КАРТОЧКА ПРОЕКТА,
ПОДДЕРЖАННОГО РОССИЙСКИМ НАУЧНЫМ ФОНДОМ

Информация подготовлена на основании данных из Информационно-аналитической системы РНФ, содержательная часть представлена в авторской редакции. Все права принадлежат авторам, использование или перепечатка материалов допустима только с предварительного согласия авторов.

 

ОБЩИЕ СВЕДЕНИЯ


Номер 20-76-10006

НазваниеРазработка технологических подходов для получения высокопродуктивных линий кур с помощью редактирования генома системой CRISPR/Cas9

РуководительЛАРКИНА ТАТЬЯНА АЛЕКСАНДРОВНА, Кандидат биологических наук

Организация финансирования, регионФедеральное государственное бюджетное научное учреждение "Федеральный исследовательский центр животноводства - ВИЖ имени академика Л.К. Эрнста", Московская обл

Срок выполнения при поддержке РНФ 07.2020 - 06.2023 

КонкурсКонкурс 2020 года «Проведение исследований научными группами под руководством молодых ученых» Президентской программы исследовательских проектов, реализуемых ведущими учеными, в том числе молодыми учеными

Область знания, основной код классификатора 06 - Сельскохозяйственные науки, 06-204 - Животноводство

Ключевые словаРедактирование генома, CRISPR/Cas9, курица, мясная продуктивность, примордиальные половые клетки, эмбрионы.

Код ГРНТИ68.39.37


 

ИНФОРМАЦИЯ ИЗ ЗАЯВКИ


Аннотация
Актуальность определяется важностью задачи для отрасли птицеводства, которая заключается в создании отечественных линий кур с высокой мясной продуктивностью и пониженном содержанием абдоминального жира в тушке. В эпоху геномных и постгеномных технологий активно развиваются биотехнологические методы, позволяющие манипулировать с ДНК в геномах продуктивных животных. Тем не менее, далеко не все методы отвечают высоким требованиям к их эффективности, безопасности и доступности для широкого круга исследователей. Появившиеся относительно недавно система CRISP/Cas9 уже зарекомендовала себя как эффективный и надежный инструмент геномной инженерии. В результате стало возможным многократно ускорить создание линий кур с улучшенными продуктивными признаками, устойчивыми к заболеваниям и отличающихся повышенной жизнеспособностью. Особенности воспроизводства и развития кур делают технологически практически невозможным использование традиционного метода введения плазмидных конструкций с системой CRISP/Cas9 в зиготу особи — микроинъекции, что требует поиска альтернативных способов введения генетических конструкций для редактирования. К числу таких методических подходов относится метод связанный с использованием примордиальных половых клеток (PGCs) - предшественников дифференцированных половых клеток в качестве клеток мишеней для введения плазмидной конструкции с системой CRISP/Cas9. В настоящее время в России существует острая необходимость в получении качественно новых отечественных линий кур обладающих заданными хозяйственно-полезными признаками. Для получения таких отредактированных птиц необходим синтез методов работы с культурами клеток и современных наработок в области геномного редактирования. Необходима разработка технологических подходов и оптимизация под конкретные задачи существующих методов получения примордиальных половых клеток и внедрение в их культуру плазмидных векторов с системой CRISP/Cas9 для внесения INDEL мутации, что приведет к нокаутированию гена миостатина (MSTN) и корепрессорного белка (G0S2). Создание линий кур пушкинской породы с целевыми изменениями генома, несущими искусственно внесенные маркерные морфологические признаки, такие как, увеличение живой массы и низкое содержание абдоминального жира будет изучено в России впервые. Будут разработаны технологические подходы, оптимизирована система культивирования PGC клеток кур и технология трансплантации генетически модифицированных клеток в бластодерму инкубируемых куриных эмбрионов. В качестве экспериментального объекта будут использоваться куры пушкинской породы Биоресурсной коллекции ВНИИРГЖ «Генетическая коллекция редких и исчезающих пород кур» (Пушкин, Санкт-Петербург).

Ожидаемые результаты
В процессе реализации проекта будут разработаны технологические подходы получения кур с конкретными заданными признаками (повышенная мясная продуктивность, сниженное содержание абдоминального жира) методом редактирования генома, в частности нокаутирования конкретных генов, отвечающих за формирование данных признаков (миостатин MSTN и корепрессорный белок G0S2). Для этого будут решаться следующие задачи: оптимизация технологии отбора, культивирования, трансфекции, постредакционной селекции и пересадки в организм реципиента примордиальных половых клеток, полученных от кур пушкинской породы; будут разработаны и созданы генетические конструкции с системой редактирования CRISP/Cas9 для нокаутирования заявленных в проекте генов; будут разработаны тест-системы для анализа отредактированных локусов заявленных генов для выявления внесенных изменений; будет проведен анализ эффективности работы системы с помощью молекулярно-генетических методов (секвенирование, ПЦР); будет осуществлена трансплантация модифицированных PGC клеток в бластодерму инкубируемых куриных эмбрионов; планируется получить химерных кур с модифицированными половыми клетками, а впоследствии, получить F1, гетерозиготных по редактируемым локусам. Разработанные в результате реализации проекта технологические подходы к редактированию генома кур, а также полученные экспериментальные организмы с нокаутированными заданными генами позволят создать высокопродуктивные отечественные линии и кроссы мясных кур и ориентировать на них промышленное птицеводство. Использование полученных результатов позволит создавать линии высокопродуктивных кур с требуемыми заданными свойствами. Результаты проведенных исследований будут иметь мировое значение. Оригинальность проводимых исследований обеспечит наличие обширной экспериментальной базы Биоресурсной коллекции ВНИИГРЖ «Генетическая коллекция редких и исчезающих пород кур» (Пушкин, Санкт-Петербург). Решение поставленных задач в ходе реализации проекта будет осуществляться на стыке таких научных дисциплин, как молекулярная генетика, эмбриология, биотехнология, биоинформатика с применением соответствующих методик и подходов.


 

ОТЧЁТНЫЕ МАТЕРИАЛЫ


Аннотация результатов, полученных в 2020 году
В настоящее время в России существует необходимость в получении качественно новых отечественных линий кур, обладающих заданными хозяйственно-полезными признаками. Для получения птиц с повышенным уровнем продуктивности необходим синтез методов работы с культурами клеток и современных наработок в области геномного редактирования и молекулярной генетики. Целью проекта являются научные разработки технологических подходов получения, культивирования и трансформации созданными векторами с системой CRISPR/Cas9 примордиальных половых клеток (PGCs) и их последующей трансплантации в эмбрионы кур с целью нокаутирования целевых генов для получения линии кур с заданными показателями продуктивности. В 2021 год нами был выполнен ряд задач, решение которых направлено на достижение конечной цели проекта. 1. Подобрана опытная группа кур и петухов пушкинской породы в половом соотношении 1♂:6♀. Оценен экстерьерный профиль выборки. Отобран биологический материал (кровь), выделена геномная ДНК. 2. На основании информации международной базы генетических данных NCBI (https://www.ncbi.nlm.nih.gov) проведен дизайн праймеров для секвенирования участков генов MSTN и G0S2 при помощи компьютерной программы BLAST (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi). 3. Получены сиквенсы первичной последовательности целевых участков генов MSTN и G0S2 специфичные для экспериментальной выборки кур на генетическом анализаторе Applied Biosystems 3500. 4. Выявлены все потенциальные сайты для модификации системой CRISPR/Cas9 в последовательностях целевых генов MSTN и G0S2, рассчитана эффективность предполагаемой модификации (в зависимости от нуклеотидного состава направляющей РНК). Определены неспецифические сайты связывания (off-target), их количество и позиции в исследуемых участках генов. Проведен анализ рейтинга (score) для каждой направляющей РНК, показывающего количество потенциальных неспецифических сайтов. 5. Для решения задач проекта на базе ВНИИГРЖ в лаборатории молекулярной биологии был создан стерильный бокс для работы с культурой первичных половых клеток кур (PGCs). 6. Разработаны технологические подходы получения первичных половых клеток из куриных эмбрионов. 7. Экспериментальным путем определено оптимальное время и способ взятия PGCs кур (3-4 сутки инкубации из дорсальной аорты эмбрионов (стадия Hamburger Hamilton 14)). 8. По результатам комплексных исследований установлено положительное влияние на пролиферацию и рост PGCs клеток базовой среды KnockOut DMEM/F-12, без L-глутамина (Gibco, Thermo Fisher) с добавлением следующих компонентов в расчет на 500 мл среды (натрия пируват 1М (Applichem), нуклеозиды Embryo Max Nucleosides 100X (Millipore) - 2,5 мл, Human Activin A Recombinant Protein (Gibco, Thermo Fisher) - 25 нг/мкл, Human FGF-basic (FGF-2/bFGF) Recombinant Protein (Gibco, Thermo Fisher) – 10 нг/мкл, Chicken Serum (Gibco, Thermo Fisher) – 2%, 2-меркаптоэтанол (NF, VWR) - 3,9 мкл), антибиотик-антимикотик (Thermo Fisher) до 1Х. 9. Оценена пролиферация и морфология клеток на инвертированном микроскопе Olympus (модель: AHMT, Япония) с использованием программы TOP WIEW при увеличении х400. Подсчет клеток проводился с помощью камеры Горяева с использованием ПО (TOP WIEW). Клетки готовы к дальнейшим модификациям на 21 день культивирования.

 

Публикации

1. - нет нет, - (год публикации - ).


Аннотация результатов, полученных в 2021 году
В результате работ по проекту в 2021-2022 гг. Были получены следующие результаты: 1. Создана генетическая конструкция на основе вектора pX330 (Addgene #442230) для нокаута гена MSTN в PGC кур пушкинской породы. Успешно клонированные плазмидные конструкции использовали для трансфекции полученных из 4-5 дневных эмбрионов кур пушкинской породы примордиальных половых клеток (PGC). Поскольку плазмида pX330 не имеет в своем составе репортерного гена GFP, то было принято решение использовать совместно с плазмидой pX330 плазмиду pEGFP-C1 (ООО «Биотехнология») для идентификации трансфицированных клеток с помощью детектирующего флуоресценцию микроскопа. Трансфекцию PGC плазмидными конструкциями проводили методом электропорации, используя Neon™ Transfection System («Invitrogen», США) Контроль флуоресценции в трансфицированных PGC клетках осуществлялся визуально на инвертированном микроскопе Olympus (модель: AHMT, Япония) на 3-4 день культивирования с использованием программы TOP VIEW при увеличении ×400 (объектив х40, окуляр х10). Трансфицированные клетки вводились в дорсальную аорту 5-дневных эмбрионов кур с помощью микроманипулятора Narishigi (Япония) иглой диаметром 30 мкм. Яйца после проведения микроинъекции отправляли на инкубацию при стандартных условиях температуры и влажности. Было проинъецировано 6 эмбрионов кур, из которых выжили 2 петуха и 2 курицы. По достижении половозрелого возраста у птицы (6 месяцев), для выделения геномной ДНК, взяли сперму у петухов и бластодиск из неоплодотворенных яиц кур. Выделенная ДНК была использована для ПЦР-амплификации локуса гена MSTN, содержащего целевые участки под выбранные нами гРНК (гидовая РНК). Полученные ПЦР продукты проанализировали с помощью секвенирования по Сэнгеру. В проанализированных образцах ДНК кур и петухов, прошедших на стадии эмбриона процедуру микроинъекции трансфицированными PGC пушкинской породы не выявлено изменений в нуклеотидной последовательности в исследуемом участке гена MSTN. 2. Создана генетическая конструкция на основе вектора pX458 (Addgene #48138) для нокаута гена MSTN и G0S2 в PGC кур пушкинской породы. Полученные культуры PGC кур пушкинской породы использовали для трансфекции созданными конструкциями для нокаута генов MSTN и G0S2. Систему редактирования вводили в PGC методом биобаллистической трансформации, используя генную пушку PDS-1000/HE SYSTEM (BIO-RAD, США). Трансфицированные клетки отбирали с помощью высокопроизводительного клеточного сортера S3e Cell Sorter (BIO-RAD, США). Согласно распределению клеток по интенсивности флуоресценции, эффективность трансфекции PGC посредством системы редактирования для нокаута генов MSTN и G0S2 составила 2,61 %. Трансфицированные PGC кур, отсортированные на сортере, использовали для выделения геномной ДНК с целью оценки эффективности редактирования генов MSTN и G0S2. 3. Этап создания системы редактирование генома на основе вектора FokI-dCas9, (Addgene #85756) для нокаута гена MSTN и G0S2 в PGC кур русской белой породы. В результате исследований в 2020-2021 гг. выявлено, что эмбрионы кур русской белой породы, более устойчивы к разного рода манипуляциям. И выживаемость у них выше на 50%. Мы ввели в 2021-2022 гг. в качестве экспериментального объекта в работу кур русской белой породы. Однако, гРНК подобранные для внесения изменений в целевой локус гена MSTN кур пушкинской породы оказались неподходящими, поскольку в результате секвенирования было выявлено два однонкулеотидных различия в пределах первых восьми ключевых нуклеотидов гРНК, специфичных для русской белой породы кур. Таким образом с помощью онлайн-инструмента CRISPOR (crispor.tefor.net) дополнительно был проведен дизайн направляющих последовательностей для внесения целевых модификаций в гены MSTN и G0S2 русской белой породы кур. 4. Получены данные экспрессии специфических эмбриональных генов развития, в том числе и транскрипционных факторов, подтверждающих присутствие PGC и развитие их в культуральной среде. Несмотря на то, что обработка бусульфаном по нескольким источникам должна вызывать повреждение ДНК в клетках-мишенях, что приводит к выключению всех клеточных механизмов и разрушению клеток, что должно останавливать рост PGC, уровни экспрессии специфических генов оставались достаточно высокими, особенно по гену PRDM1 и PIWIL2, DAZL1, но ниже чем у необработанных PGC, что может быть интерпретировано, как недостаточная концентрация или недостаточно длительное воздействие бусульфана на культуру клеток PGC. Данное явление требует дополнительных исcледований, поскольку противоречит общеизвестным данным. Следить за результатами по проекту можно в https://www.instagram.com/crispr_chicken/.

 

Публикации

1. - crispr_chicken Instagram, Посты (год публикации - ).

2. - Видеоотчет с Международной научно-практической конференции «Генетика, селекция, биотехнология: интеграция науки и практики в животноводстве» http://vniigen.ru/, видеоролик (год публикации - ).

3. - Визит учеников детской художественной школы имени И. П. Саутова во ВНИИГРЖ http://vniigen.ru/, Видеоролик (год публикации - ).

4. - Визит учеников детской художественной школы имени И. П. Саутова во ВНИИГРЖ lentv24.ru, репортаж (год публикации - ).

5. Баркова О.Ю., Ларкина Т.А., Крутикова А.А., Полтева Е.А., Щербаков Ю.С., Пегливанян Г.К., Позовникова М.В. Innovative Approaches to Genome Editing in Chickens CYTOLOGY AND GENETICS, Vol. 56, No. 2, pp. 196–207. (год публикации - 2022).

6. Ларкина Т.А., Крутикова А.А., Пегливанян Г.К., Щербаков Ю.С., Баркова О.Ю. DEVELOPMENT OF OPTIMAL TECHNOLOGICAL APPROACHES FOR OBTAINING PGCS IN PUSHKIN BREED CHICKENS FOR FURTHER TRANSFORMATION BY THE CRISPR / CAS9 SYSTEM FASEB JOURNAL, 35, S1, P. 05031 (год публикации - 2021).