Аннотация результатов, полученных в 2020 году
Исследования и работы, проводимые в рамках первого года проекта, были направлены на решение организационных, научных и технических задач. В соответствии с календарным планом, в первые месяцы реализации проекта были проведены работы по созданию совместной между ООО "Гринтех Байкал" и ФГБОУ ВО “Иркутский государственный университет” лаборатории фармацевтической биотехнологии. Лаборатория создана в структуре научно-исследовательской части ФГБОУ ВО «ИГУ» на правах самостоятельного структурного подразделения и расположена на территории ботанического сада ФГБОУ ВО «ИГУ». На начальных этапах исследования были проведены работы по поиску плодовых тел трюфелей. Принимая во внимание эпидемиологическую обстановку, было принято решение не проводить выездные работы по поиску трюфеля, а приобрести плодовые тела и организовать доставку данных скоропортящихся продуктов в г. Иркутск для проведения исследования. Основными поставщиками стали индивидуальные предприниматели и самозанятые лица, реализующие свои товары через портал «АВИТО». С помощью российских поставщиков были получены образцы белого и черного трюфелей из Италии. Также найдены российские поставщики трюфелей на территории Краснодарского края (г. Сочи, г. Краснодар) и республики Чувашия (г. Чебоксары). Для выполнения проекта получены следующие образцы сумчатых грибов: Tuber aestuvum (г. Краснодар), Tuber aestuvum, T. brumale (г. Сочи), Choiromyces venosus (Чувашия), Tuber aestivum (Италия), Tuber magnatum (Италия). Для выделения чистых культур использовали классические подходы микробиологии и микроклонального размножения. Проведен литературный обзор методов, позволяющих культивировать и выделять чистые культуры грибов на твердых (агаризованных) питательных средах. Для получения мицелия и выделения чистых культур трюфелей, грибы были надрезаны и разломлены в асептических условиях стерильным скальпелем, после чего небольшие фрагменты гриба были извлечены из центра плодового тела. Фрагменты плодовых тел были инокулированы на следующие твердые питательные среды: среда Сабуро, агаризованное солодовое сусло, картофельно-глюкозная среда, капустный агар, картофельно-пептонный агар. Посевы инкубированы при трех различных температурах: 20-22°С, 28-30°С и 37°С. Адекватный рост при этом отмечали только при температурах 20-22°С, 28-30°С и повышенной влажности воздуха в камере термостата. Для исключения контаминации в образцах, в твердые питательные среды вносили антибиотики цефтриаксон, противогрибковый агент фурацилин и гормон роста 6-бензиламинопурин (6-BAP), рабочие и нетоксичные концентрации которых были подобраны экспериментально. В то же время, принимая во внимание ранее установленные ростостимулирующие эффекты молекулярного кислорода, было принято решение о параллельной культивации грибов в условиях атмосферы, насыщенной кислородом. В качестве группы сравнения применяли Agaricus bisporus и Pleurotus ostreatus. Таким образом, проведены работы по подбору питательных сред и условий по культивации трюфеля. В ходе проведенных работ показано, что все испытанные питательные среды пригодны для культивации и первичного выделения чистых культур черного трюфеля, но видоспецифичны по отношению к белому трюфелю и особо эффективны в присутствии антибиотиков, фитогормонов и фрагментов корневой системы дуба. В ходе исследования было проведено более 150 посевов. К окончанию первого года проекта, после серии пересевов, выделено 6 культур черного трюфеля. Работы с белым трюфелем требуют, по – видимому, иных подходов, поскольку все посевы белого трюфеля не привели к формированию мицелия. Выделенные культуры на данный момент законсервированы. Штаммы хранятся в среде глицерола 20% при температуре -20°С и инокулированы на стерильное зерно для будущих исследований. При разломе грибов и посеве фрагментов грибов для получения мицелия, были проведены пробоотборы фрагментов плодового тела для проведения анализа жирнокислотного состава и оценки разнообразия сообществ прокариот и эукариот (по гену 16S рРНК, ITS) с применением подхода секвенирования метагенома. Образцы для определения жирнокислотного состава зафиксированы в экстрагирующей смеси Хлороформ: Метанол (2:1). Образцы для определения состава метагеномных сообществ зафиксированы в TE буфере (10 мМ Трис, 1 мМ ЭДТА). Показано, что среди бактериального сообщества белого трюфеля Choiromyces meandriformis (г. Чебоксары) доминировали бактерии рода Lactococcus sp. (OTU,% - 87%), Bradyrhizobium sp. (4.63%). Сообщество эукариот, обитающих в белом трюфеле, помимо трюфеля Choiromyces meandriformis (OTU,% - 80%), представлено иными организмами, в т.ч. Alternaria sp. (OTU,% - >1%), Leptolegnia sp. (OTU,% - >1%), Mortierella (OTU,% - >1%), Tricholoma (OTU,% - >1%), Zopfiella (OTU,% - >1%). В то же время, выявленное бактериальное сообщество черного трюфеля Tuber aestivum (г. Сочи), существенно отличалось от Choiromyces meandriformis и было представлено такими доминирующими бактериями, как Serratia sp. (OTU,% - 37%) и Rahnellas sp. (OTU,% - 4,28%). Сообщество эукариот, обитающих в черном трюфеле, помимо трюфеля Tuber aestivum (OTU,% - 54%), представлено Ascobolus sp. (OTU 4,3%), Penicillium sp. (OTU 6,7%), Cladophialophora sp. (OTU 1,6%), Mortierella sp. (OTU 1,56%), Leptolegnia sp. (OTU >1%), Psathyrella sp. (OTU >1%), неидентифицированные до рода – (OTU 29,7 %). Оценивая разнообразие высших таксономических категорий, сообщество трюфеля Tuber aestivum (г. Сочи) состояло из грибов (79%), протистов (4%), страменопилов (>1%) и неидентифицированных таксонов (16%). Также, на основе последовательностей фрагмента ITS, полученных из сырых данных секвенирования, последовательности полученных грибов – трюфелей были выровнены с представителями иных грибов, депонированных в системе NCBI. Генетическая принадлежность подтверждена филогенетическим деревом и строго сформированными кладами с иными представителями одного вида. Для выравнивания нуклеотидных последовательностей применяли алгоритм множественного выравнивания MUSCLE в пакете программ MEGA-X. Вместе с тем, целью настоящего года исследования так же являлось определение и идентификация некоторых вторичных метаболитов. Работы проведены с использованием актуальных, новых и перспективных масс-спектрометрических методов исследования структуры и свойств молекул. В ходе проведенных масс-спектрометрических анализов и работе с базами данных природных соединений Dictionary of natural products показано, что в черном трбфеле присутствуют природные соединения, обладающие антимикробной и противогрибковой и иммуносупрессорной активностью. Согласно первым проведенным экспериментам, в составе плодового тела обнаружены и эйфоритики. Также, в рамках первого года выполнения проекта начаты работы по глубинному культивированию штаммов для анализа состава вторичных метаболитов и их хроматографической очистки. На первых этапах начаты работы по культивированию всех выделенных штаммов в жидкой питательной среде Сабуро. Проведены работы по микроскопированию образцов с применением светового микроскопа и селективному окрашиванию клеточных компонентов. Также, в рамках дополнительных работ проведена посадка грибов – трюфелей в дубовую рощу монгольского дуба Quercus mongolica, распложенную в ботаническом саду ИГУ и начаты работы по определению ростостимулирующих характеристик грибов и их экстрактов.

Аннотация результатов, полученных в 2021 году
Второй год проект 20-76-00001 выявил новые горизонты для развития научных исследований на основе как собственных материалов, так и исследований, проведенных по всему миру. В ходе второго года проекта проведен эксперимент по послойной диссекции трюфелевых грибов и оценке метагеномных сообществ прокариотических и эукариотических организмов, населяющих плодовые тела грибов от поверхности до сердцевины. Данные исследования проведены как для черных, так и для белых трюфелевых грибов, принадлежащих к числу истинных трюфелевых грибов. В ходе проводимых работ были выделены и идентифицированы грибы, ассоциированные с трюфелевыми грибами, относящиеся к таким родам, как: Bjerkandera sp., Trichothecium sp., Fusarium sp. Примечательно, что все упоминаемые роды являются патогенными для растительных организмов. В связи с этим предположено, что данные грибы помогают трюфелевым грибам каким – то образом проникать в корневую систему растительных организмов и облегчать формирование микоризы с растительными организмами – хозяевами. Вместе с тем, в ходе проводимых работ построено филогенетическое дерево с представителями трюфелевых грибов Tuber aestivum. На основании выравнивания секвенированного фрагмента ITS2, и выравнивания полученной нуклеотидной последовательности с нуклеотидными последовательностями, депонированными в Genbank, обнаружено, что трюфелевые грибы, собранные в районе г. Сочи в наибольшей степени схожи с трюфелевыми грибами, собранными ранее в Чехии и Словакии. Выравнивание при этом включало 246 нуклеотидных последовательностей из 356 последовательностей, депонированных ранее в Genbank. Представители русского черного трюфеля формировали тесные клады с представителями из данных стран. Обособленной и специфической группы русские трюфелевые грибы не формировали, в отличии от трюфелевых грибов вида Tuber aestivum, культивируемых в Китае. В ходе выполнения проекта под Краснодаром были обнаружены представители трюфелевых грибов Tuber magnatum и Tuber macrosporum. Примечательно, что среди разнообразия сообществ прокариот и эукариот, обитающих в трюфелевых грибах, обнаружено, что в составе одного плодового тела может одновременно обитать 2 вида трюфелевых грибов. Так, в составе трюфелевых консорциумов обнаружены трюфелевые грибы видов Tuber glabrum, Tuber regianum и Tuber multimaculatum. Проведены исследования по описанию природных соединений, синтезируемых трюфелевыми грибами и ассоциированными организмами. С применением подходов газовой хроматографии и масс-спектрометрии показано, что преимущественно все жирные кислоты и низкомолекулярные метаболиты были обнаружены как в образцах перидия, так и в образцах сердцевины глебы. В то же время, выявлены и специфические маркеры. Так, только в образцах перидия были обнаружены нонадециловая кислота и эргоста -5,22-диен-3 -ол. В то же время, только в образцах сердцевины глебы были обнаружены линолевая кислота и эргоста-4,6,8(14),22-тетра-3-он. Также, в ходе исследования, с применением подходов высокоэффективной жидкостной хроматографии и масс-спектрометрии обнаружено природное соединение Андростан-3-ол, являющееся ингибирующим андростановым нейростероидом, слабым андрогеном и, эйфоретиком. Также, в ходе исследования проведен патентный поиск для разработки прикладных результатов исследования. Обнаружено, что ежегодно стабильно публикуется не менее 60 патентных документов, тогда как в международной индексируемой научной литературе публикуется не более 30 научных статей в год. Принимая во внимание материалы исследования, ряд рассмотренных публикаций и патентов, выявленных в ходе работы по проекту, установлено, что многие работы, хоть и описывают биотехнологический потенциал трюфелевых грибов и его мицелия, на самом деле не проводили молекулярную идентификацию биологических объектов, выросших из биоматериала трюфелевых грибов, а потому, работы могли быть проведены грибами, являющимися на самом деле лишь грибами, ассоциированными с трюфелевыми грибами, а не трюфелевыми грибами. В рамках научно – популяризаторской деятельности руководитель проекта представил доклад по теме «Пищевые и медицинские биотехнологии на основе трюфелевых грибов» в рамках 8 сезона проекта Иркутского государственного университета «Научные weekend-ы». Также, практической трансляцией тематики стала поставка биоматериала для закладки трюфелевого сада под г. Волгоград и разработка концепции трюфелевого иннопарка на базе ботанического сада Иркутского государственного университета. Предполагается, что материалы исследований будут способствовать расширению списков грибов, внесенных в Красную книгу РФ, а также в скором будущем приведут к внедрению разработок.