найденных оптимальных условиях Тпл дуплексной структуры составляет 55 градусов С. Аналогичная стратегия была впервые опробована при встраивании G4-мотива в ковалентно замкнутую плазмидную ДНК. Плазмиду pUC-MMR гидролизовали никующей эндонуклеазой Nt.Bpu10I и лигировали продукт с олигонуклеотидом, содержащим вставку TT(GGGT)4T. Образование G4-структуры в «выпетленном» G4-мотиве доказано методом «остановки полимеразы» перед препятствием в виде квадруплекса. С помощью этого же метода было доказано образование квадруплексных ассоциатов в двухцепочечной промоторной области гена TERТ длиной 237 пар нуклеотидов, клонированной в плазмиду pUC19. 3. Показано образование транскриптов с G-богатой (нематричной) цепи промоторной области гена TERT рядом с местом сосредоточения канцерогенных мутаций, что может являться фактором стабилизации квадруплексных структур. 4. Установлено влияние структурных особенностей G-квадруплексов на эффективность удаления повреждений, локализованных внутри или в непосредственной близости от них, под действием ключевых белков системы репарации «мисматчей» (MMR) – MutS и MutL и системы эксцизионной репарации оснований - урацил-ДНК-гликозилазы. Ранее нами установлено, что белок MutS узнает и связывается с G4-структурой ДНК, однако не распознается системой MMR как сигнал для репарации, хотя и не препятствуют ее функционированию (Pavlova et al., Int. J. Mol. Sci., 2020, 21, 8773). В 2021 г. с помощью ДНК-моделей, в которых параллельный квадруплекс, образованный последовательностью (GGGT)4, был стабилизирован в дуплексном окружении, была охарактеризована эффективность функционирования комплекса белков MutH-MutL-MutS из Е. coli в зависимости от положения «мисматча» G/T, с 3′- и 5′-стороны от G4, а также расстояния между G4 и «мисматчем», которое варьировалось от 18 до 3 пар нуклеотидов. Оказалось, что даже располагаясь в непосредственной близости от специфических участков узнавания белков MMR, G4 не препятствует инициации репарации вне зависимости от его положения относительно G/T-«мисматча». Было установлено, что фланкированный олигонуклеотидными фрагментами 69-звенный фрагмент промотора гена TERT человека, способный формировать мультиквадруплексные структуры, более эффективно связывает белок MutS по сравнению с «природным» лигандом - «мисматч»-содержащей ДНК. Такого эффекта не было обнаружено в случае белка MutL. Мутации G124A, G146A и G138А/G139A в последовательности TERT-промотора не влияют на комплексообразование с как с MutS, так и с MutL. Исследован гидролиз модельных ДНК, содержащих дезоксиуридин в структуре единичного параллельного внутримолекулярного G-квадруплекса и в трехквадруплексной структуре, образуемой G-богатой цепью TERT-промотора, двумя урацил-ДНК-гликозилазами: UNG2 человека и УДГ из E. coli. Показано, что эффективность выщепления дезоксиуридина обоими ферментами значительно снижается, когда dU расположен в петлях квадруплексных систем разного уровня сложности. В случае мультиквадруплексных структур процесс удаления урацила протекает тем эффективнее, чем длиннее dU-содержащий участок между G4-единицами. Эффективность выщепления урацила минимальна при длине межквадруплексного участка равного одному модифицированному нуклеотиду. Продемонстрирована возможность использования фермента урацил-ДНК-гликозилазы для ферментативного «пробинга» структурированных G-богатых областей ДНК.

Аннотация результатов, полученных в 2022 году
1. Выполнен биоинформатический анализ последовательности промотора гена TERT, содержащей экспериментально доказанные G-квадруплексные структуры (G4), различными алгоритмами для предсказания квадруплексов. Показано, что QGRS mapper является оптимальной программой, которая позволяет находить стабильные G4. Частота точечных нуклеотидных замен в квадруплексах промоторов онкогенов повышена. Чаще всего в C/G-богатых учaстках встречается замена C>T. Это согласуется с экспериментальными данными проекта о влиянии квадруплексов на функционирование системы репарации неканонических пар нуклеотидов или «мисматчей» (MMR). 2. Охарактеризована первичная структура некодирующей РНК, транскрибирующейся с промоторной области гена TERT человека. Этот слабо представленный транскрипт является РНК TAPAS. Установлено, что РНК TAPAS экспрессируется в линии VA13, иммортализованной по теломераза-независимому механизму. Создана система для конститутивного нокдауна исследуемой РНК. 3. Создана репортерная система in vivo на основе клеток E. coli для исследования взаимодействия лигандов, стабилизирующих G4, с квадруплексной структурой, образованной G/C-богатой последовательностью TERT-промотора. С помощью полученных конструкций впервые продемонстрировано, что область промотора TERT размером 41 пар нуклеотидов, в которой возникают и закрепляются онкогенные мутации, формирует G4 в отрицательно сверхспирализованной репортерной плазмидной конструкции. Показано, что нуклеотидные замены, которые встречаются в этом районе при определенных видах рака, влияют на стабильность G4 в клетках. 4. Белки MutS и MutL из системы MMR эффективно связываются с G4-структурами промотора гена TERT человека даже несмотря на точечные нуклеотидные замены в местах наиболее значимых онкологических мутаций. Низкомолекулярные G4-стабилизирующие лиганды BRACO19, TMPyP4 и PhenDC3, конкурируют с MutS и MutL за сайты связывания в ДНК, что подтверждает взаимодействие рассматриваемых белков именно с G4-структурой. Доказано, что G4 в ДНК не является сигналом для инициации метил-направленной репарации «мисматчей», характерной для Е. coli. Полученный результат был подтверждён на впервые разработанной нами плазмидной конструкции с закрепленным в ней параллельным G4 и другими элементами, инициирующими систему MMR. Показано, что G4 структура, стабилизированная в плазмидном субстрате, также не активирует эндонуклеазную функцию белка ngМutL – компонента метил-независимой репарации ДНК-«мисматчей» N. gonorrhoeae. Более того, ngMutL демонстрирует очень низкую эффективность гидролиза фосфодиэфирных связей внутри G4. Таким образом, G4 может выступать в качестве «ловушки» для белков MutL. Наши данные свидетельствуют о том, что присутствие в геноме G-богатых последовательностей, способных образовывать G4-структуры, будет снижать эффективность работы системы MMR. 5. Изучено взаимодействие белков системы репарации MMR E. coli с ДНК-дуплексами, содержащими в N2-положении гуанина остатки пиридина, пиридазина, пиримидина или пиразина (HAA-ДНК). Такие ДНК моделируют канцерогенные аддукты, встречающиеся в термически обработанном мясе, сигаретном дыме и др. Охарактеризовано комплексообразование белка есMutS с 17-звенными ДНК-дуплексами, включавшими одну из перечисленных выше модификаций гуанина в составе канонической HAA-G/C пары или в составе HAA-G/T-«мисматча». Продемонстрировано, что есMutS способен узнавать экзоциклические N2-гуаниновые гетероарильные аддукты в ДНК как повреждения. Связывание MutS с такими ДНК в несколько раз эффективнее по сравнению с «мисматч»-содержащей ДНК, по-видимому, за счет взаимодействия Phe38 MutS с гетероароматической структурой модифицированного гуанина. Влияние HAA-G на взаимодействие есMutL с двуспиральной ДНК и на эффективность одноцепочечного разрыва комплексом белков есMutS-есMutL-есMutH было изучено на более протяженных 76-звенных дуплексах, содержащих участок узнавания эндонуклеазой есMutH. В этих ДНК-субстратах модифицированный гуанин также находился как в составе G/C-, так и G/T-пары. Согласно полученным данным, HAA-G-производные в составе «мисматча» стимулируют внесение одноцепочечного разрыва в ДНК-дуплексы комплексом белков репарации. Эти результаты позволяют предположить участие MMR в процессинге объемных аддуктов ДНК с канцерогенами наряду с системой эксцизионной репарации нуклеотидов. Наличие таких модифицированных нуклеотидов в промоторе гена TERT может «отвлекать на себя» белки системы МMR и способствовать закреплению драйверных мутаций. 6. Установлено, что белки OGG1 и APE1 системы эксцизионной репарации оснований (BER) человека взаимодействуют со своими специфическими субстратами – oxo-dG и THF (устойчивым аналогом AP-сайта), соответственно, находящимися в составе G4-содержащей цепи промотора гена TERT в местах онкологически значимых мутаций. Продемонстрировано, что эффективность удаления повреждения зависит от его местоположения в квадруплексной структуре. Повреждения в позициях 138, 139 и 138+139 успешно исправляются белками OGG1 и APE1 человека. Функционирование этих белков в позициях 124 и 146 затруднено, что может приводить к появлению и закреплению мутаций. Выявленная позиционная зависимость эффективности репарации oxo-dG и АР-сайтов системой ВЕR непосредственно связана со степенью влияния этих повреждений на локальную стабильность и структурные особенности G4. С помощью метода КД показано, что замены dG на oxo-dG и АР-сайты не меняют общей параллельной топологии G4, но приводят к дестабилизации G4, степень которой зависит от природы и позиции повреждения в квадруплексной структуре. В большей степени эта зависимость выражена для фрагментов TERT, содержащих АР-сайты.

Аннотация результатов, полученных в 2023 году
В ходе каждого клеточного деления концевые участки хромосом, теломеры, сокращаются на 3–6 нуклеотидов. Теломераза – фермент, добавляющий определённую последовательность (TTAGGG в случае позвоночных) к теломерным повторам, активный в стволовых, половых и раковых клетках. Мутации в промоторе гена теломеразной обратной транскриптазы (TERT) человека встречаются при множественных видах рака и часто представлены заменами G>A матричной цепи (C>T в кодирующей цепи) в позициях 124, 138, 139 и 146 относительно стартового кодона. Полагают, что данные мутации образуют сайт связывания факторов семейства ETS, действие которых повышает экспрессию гена TERT. Описанная G-богатая область генома (участок TERT) содержит 12 G-трактов, способных образовывать 3 последовательно расположенных параллельных квадруплекса in vitro (Pavlova et al., Biomedicines, 2022). 1. С помощью биоинформатических подходов нами было показано, что G4-мотивы преимущественно расположены в области, проксимальной к точке инициации транскрипции (до 400 пар нуклеотидов) на некодирующей цепи промоторов TERT. Установлено, что G4-мотивы промоторов TERT в классе млекопитающих эволюционно консервативны, и, следовательно, биологически значимы. Плотность мутаций в промоторах TERT у приматов выше, чем в контрольных участках, что подтверждается парным критерием Вилкоксона (Panova et al., Life, 2023). Координаты пиков G4, полученные Chambers et al. (Nat. Biotechnol., 2015) экспериментально в присутствии K+ (условия, способствующие формированию квадруплексов) примерно совпадают с координатами областей промоторов. В целом, можно утверждать о статистически значимой разнице плотностей мутаций в онкогенах (выборка из 14 онкогенов) в G4-мотивах и GC-богатых областях. В G4-мотивах плотность мутаций достоверно выше. Плотность мутаций в G4-мотивах генома человека достоверно больше, чем плотность мутаций вне квадруплексных участков. 2. Промотор гена TERT человека является двунаправленным, то есть данный участок генома содержит точки инициации транскрипции i) гена TERT и ii) гена TAPAS, экспрессируемого в противоположном по отношению к гену TERT направлении. С гена TAPAS синтезируется длинная некодирующая РНК – РНК TAPAS. Данный транскрипт крайне низко представлен в клетках человека и мало изучен. Разработана тест-система, позволяющая количественно определять РНК TAPAS. Данная система основана на методе цифровой ПЦР в варианте Taqman, при котором сигнал флуоресценции возникает при направленной деградации ДНК-зонда. Такая технология позволяет эффективно и надёжно определять РНК TAPAS даже в достаточно низких концентрациях. Скрининг ряда клеточных линий как опухолевого, так и неопухолевого происхождения, проведенный с помощью этой тест-системы, подтвердил, что наиболее стабильная экспрессия гена TAPAS наблюдается для линии A549 (аденокарцинома лёгкого). 3. GC-богатый нуклеотидный состав промотора гена TERT способствует возникновению различных повреждений таких, как 8-оксо-2'-дезоксигуанозин (oxoG), апуриновый/апиримидиновый участок (AP-сайт), 2'-дезоксиуридин (dU), 5-гидрокси-2'-дезоксиуридин (oU) или 5-гидрокси-2'-дезоксицитидин (oC). Закрепление мутаций в позициях 124, 138, 139 и 146 относительно стартового кодона в TERT-промоторе могут возникать из-за низкой эффективности функционирования ферментов системы BER, удаляющих эти повреждения: урацил-ДНК-гликозилазы (UNG), 8-оксогуанин-гликозилазы (OGG1), ДНК-гликозилаз NEIL (NEIL1 и NEIL2) и АР-эндонуклеазы (АРЕ1) в определенных условиях. Мы убедительно показали, что возможное образование неканонических структур ДНК, в частности G-квадруплексов (G4) в G-богатой матричной цепи и i-мотивов в С-богатой кодирующей цепи TERT-промотора, может быть причиной ингибирования действия этих ферментов. 3.1. Показано, что снижение эффективности удаления урацила в петлях G4 ферментом UNG происходит не за счет ухудшения связывания фермента с квадруплексом, а на дальнейших этапах ДНК-белкового взаимодействия (изгибание ДНК, узнавание и выворачивание основания, стадия катализа). 3.2. Установлено, что APE1-индуцированное расщепление ДНК, содержащих стабильный аналог апуринового/апиримидинового сайта в значительной мере коррелирует со стабильностью G4-структуры в промоторе гена TERT. Нуклеотидные замены в результате снижения эффективности работы фермента APE1 в условиях образования G4 могут появляться не только в G-богатой (позиция 124), но и в С-богатой комплементарной цепи (позиции 146 и 138+139). 3.3. Мутация в положении 146 TERT-промотора также может возникать как следствие ингибирования действия UNG в условиях образования G4 при дезаминировании цитозина в C-богатой цепи, и последующем снижении эффективности работы АРЕ1 в этой позиции. 3.4.Наличие G-квадруплексов и нуклеотидное окружение oxoG влияют на эффективность функционирования фермента OGG1. OGG1 в большинстве случаев неактивен в отношении одноцепочечных G4-структур ДНК. 8-оксогуанин удаляется OGG1 по одинаковому принципу для всех G-трактов, а именно средние положения G в составе GGG репарируются хуже, чем боковые. 3.5. На примере фрагментов С-богатой цепи промотора гена TERT с заменой С на oC или oU было показано, что NEIL1 и NEIL2 успешно удаляют окислительные повреждения, причем формирование i-мотива в ДНК отрицательно влияет на активность NEIL1, тогда как NEIL2, наоборот, более эффективно репарирует повреждения в ДНК, содержащей i-мотив, по сравнению с контрольной одноцепочечной ДНК. Полученные данные свидетельствуют в пользу того, что закрепление мутаций в промоторе гена TERT может быть результатом снижения эффективности работы APE1, OGG1, UNG и NEIL1 из-за образования и стабилизации G4-структур. 4. Впервые продемонстрировано специфическое связывание основных факторов системы репарации нуклеотидов: фактора, состоящего из белка группы комплементации С пигментной ксеродермы и гомолога B белка RAD23 (XPC-RAD23B) и белка группы комплементации А пигментной ксеродермы (XPA), с ДНК, содержащими параллельный G-квадруплекс. Можно предположить, что G-квадруплекс узнается белками NER как объёмное повреждение ДНК или как сложная разветвленная ДНК-структура. Также нельзя исключить, что XPA и XPC-RAD23B специфически узнают G-квадруплекс как регуляторный элемент промоторной области и могут принимать участие в транскрипции.