Аннотация результатов, полученных в 2021 году
Оптимизированы методики регистрации и обработки локализованных 1Н МР спектров мозга человека для разделения сигналов NAA и NAAG, Glu и Gln. Измерены абсолютные концентрации NAA и NAAG, Glu и Asp в зрительной коре мозга человека в покое и в периоде видеостимуляции. Установлено, что непрерывная видеостимуляция вызывает статистически достоверное повышение [Glu] и снижение [Asp], не оказывая воздействия на [NAA] и [NAAG]. Полученные данные позволяют заключить, что при непрерывной видеостимуляции основным путем синтеза NAA в активированной зрительной коре является ацетилирование Asp; гидролиз NAAG, будучи минорным путем синтеза NAA, не активируется. Исследовано влияние необратимого ингибитора PGH-синтазы ацетилсалициловой кислоты (аспирин) на интенсивность BOLD-сигнала в мозге человека при непрерывной зрительной стимуляции. Выявлены церебральные локусы, в которых BOLD статистически достоверно снижается при повторной видеостимуляции. Обнаружено, что повторное возбуждение и использование аспирина как ингибитора синтеза простагландинов не влияет на уровень BOLD-сигнала в зрительной коре. Обнаружено снижение гемодинамического ответа на зрительную стимуляцию в области таламуса под действием аспирина. Результаты работы опубликованы в статье: Manzhurtsev A.V., Menschchikov P.E., Yakovlev A.N., Ublinskiy M.V., Bozhko O.V., Kupriyanov D.A., Akhadov T.A., Varfolomeev S.D., Semenova N.A. 3T MEGA‑PRESS study of N‑acetyl aspartyl glutamate and N‑acetylaspartate in activated visual cortex, Magnetic Resonance Materials in Physics, Biology and Medicine (издательство: Springer, Q2, IF=1,832), 2021, 34, 555–568. https://link.springer.com/article/10.1007/s10334-021-00912-5 Построена кинетическая модель динамики многомаршрутного механизма нейроваскулярного сопряжения, индуцированного нервным импульсом. В рамках предложенной модели показано, что расчетные кривые “нейронального” и “метаболического” ответов системы хорошо описывают “классическое” соотношение динамических ответов на нейрональной и биохимической стадиях. Проведено сопоставление результатов расчета математической модели с экспериментальными данными по изменению BOLD сигнала при сенсорномоторном и визуальном возбуждении до и после применения нестероидного противовоспалительного препарата – индометацина. На основе предложенной модели показано влияние каталитической активности ключевых ферментов (фосфолипаза A2, NO-синтаза, PGH2-синтаза, 20-HETE-синтаза) на динамику нейроваскулярного ответа. Многомаршрутность биохимических реакций обеспечивает устойчивость нейроваскулярного сопряжения при различных возможных каталитических активностях ключевых ферментов процесса. Результаты работы опубликованы в статье: Varfolomeev S.D., Bykov V.I., Semenova N.A., Tsybenova S.B. Dynamics of the Multipathway Regulation of the Vasodilator Bold Effect Induced by a Nerve Impulse: A Kinetic Model of the Neurovascular Coupling Process, ACS Chemical Neuroscience (издательство: American Chemical Society, Q1, IF=4,418), 2021, 12, 2202–2208. https://pubs.acs.org/doi/10.1021/acschemneuro.1c00214 Построены молекулярные модели фермента человека глутаматкарбоксипептидазы II (GCPII) - участника полиферментной цепи N-ацетиласпартата (NAA) и установлены механизмы элементарных стадий химических реакций гидролиза пептидной связи N-ацетил-L-аспартил-L-глутамата (NAAG) до N-ацетил-L-аспартил-L-аспартата и глутамата в активном центре фермента. Структуры модельных систем построены методами молекулярной механики (ММ), молекулярной динамики (МД), квантовой механики/молекулярной механики (КМ/ММ) на основе структуры PDB ID: 3BXM из базы данных PDB (Protein Data Bank). Средствами молекулярного моделирования была восстановлена структура фермент-субстратного комплекса активного состояния фермента, определены координаты реакций на всех элементарных стадиях и методом молекулярной динамики с потенциалами КМ/ММ (КМ/ММ МД) рассчитаны профили энергии Гиббса для температуры 300 К. Согласно результатам расчетов, механизм реакции состоит из четырех элементарных стадий, барьеры на профилях энергии Гиббса которых не превосходят 7 ккал/моль. Первая стадия реакции - нуклеофильная атака гидроксид-аниона на карбонильный атом углерода NAAG в сочетании с переносом протона от гидроксида к каталитической аминокислоте Glu424, была детально проанализирована как для фермента дикого типа, так и для белков с точечными заменами E424Q и Y552I. Расчеты полностью воспроизводят экспериментальные данные по снижению скорости ферментативной реакции в мутированном белке. По результатам анализа распределения электронной плотности в фермент-субстратных комплексах дана интерпретация наблюдаемых изменений кинетических констант в полиморфных вариантах фермента. Результаты работы опубликованы в статье: Krivitskaya A.V., Khrenova M.G., Nemukhin A.V. «Two Sides of Quantum-Based Modeling of Enzyme-Catalyzed Reactions: Mechanistic and Electronic Structure Aspects of the Hydrolysis by Glutamate», Molecules (издательство MDPI, Q1, IF=4,411), 2021, 20 (26), 6280; DOI: 10.3390/molecules26206280 (опубликовано: October 17, 2021). https://www.mdpi.com/1420-3049/26/20/6280

Аннотация результатов, полученных в 2022 году
Проект направлен на выяснение фундаментальных основ функционирования биохимических систем мозга человека, прежде всего, на исследование молекулярных механизмов действия ряда ключевых систем и ферментов, включая ферменты N-ацетиласпартатной цепи. Особенностью проекта является комплементарное сочетание экспериментальных исследований нейронной сети мозга человека in vivo, суперкомпьютерное моделирование молекулярных структур и аспектов каталитического действия ферментов, осуществляющих химические реакции, и моделирование поведения компонентов цепи методами химической кинетики. В полном соответствии с планом на 2022 год выполнены следующие работы. 1) Исследования динамики уровня глутамата и глутамина в затылочной коре мозга человека в периоде зависящего от уровня оксигенации крови BOLD-ответа (BOLD: blood oxygen level dependent) на короткую зрительную стимуляцию методом функциональной магнитно-резонансной спектроскопии. Одной из задач данного этапа было измерение концентрации глутамина в динамике BOLD-ответа, косвенно отражающего нейронную активность, на короткий стимул на временном интервале, соответствующем везикулярному циклу. До настоящей работы процесс заполнения везикул in vivo на промежутке времени цикла синаптической везикулы при активации не исследовался. Все данные получены на МРТ-сканере 3Т Phillips Achieva dStream (Philips Health Care) с использованием 20-канальной приемной головной катушки SENSE HeadNeck coil, совместимой с зеркалом. Презентацию стимула и контроль внимания осуществляли при помощи системы InVivo SensaVue, позволяющей точно настраивать временные характеристики применяемого стимула. Спектры обрабатывали с набором априорных данных, состоящих из 17 метаболитов: аланин, аспартат, креатин (Cr), фосфокреатин, γ-аминомасляная кислота, Glc, Gln, Glu, глицерофосфохолин, фосфохолин, глутатион, миоинозитол, Lac, NAA, N-ацетиласпартатглутамат, сциллоинозитол, таурин. Результаты показывают, что суммарный уровень глутамата и глутамина в затылочной коре мозга человека в периоде зависящего от уровня оксигенации крови ответа на короткую зрительную стимуляцию статистически достоверно увеличивается на первой и пятнадцатой секундах после стимуляции. Изменения суммарного уровня глутамата и глутамина во времени после стимула не соответствуют скорости оборота глутамин-глутаматного цикла, но согласуются с временными характеристиками везикулярного цикла: высвобождением глутамина из везикул и его обратным захватом. Таким образом, обнаруженная динамика глутамата и глутамина обусловлена не метаболическими превращениями в цикле нейромедиаторов, а изменением подвижности глутамина при выходе из везикул и при обратной упаковке. Подтверждаются результаты исследований первого этапа проекта, что видеостимуляция, вызывая статистически достоверное повышение концентрации глутамата, не оказывает воздействия на концентрации NAA и NAAG. Это означает, что при видеостимуляции гидролиз NAAG не активируется. Биофизика, 2022, Т. 67, №2, С. 343-353; DOI: 10.31857/S000630292202017X. 2) Впервые построена и исследована кинетическая модель функционирования глутаматного возбуждающего синапса с глутаматом и N-ацетиласпартилглутаматом (NAAG) в качестве нейромедиаторов в трёхкомпонентной системе с учётом нейроглиальных астроцитарных клеток и фермента глутаматкарбоксипептидазы (GCPII). В рамках моделирования показан двухфазный характер процесса, обеспечивающего усиление возбуждения. Исследована роль интенсивности возбуждающего синапса, показана роль NAAG в усилении связности нейронов и реализации когнитивной функции. Изучен механизм управления когнитивностью посредством влияния на эффективность функционирования метаботропных рецепторов mGluR3. Рассмотрена роль ингибирования GCPII как метода улучшения когнитивных функций. В рамках развития кинетической модели анализируются динамические особенности поведения глутаматергической системы при нейродегенеративных заболеваниях (болезнь Альцгеймера, болезнь Хантингтона, деменция), при шизофрении, черепно-мозговой травме, эпилепсии. Показана положительная роль ингибирования GCPII с повышением уровня NAAG как эффективного подхода к терапии нейропатологий. Развита кинетическая схема нейроваскулярного сопряжения с учетом многомаршрутных путей вазодилатационного процесса и математическая модель динамики BOLD-эффектов при внешней нейроактивации мозга человека. По результатам исследования этой модели продемонстрирован двухфазный характер гемодинамического отклика. Важным результатом кинетического моделирования является вывод о том, что как совместное влияние арахидоновой кислоты и NO (отрицательная обратная связь), так и каждый из реагентов в отдельности при включении в уравнение скорости Ca2+ приводит к появлению бифазности в развитии BOLD-сигнала. Показано, что ингаляция термогелиокса стимулирует и пролонгирует гемодинамические импульсы. Chemical Physics Letters, 2022, 794, 139485; DOI: 10.1016/j.cplett.2022.139485, Russian Chemical Bulletin, 2022, 71, № 3, 591-594; DOI: 10.1007/s11172-022-3455-9, Вестн. Моск. ун-та. Сер.2. Химия, 2022, 63, 48–54. DOI: 10.3103/S0027131422010072. 3) Методами компьютерного моделирования на основе только лишь первичной последовательности аминокислотных остатков впервые построена полноатомная трехмерная структура фермента N-ацетиласпартилглутаматсинтазы, содержащая в активном центре интермедиаты реакции синтеза NAAG из NAA и Glu. Начальный набор координат атомов апо-формы белка был получен с сервера AlphaFold2, дальнейшие действия проводились методами молекулярной механики и молекулярной динамики – в структуру были добавлены молекулярные группы, необходимые для конструирования начальной точки моделирования - ацетилфосфатного интермедиата реакции (аденозиндифосфат (ADP), ацилфосфат NAA-PO3, ионы магния и молекулы воды). После сольватирования модель содержала почти 40 тысяч атомов. После релаксации системы вдоль траекторий классической молекулярной динамики, рассчитанных по программе NAMD, была восстановлена структура фермента с реактантами. Анализ структуры ацетилфосфатного интермедиата является ключевым для понимания механизма ферментативной реакции. Для этого анализа были выполнены расчеты методами молекулярной динамики с потенциалами квантовой механики/молекулярной механики (КМ/ММ МД). Квантовая подсистема включала 135 атомов (NAA-PO3, фрагмент ADP, ионы магния, молекулярные группы аминокислотных остатков Arg160, Arg201, Arg215, Glu273, Asp260, Asn275 и молекулы воды), описываемых в приближении DFT(PBE0)-D3/6-31G**. Молекулярно-механическая подсистема описывалась силовым полем CHARMM36. Для расчетов использовался интерфейс программы квантовой химии TeraChem и программы молекулярной динамики NAMD. Сделан вывод, механизм ферментативной реакции должен следовать сценарию субстрат-ассистирующего катализа. Supercomputing Frontiers and Innovations, 2022, 9, №2, 4-13; DOI: 10.14529/jsfi220201. Методом КМ/ММ МД рассчитаны профили энергии Гиббса для всех элементарных стадий реакции синтеза N-ацетиласпартата (NAA) в активном центре фермента аспартат-N-ацетилтрансферазы. Использовался интерфейс программы квантовой химии TeraChem (DFT(PBE0)-D3/6-31G**) и программы молекулярной динамики NAMD (силовое поле CHARMM36). Учитывалась как часть системы (с активным центром фермента), находящаяся в окружении сольватных оболочек молекул воды, так и часть, внедренная в липидный бислой, моделирующий мембрану. Результаты расчетов показывают, что скорость-лимитирующая стадия относится к образованию тетраэдрического интермедиата реакции с энергией активации не превышающей 14 ккал/моль. Mendeleev Communications, 2022, 32, 739-741; DOI: 10.1016/j.mencom.2022.11.010