Аннотация результатов, полученных в 2020 году
В настоящее время в России существует необходимость в получении качественно новых отечественных линий кур, обладающих заданными хозяйственно-полезными признаками. Для получения птиц с повышенным уровнем продуктивности необходим синтез методов работы с культурами клеток и современных наработок в области геномного редактирования и молекулярной генетики. Целью проекта являются научные разработки технологических подходов получения, культивирования и трансформации созданными векторами с системой CRISPR/Cas9 примордиальных половых клеток (PGCs) и их последующей трансплантации в эмбрионы кур с целью нокаутирования целевых генов для получения линии кур с заданными показателями продуктивности. В 2021 год нами был выполнен ряд задач, решение которых направлено на достижение конечной цели проекта. 1. Подобрана опытная группа кур и петухов пушкинской породы в половом соотношении 1♂:6♀. Оценен экстерьерный профиль выборки. Отобран биологический материал (кровь), выделена геномная ДНК. 2. На основании информации международной базы генетических данных NCBI (https://www.ncbi.nlm.nih.gov) проведен дизайн праймеров для секвенирования участков генов MSTN и G0S2 при помощи компьютерной программы BLAST (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi). 3. Получены сиквенсы первичной последовательности целевых участков генов MSTN и G0S2 специфичные для экспериментальной выборки кур на генетическом анализаторе Applied Biosystems 3500. 4. Выявлены все потенциальные сайты для модификации системой CRISPR/Cas9 в последовательностях целевых генов MSTN и G0S2, рассчитана эффективность предполагаемой модификации (в зависимости от нуклеотидного состава направляющей РНК). Определены неспецифические сайты связывания (off-target), их количество и позиции в исследуемых участках генов. Проведен анализ рейтинга (score) для каждой направляющей РНК, показывающего количество потенциальных неспецифических сайтов. 5. Для решения задач проекта на базе ВНИИГРЖ в лаборатории молекулярной биологии был создан стерильный бокс для работы с культурой первичных половых клеток кур (PGCs). 6. Разработаны технологические подходы получения первичных половых клеток из куриных эмбрионов. 7. Экспериментальным путем определено оптимальное время и способ взятия PGCs кур (3-4 сутки инкубации из дорсальной аорты эмбрионов (стадия Hamburger Hamilton 14)). 8. По результатам комплексных исследований установлено положительное влияние на пролиферацию и рост PGCs клеток базовой среды KnockOut DMEM/F-12, без L-глутамина (Gibco, Thermo Fisher) с добавлением следующих компонентов в расчет на 500 мл среды (натрия пируват 1М (Applichem), нуклеозиды Embryo Max Nucleosides 100X (Millipore) - 2,5 мл, Human Activin A Recombinant Protein (Gibco, Thermo Fisher) - 25 нг/мкл, Human FGF-basic (FGF-2/bFGF) Recombinant Protein (Gibco, Thermo Fisher) – 10 нг/мкл, Chicken Serum (Gibco, Thermo Fisher) – 2%, 2-меркаптоэтанол (NF, VWR) - 3,9 мкл), антибиотик-антимикотик (Thermo Fisher) до 1Х. 9. Оценена пролиферация и морфология клеток на инвертированном микроскопе Olympus (модель: AHMT, Япония) с использованием программы TOP WIEW при увеличении х400. Подсчет клеток проводился с помощью камеры Горяева с использованием ПО (TOP WIEW). Клетки готовы к дальнейшим модификациям на 21 день культивирования.

Аннотация результатов, полученных в 2021 году
В результате работ по проекту в 2021-2022 гг. Были получены следующие результаты: 1. Создана генетическая конструкция на основе вектора pX330 (Addgene #442230) для нокаута гена MSTN в PGC кур пушкинской породы. Успешно клонированные плазмидные конструкции использовали для трансфекции полученных из 4-5 дневных эмбрионов кур пушкинской породы примордиальных половых клеток (PGC). Поскольку плазмида pX330 не имеет в своем составе репортерного гена GFP, то было принято решение использовать совместно с плазмидой pX330 плазмиду pEGFP-C1 (ООО «Биотехнология») для идентификации трансфицированных клеток с помощью детектирующего флуоресценцию микроскопа. Трансфекцию PGC плазмидными конструкциями проводили методом электропорации, используя Neon™ Transfection System («Invitrogen», США) Контроль флуоресценции в трансфицированных PGC клетках осуществлялся визуально на инвертированном микроскопе Olympus (модель: AHMT, Япония) на 3-4 день культивирования с использованием программы TOP VIEW при увеличении ×400 (объектив х40, окуляр х10). Трансфицированные клетки вводились в дорсальную аорту 5-дневных эмбрионов кур с помощью микроманипулятора Narishigi (Япония) иглой диаметром 30 мкм. Яйца после проведения микроинъекции отправляли на инкубацию при стандартных условиях температуры и влажности. Было проинъецировано 6 эмбрионов кур, из которых выжили 2 петуха и 2 курицы. По достижении половозрелого возраста у птицы (6 месяцев), для выделения геномной ДНК, взяли сперму у петухов и бластодиск из неоплодотворенных яиц кур. Выделенная ДНК была использована для ПЦР-амплификации локуса гена MSTN, содержащего целевые участки под выбранные нами гРНК (гидовая РНК). Полученные ПЦР продукты проанализировали с помощью секвенирования по Сэнгеру. В проанализированных образцах ДНК кур и петухов, прошедших на стадии эмбриона процедуру микроинъекции трансфицированными PGC пушкинской породы не выявлено изменений в нуклеотидной последовательности в исследуемом участке гена MSTN. 2. Создана генетическая конструкция на основе вектора pX458 (Addgene #48138) для нокаута гена MSTN и G0S2 в PGC кур пушкинской породы. Полученные культуры PGC кур пушкинской породы использовали для трансфекции созданными конструкциями для нокаута генов MSTN и G0S2. Систему редактирования вводили в PGC методом биобаллистической трансформации, используя генную пушку PDS-1000/HE SYSTEM (BIO-RAD, США). Трансфицированные клетки отбирали с помощью высокопроизводительного клеточного сортера S3e Cell Sorter (BIO-RAD, США). Согласно распределению клеток по интенсивности флуоресценции, эффективность трансфекции PGC посредством системы редактирования для нокаута генов MSTN и G0S2 составила 2,61 %. Трансфицированные PGC кур, отсортированные на сортере, использовали для выделения геномной ДНК с целью оценки эффективности редактирования генов MSTN и G0S2. 3. Этап создания системы редактирование генома на основе вектора FokI-dCas9, (Addgene #85756) для нокаута гена MSTN и G0S2 в PGC кур русской белой породы. В результате исследований в 2020-2021 гг. выявлено, что эмбрионы кур русской белой породы, более устойчивы к разного рода манипуляциям. И выживаемость у них выше на 50%. Мы ввели в 2021-2022 гг. в качестве экспериментального объекта в работу кур русской белой породы. Однако, гРНК подобранные для внесения изменений в целевой локус гена MSTN кур пушкинской породы оказались неподходящими, поскольку в результате секвенирования было выявлено два однонкулеотидных различия в пределах первых восьми ключевых нуклеотидов гРНК, специфичных для русской белой породы кур. Таким образом с помощью онлайн-инструмента CRISPOR (crispor.tefor.net) дополнительно был проведен дизайн направляющих последовательностей для внесения целевых модификаций в гены MSTN и G0S2 русской белой породы кур. 4. Получены данные экспрессии специфических эмбриональных генов развития, в том числе и транскрипционных факторов, подтверждающих присутствие PGC и развитие их в культуральной среде. Несмотря на то, что обработка бусульфаном по нескольким источникам должна вызывать повреждение ДНК в клетках-мишенях, что приводит к выключению всех клеточных механизмов и разрушению клеток, что должно останавливать рост PGC, уровни экспрессии специфических генов оставались достаточно высокими, особенно по гену PRDM1 и PIWIL2, DAZL1, но ниже чем у необработанных PGC, что может быть интерпретировано, как недостаточная концентрация или недостаточно длительное воздействие бусульфана на культуру клеток PGC. Данное явление требует дополнительных исcледований, поскольку противоречит общеизвестным данным. Следить за результатами по проекту можно в https://www.instagram.com/crispr_chicken/.

Аннотация результатов, полученных в 2022 году
В процессе выполнения исследований по проекту в 2022-2023 гг. Были получены следующие результаты: 1. Проведена оценка эффективности редактирования генетической конструкцией на основе плазмиды рX458 генов MSTN и G0S2 в ПЗК кур пушкинской породы. 2. Для высокоспецифичного редактирования генома кур русской белой и пушкинской пород создана генетическая конструкция на основе плазмиды FokI-dCas9 (#85756 - pSH-Csy4-T2A-SpRFN-P2A-GFP-multi-gRNA). Выделенные плазмидные ДНК проанализированы с помощью секвенирования по Сэнгеру. Анализ сиквенсов подтвердил наличие ожидаемых вставок гРНК к гену G0S2 в мультиплекном экспрессионном векторе FokI-dCas9. Сравнительный анализ последовательностей произведён с помощью программного обеспечения Vector NTI Advance 11.5.4. 3. Создана генетическая конструкция на основе плазмиды pX-458-2sgRNA. Анализ результатов лигирования направляющих последовательностей к гену MSTN по двум экспериментальным породам кур (пушкинская и русская белая) в плазмидную конструкцию проводили с помощью секвенирования по Сенгеру. Выравнивание сиквенсов производилось с помощью программного обеспечения MEGA (Version 11.0.13). Сравнительный анализ показал наличие искомых вставок для нокаута гена MSTN в экспериментальных породах кур. 4. Проведена серия экспериментов по введению в аорту эмбрионов-реципиентов кур экспериментальных популяций трансфицированных ПЗК. Было проинъецировано 20 эмбрионов кур (10 русской белой породы и 10 пушкинской породы), из которых выжили 2 петуха русской белой породы и 4 курицы (по 2 особи экспериментальных популяций кур). 5. Доказана эффективность использования бусульфана для элиминации нативных ПЗК в гонадах эмбрионов кур. Оптимальным количеством препарата можно считать 100 мкг на эмбрион. 6. Доказана эффективность трансфекции генетической конструкцией на основе вектора FokI-dCas9 с использованием метода биобаллистической трансформации. Трансфицированных клеток больше на 13,52% в фибробластах и на 12,25% в ПЗК кур русской белой породы, чем с использованием метода липофекции с реагентом Lipofectamine 3000. С учетом эффективности трансфекции при использовании в работе по проекту различных генетических конструкций, наиболее эффективным вариантом является конструкция на основе коммерческого вектора FokI-dCas9 с двумя гРНК.