Аннотация результатов, полученных в 2021 году
На 1-ом этапе выполнения проекта были разработаны оригинальные химические методики синтеза монодисперсных наночастиц сложных ферритов, а именно наночастиц магнетита Fe3O4, феррита кобальта CoFe2O4, марганца MnFe2O4 и цинка ZnFe2O4, имеющих отчетливо выраженную сферическую, кубическую и стержневую форму и находящихся в диапазоне размеров 8 – 37 нм. Для получения монодисперсных наночастиц применялись два основных химических метода: 1) термическое разложение металлосодержащих прекурсоров и 2) золь-гель метод. Форма наночастиц варьировалась путем изменения типа поверхностно-активных веществ, использованных в реакции, тогда как размер наночастиц и их полидисперсность контролировались концентрацией прекурсоров и скоростью нагрева реакционной смеси. Было установлено, что олеиновая кислота способствует формированию наночастиц сферической морфологии, олеиламин – кубической морфологии, а полиэтиленимин – стержневидной морфологии. Было показано, что получение сферических наночастиц с размером ядра более 20 нм, в отличие от наночастиц другой формы, сильно затруднено, что объясняется строением кристаллической решетки ферритов. Полученные образцы были охарактеризованы просвечивающей электронной микроскопией с целью выявления влияния реакционных параметров на размер и форму получаемых наночастиц, рентгеноструктурным анализом и мёссбауэровской спектроскопией для доказательства образования желаемой фазы, вычисления размера кристаллита и параметра решетки, атомно-эмиссионной спектроскопией для установления точного элементного состава, а также магнитометрией с целью определения основных магнитных характеристик, таких как удельная намагниченность насыщения, остаточная удельная намагниченность и коэрцитивная сила. Агрегативная устойчивость наночастиц в различных средах была изучена методом динамического светорассеяния. Результаты рентгеноструктурного анализа свидетельствовали о том, что данный метод не позволяет выявить достоверные различия в значениях параметра решетки фазы для наночастиц сложных ферритов. Использование для этих целей мёссбауэровской спектроскопии в сочетании с атомно-эмиссионной спектроскопией позволило точно определить тип образующейся фазы. Данные магнитометрии свидетельствовали о крайне высоких значениях удельной намагниченности насыщения для всех типов наночастиц, сопоставимых со значениями для объемных материалов (JS = 90 А·м2·кг-1). При этом значения остаточной намагниченности и коэрцитивной силы кардинальным образом зависели как от типа фазы, так и от морфологии наночастиц, что согласуется с известными литературными данными. Наночастицы феррита кобальта имели ферромагнитную природу и значения коэрцитивной силы вплоть до 2 кЭ, что является предпочтительным для экспериментов по магнито-механике. В результате, были выбраны наиболее перспективные образцы наночастиц одной фазы, имеющие схожий размер (14 – 18 нм), но различную форму. Исследование гидродинамических параметров коллоидов наночастиц методом динамического светорассеяния (ДСР) продемонстрировало, что такой метод имеет существенные ограничения для многокомпонентных растворов, что необходимо учитывать при описании экспериментальных результатов, в основе которых лежат данные о гидродинамическом размере наночастиц и их коэффициенте диффузии. Исследования, проведенные с помощью мёссбауэровской спектроскопии для 9 нм наночастиц феррита кобальта, функционализированных цитрат-ионами и помещенных в водные растворы бычьего сывороточного альбумина (БСА), свидетельствуют о том, что молекулы БСА формируют монослой (~ 2 нм) на поверхности наночастиц, тогда как метод ДСР приводит к значительному завышению гидродинамического размера, что по ошибке может трактоваться как образование агрегатов. Результаты исследования отражены в научной публикации (https://pubs.acs.org/doi/full/10.1021/acs.jpclett.1c01984).

Аннотация результатов, полученных в 2022 году
В рамках выполнения гранта были синтезированы одноцепоченые олигонуклеотиды с длиной от 14 до 60 нуклеотидов с содержанием GC от 30 до 50 %, а также комплементарный им нуклеотид с длиной 60 нуклеотидов и модифицированный флуоресцентным красителем Cy5. Такой флуоресцентный олигонуклеотид был ковалентно закреплен на поверхности магнитных наночастиц, полученных на первом этапе, с помощью органических линкеров и карбодиимидной химии. В свою очередь, олигонуклеотиды с длиной 14-60 нуклеотидов были закреплены ковалентно на поверхности стеклянной подложки. После этого наночастицы с закрепленным на их поверхности флуоресцентным олигонуклеотидом гибридизовали с олигонуклеотидами закрепленными на подложке. Полученные олигонуклеотидные -дуплексы визуализировали при помощи конфокального сканера, а успешную гибридизацию оценивали по интенсивности флуоресцентного сигнала в местах закрепления дуплексов на подложке. Кроме того была проведена комплексная оценка стабильности полученных конъюгатов наночастиц, а также полученных дуплексов на их основе, во времени в солевых буферах, в которых на 3-ем этапе, будут проведены эксперименты по магнитно-механике. Помимо этого, были получены монодисперсные наночастицы магнетита Fe3O4, кобальтового феррита СoFe2О4, марганцевого феррита MnFe2О4 и цинкового феррита ZnFe2О4, модифицированные 3,4 дигидроксифенилуксусной кислотой. Введение дополнительной стадии модификации поверхности МНЧ молекулами поли(этиленгликоль)2-аминоэтиловый эфиром уксусной кислоты позволило увеличить агрегативную устойчивость полученных наночастиц в натрий-фосфатном буфере (PBS), что позволило закрепить на их поверхности моноклональные антитела. Разработанные нанозонды в состав которых входят наночастицы сложных оксидов железа способны специфично визуализировать распределение белка α-тубулина, виментина и β-катенина на клетках 4T1 мыши и мезенхимальных стволовых клетках человека. Все образцы были охарактеризованы комплексом современных физико-химических методов анализа, таких как просвечивающая электронная микроскопия, ИК-спектроскопия, флуоресцентная и конфокальная микроскопия, метод динамического светорассеяния, атомно-эмиссионная спектроскопия.

Аннотация результатов, полученных в 2023 году
На 3-ем этапе выполнения проекта в Блоке №1 проводились детальные исследования процесса механической диссоциации полученных на 2-ом этапе работ олигонуклеотидных дуплексов в зависимости от параметров МНЧ, а также параметров низкочастотных переменных магнитных полей. Было показано, что степень диссоциации дуплексов зависит как от частоты и амплитуды переменного магнитного поля, так и от параметров МНЧ. При этом, в ряду кубических МНЧ разного размера от 5 до 99 нм было показано, что наибольшая магнитомеханическая эффективность достигается для наночастиц, у которых размер немагнитной функциональной оболочки, одинаковый для всех МНЧ и составляющий 5 нм, сопоставим с размером ее магнитного ядра. Таким образом, наиболее эффективными в диссоциации дуплексов оказались кубические МНЧ с размером 14 нм. Кроме того, вопреки теоретическим предсказаниям, в ряду МНЧ одинакового размера (14 – 18 нм), но разной формы (кубы, сферы, стержни) достоверного отличия в степени диссоциации дуплексов не наблюдалось, в том числе, не было выявлено достоверного отличия в наибольшей эффективности стержневых наночастиц в магнитомеханических экспериментах. С помощью моделирования на основе экспериментальных данных нами было показано, что опосредованный МНЧ магнитомеханический эффект не является монотонной функцией размера магнитного ядра таких наночастиц. Было выявлено, что важными параметрами, влияющими на эффективность магнитомеханического воздействия являются суперпарамагнитное состояние МНЧ и величина энергии магнито-дипольного взаимодействия между МНЧ, которая во многом зависит как от размера магнитного ядра самих МНЧ, так и от размера немагнитной функциональной оболочки на их поверхности. На 3-ем этапе выполнения проекта в Блоке №2 были исследованы наночастицы Fe3O4, MnFe2O4, CoFe2O4, ZnFe2O4, конъюгированные с моноклональными антителами на предыдущем этапе. Результаты иммунофлуоресцентного анализа дополнительно проведенного на клетках рака предстательной железы PC3 показали высокую специфичность связывания с компонентом клеточного цитоскелета белком микротрубочек α-тубулина, с многофункциональным белком межклеточных контактов β-катенином, с основными компонентами клетки: ядром и митохондриями. Высокую эффективность визуализации продемонстрировали при проведении двойного иммунофлуоресцентного анализа нанозонды на основе наночастиц Fe3O4, MnFe2O4, CoFe2O4, ZnFe2O4 последовательно конъюгированные c флуоресцентным красителем Cy5 и флуоресцентномеченными моноклональными антителами флуоресцентным красителем Alexa488. Методом просвечивающей электронной микроскопии в светлом поле, были задетектированы электроноплотные наночастицы сложных ферритов, которые были локализованы в митохондрии в виде единичных наночастиц, либо в виде наночастиц, собранных в небольшие группы. Сканирующей электронной микроскопией была детально изучена морфология и состав синтезированных нанозондов. Исследование ультратонких срезов клеток PC3 c локализованным внутри митохондрии нанозондом на основе CoFe2O4 методом сканирующей электронной микроскопии показало, что наночастицы CoFe2O4 сохраняют свою исходную морфологию и, по-видимому, в виду инертности самих частиц, практически не претерпевают изменений в биологическом окружении и в процессе пробоподготовки. Энергодисперсионный анализ исследуемого нанозонда показал, что наночастицам, локализованным в митохондрии, соответствуют интенсивные характеристические сигналы Со и Fe, соответствующие энергодисперсионным сигналам, вдоль участков, содержащих наночастицы СoFe2O4. Согласно количественному элементному анализу, усредненное значение Сo:Fe составляет 34±5:66±5 атомных процентов и близко к стехиометрическому 1:2.