КАРТОЧКА ПРОЕКТА ФУНДАМЕНТАЛЬНЫХ И ПОИСКОВЫХ НАУЧНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ,
ПОДДЕРЖАННОГО РОССИЙСКИМ НАУЧНЫМ ФОНДОМ

Информация подготовлена на основании данных из Информационно-аналитической системы РНФ, содержательная часть представлена в авторской редакции. Все права принадлежат авторам, использование или перепечатка материалов допустима только с предварительного согласия авторов.

ОБЩИЕ СВЕДЕНИЯ

Номер 20-75-10144

НазваниеСоздание новых микрофлюидных биосенсоров для диагностики и типирования туберкулезной инфекции

РуководительБеспятых Юлия Андреевна, Кандидат биологических наук

Организация финансирования, регион Федеральное государственное бюджетное учреждение "Федеральный научно-клинический центр физико-химической медицины имени академика Ю.М. Лопухина Федерального медико-биологического агентства", г Москва

Период выполнения при поддержке РНФ

07.2020 - 06.2023

Конкурс№50 - Конкурс 2020 года «Проведение исследований научными группами под руководством молодых ученых» Президентской программы исследовательских проектов, реализуемых ведущими учеными, в том числе молодыми учеными.

Область знания, основной код классификатора 05 - Фундаментальные исследования для медицины, 05-403 - Медицинская микробиология и вирусология

Ключевые словамикобактерия туберкулеза, туберкулезная инфекция, тест-система, микрофлюидные технологии, биосенсор, фотонный кристалл, биочип, диагностика, оптические поверхностные волны

Код ГРНТИ76.29.53

СтатусУспешно завершен

ИНФОРМАЦИЯ ИЗ ЗАЯВКИ

Аннотация
Согласно последним данным Всемирной организации здравоохранения (ВОЗ) в Российской Федерации заболеваемость туберкулезом продолжает оставаться на высоком уровне, несмотря на наметившуюся тенденцию к стабилизации. В 2018 году зарегистрировано почти 80 тысяч новых случаев заболевания и 8617 человек умерло, кроме того, среди постоянного населения умерло 7857 пациентов с туберкулезом, инфицированных ВИЧ (WHO. Weekly Epidemiological Record; Geneva, Switzerland, 2020; V 95; Нечаева О.Б. Эпидемическая ситуация по туберкулезу в Российской Федерации в 2018 году. ФГБУ "ЦНИИОИЗ" Минздравсоцразвития России, Москва. 2019) Особую и весьма значительную роль в обострении ситуации с туберкулезом играет появление и все большее распространение штаммов микобактерий, устойчивых к лекарственным препаратам. Наибольшую опасность представляют штаммы Mycobacterium tuberculosis, обладающие множественной лекарственной устойчивостью (МЛУ – устойчивые к двум основным противотуберкулезным препаратам: рифампицину и изониазиду) или широкой лекарственной устойчивостью (ШЛУ – устойчивые к рифампицину, изониазиду, фторхинолонам и одному из инъекционных противотуберкулезных препаратов второй группы) (WHO. Treatment of TB: Guidelines for National Programmes; WHO/TB/97.220; Geneva, Switzerland, 1997). По некоторым данным, в мире около 4 % случаев туберкулеза вызываются МЛУ-штаммами, а среди ранее леченных больных частота выявления МЛУ-штаммов достигает до 40 %. В тоже время, на территории нашей страны показатели более плачевные. Так, число МЛУ-штаммов среди впервые выявленных случаев достигает 30%, в то время как среди леченых больных в иных регионах превышает 60% (Нечаева О.Б. Эпидемическая ситуация по туберкулезу в Российской Федерации в 2018 году. ФГБУ "ЦНИИОИЗ" Минздравсоцразвития России, Москва. 2019). Таким образом, в недалеком будущем современная медицина, лишенная эффективных химиотерапевтических средств, воздействующих на микобактерии, может оказаться безоружна перед лицом возрастающей угрозы повсеместного распространения устойчивых штаммов M. tuberculosis. Очевидно, что в сложившейся ситуации весьма актуальны исследования, направленные на решение проблемы быстрой диагностики заболевания, своевременного выявления устойчивых к противотуберкулезным препаратам форм, а также на проведение адекватных противоэпидемических мероприятий, ориентированных на предупреждение распространения штаммов микобактерий (в том числе и устойчивых) в человеческой популяции. Большие перспективы и возможности в этом направлении открывают современные достижения молекулярной биологии и биофизики. В частности, принципиально новыми являются разработки в области микрофлюидных технологий. Основными преимуществами данных технологий является возможность работы с крайне малыми объемами жидкостей, газов, с пузырьками и каплями, с кристаллическими и полимерными частицами, даже с отдельными биологическими клетками. Однако, в нашем случае главное преимущество состоит в том, что реакции проходят в закрытых системах, где исключена контаминация, а объемы реагентов минимальны. Таким образом очевидна актуальность использования данной технологии при работе с таким патогеном, как возбудитель туберкулеза. Таким образом, данный проект направлен на разработку и создание микрофлюидного биочипа и биосенсора, позволяющего осуществлять быструю диагностику туберкулеза, а также характеризовать как отдельные штаммы M. tuberculosis, в том числе по профилю лекарственной устойчивости. Разрабатываемая диагностическая система будет представлять из себя оптический безмаркерный биосенсор на фотонных кристаллах (ФК) с двухмерным пространственным разрешением и биочип с иммобилизованными метками для детекции процесса связывания лигандов в реальном времени. Следует отметить, что еще одной целью данного проекта является объединение современных достижений в физике поверхностных оптических волн в фотонных кристаллах с методами и потребностями современных биохимических и биомедицинских исследований. Двухмерное пространственное разрешение позволит осадить на поверхность ФК чипа десятки и даже сотни сайтов с различными лигандами, которые будут селективно связывать комплементарные к ним биомолекулы в исследуемом аналите. В случае представленного проекта, данными лигандами будут являться специально подобранные синтетические олигонуклеотидные зонды, соответствующие определенным участкам ДНК (в том числе содержащие специфические полиморфизмы) микобактерий. Отобранные лиганды будут селективно связываться с нативными участками молекулы ДНК патогена в анализируемом образце, что позволит в дальнейшем применять данный биосенсор в биомедицинской диагностике туберкулеза. Так, одной из задач проекта будет являться подбор олигонуклеотидов для осаждения на поверхность ФК. На сегодняшний день, имеются гидрогелевые биочипы, с иммобилизованными зондами для диагностики возбудителя туберкулеза, а именно определения сполигопрофиля (сполиго-биочип) (Bespyatykh JA, et al., Infect Genet Evol. 2014) и детерминант лекарственной устойчивости (ТБ-ТЕСТ) (Беспятых с соавт., Пульмонология, 2013; Зименков с соавт., Мол. Биол., 2014). Стоит отметить, что руководитель настоящего проекта принимал участие в разработке данных методов. Другая задача проекта будет связана с разработкой фотонно-кристаллической структуры биочипа, метода его модификации для иммобилизации олигонуклеотидов и разработка оптического безмаркерного биосенсора на ФК с двухмерным пространственным разрешением с необходимой чувствительностью для детекции связывания маркеров возбудителя туберкулеза на поверхности ФК. Важно отметить, что участниками данного научного коллектива впервые была предложена и продемонстрирована возможность биосенсорики на ФК (Konopsky et al, Analytical Chemistry, 2007; Konopsky et al, Biosensors and Bioelectronics, 2010; Konopsky et al, New Journal of Physics, 2010; Konopsky et al, Sensors and Actuators B: Chemical, 2010; Konopsky et al, Phys. Rev. A, 2012; Konopsky et al, Sensors (Special Issue "Photonic Crystal Sensors"), 2013), а также Басмановым и Прусаковым показана возможность детекции связывания олигонуклеотидов различной последовательности на поверхности ФК в реальном времени (Tatarinova et al, PLoS ONE, 2014; Prokofjeva et al, Nucleic Acid Ther. 2017). В завершении проекта планируется провести тестирование разработанного биочипа и биосенсора на независимой выборке клинических образцов Mycobacterium tuberculosis (n=150) выделенных в Санкт-Петербургском НИИ Фтизиопульмонологии. Такой скрининг позволит в полной мере оценить эффективность разработанной тест системы и возможность ее применения в медицинской практике. Таким образом, с одной стороны, актуальность проекта обусловлена высокой социальной значимостью заболевания и необходимостью разработки новых методов быстрой диагностики и типирования штаммов патогена ввиду повсеместного распространения лекарственно устойчивых форм. С другой стороны, актуальность данного проекта также определяется потребностью в новых принципах и подходах для разработки поверхностных сенсоров, позволяющих одновременно детектировать множество биохимических реакций на поверхности. Это позволит расширить возможности label-free биосенсорики как для высокоскоростной диагностики патогенов и иммунодиагностических исследований, так и для других направлений, таких как биофармацевтические исследования и разработка лекарств.

Ожидаемые результаты
1. Будет сформирован пул олигонуклеотидных последовательностей (лигандов) для осаждения на поверхность ФК разрабатываемого биочипа. Данные олигонуклеотиды будут отобраны на основании анализа полногеномных данных Mycobacterium tuberculosis (n=5000). Пул будет состоять из последовательностей, которые позволят определить наличие возбудителя в анализируемом образце; сполигопрофиль; детерминанты лекарственной устойчивости, а также предполагаемые компенсаторные мутации. 2. Будет разработан оптический безмаркерный биосенсор на фотонных кристаллах с двухмерным пространственным разрешением, позволяющий осаждать и проводить анализ на не менее 50 лигандов 3. Будут разработаны методы химической модификации и осаждения отобранных в ходе выполнения проекта нуклеотидных лигандов для диагностики возбудителя туберкулеза на поверхность ФК биочипа. 4. Будет разработана методика нанесения двумерной матрицы нуклеотидных лигандов с общим количеством не менее 50 шт на поверхность ФК биочипа с помощью роботизированного раскапывателя. 5. Будет создан ФК биочип для идентификации микобактерий и определения детерминант лекарственной устойчивости, а также предполагаемых компенсаторных мутаций. Будет исследована чувствительность оптического биосенсора с пространственным разрешением с такими ФК биочипами. 6. На независимой выборке клинических изолятов M. tuberculosis будет проверена эффективность разработанного безмаркерного биосенсора с двумерным пространственным разрешением и ФК биочипа. В последние годы идет активное создание биосенсоров, способных одновременно регистрировать сотни биохимических реакций на поверхности без предварительной маркировки реагентов (label-free). Наиболее популярным решением для выполнения такой задачи является использование биосенсора на поверхностных плазмонах с двухмерным пространственным разрешением (SPRi – surface plasmon resonance imaging). Такие биосенсоры дают информацию о состоянии изучаемой поверхности, о процессах сорбции и десорбции биомолекул на поверхности, а также дают возможность в реальном времени рассчитать константы сорбции и десорбции. Однако, недостаточная чувствительность этого метода ограничивает область его применения. С другой стороны, в последние годы сенсоры на ФК являются более высокочувствительной альтернативой сенсорам на ПП. Но в настоящее время не существует оптических биосенсоров на ФК с двухмерной визуализацией, то есть, у ФК сенсоров нет их imaging модификации. Разработка ФК биосенсора с двухмерным пространственным разрешением с увеличенной (по сравнению с SPRi) масс-чувствительностью позволит расширить области применения данных сенсоров. Создание такого высокочувствительного ФК биосенсора для детектирования возбудителя туберкулеза является основной целью данного проекта. В то же время, как таковая актуальна и сама потребность в новых принципах и подходах для разработки поверхностных сенсоров, позволяющих одновременно детектировать множество сотен биохимических реакций на поверхности.

ОТЧЁТНЫЕ МАТЕРИАЛЫ

Аннотация результатов, полученных в 2020 году
В ходе выполнения первого этапа проекта отобрана коллекция геномных последовательностей представителей комплекса M. tuberculosis. Данная коллекция использована для анализа генетической вариабельности возбудителя туберкулеза и подбора максимально подходящих зондов для идентификации и типирования патогена. На основании проведенного сравнительного геномного анализа, а также имеющегося опыта заявителей (Bespyatykh et al., Infect Genet Evol., 2014) подобраны зонды (n=43) для проведения сполиготипирования штаммов M. tuberculosis. В связи с особенностями разрабатываемого биосенсора зонды были модифицированы с целью создания протяженных одноцепочечных участков, не подверженных образованию вторичных структур, которые могут снизить эффективность комплементарного взаимодействия в растворе между зондом, заякоренным на стрептавидине за счёт концевого нуклеотидного остатка с биотином и одноцепочечной молекулой ДНК. Был синтезирован первый пул отобранных нуклеотидных последовательностей для адсорбции на поверхности биосенсора. Была рассчитана и изготовлена 8-ми слойная фотонно-кристаллическая структура для длин волн 500 нм, обеспечивающая необходимый переход интенсивности света в энергию поверхностной моды, детектируемой цветной матрицей КМОП-камеры. Для детекции связывания нуклеотидных зондов на поверхности ФК биочипа разработана оптическая система биосенсора с двухмерным пространственным разрешением. В ходе создания биосенсора с двухмерным пространственным разрешением потребовалось не только решить задачу создания оптической системы возбуждения и регистрации поверхностных волн, но и значительно повысить чувствительность самого метода. Одним из путей решения этой проблемы было увеличение сорбционной емкости поверхности фотонного кристалла для целевых молекул. Для этого была проведена серия экспериментов по модификации поверхности ФК биочипа с использованием декстранов из L. mesenteroides различной молекулярной массы с детекцией результатов модификации в реальном времени на высокочувствительном одноканальном биосенсоре на поверхностных волнах в одномерном фотонном кристалле с одновременной регистрацией величины слоя приращения и объемного показателя преломления смеси. Полученные структуры были охарактеризованы независимым физическим методом — атомно-силовой микроскопией и показали значительное увеличение, по сравнению с немодифицированными, сорбционной емкости подложки.

Публикации

1. Басманов Д.В., Митько Т.В., Шакуров Р.И., Беспятых Ю.А. СОЗДАНИЕ НОВЫХ МИКРОФЛЮИДНЫХ БИОСЕНСОРОВ ДЛЯ МУЛЬТИПЛЕКСНОЙ ДЕТЕКЦИИ ПРОЦЕССА СВЯЗЫВАНИЯ ЛИГАНДОВ В РЕАЛЬНОМ ВРЕМЕНИ Актуальные проблемы биомедицины – 2021: Материалы XXVII Всероссийской конференции молодых учёных с международным участием, Отв. ред. Т.Д. Власов. – СПб.: РИЦ ПСПбГМУ, 2021. – с.29 (год публикации - 2021)

Аннотация результатов, полученных в 2021 году
В ходе выполнения второго этапа проекта разработана тест-система на основе изотермической петлевой амплификации (LAMP), позволяющая выявлять ДНК Mycobacterium tuberculosis за 30-40 минут. Данная система может использоваться как независимая диагностическая платформа так и в качестве предварительного этапа для анализа на разрабатываемом фотонно-кристаллическом биосенсоре. Последнее позволит сократить время и расход реактивов в случае отрицательных результатов (отсутвия ДНК возбудителя туберкулеза в анализируемом образце). Для двух олигонуклеотидных зондов, соответствующих спейсерам 36 и 43 M. tuberculosis проведен анализ их связывания с поверхностью ФК через разветвленную структуру различных тестируемых полимеров. Определены кинетические кривые связывания. Использование модификации поверхности ФК на основе дендримеров полиамидоамина (ПАМАМ) 4-го поколения, позволили увеличить сорбционную ёмкость и существенно повысить чувствительность биосенсора. Был собран и протестирован микрофлюидный биосенсор на поверхностных волнах в одномерном фотонном кристалле с двумерным пространственным разрешением для мультиплексной детекции процесса сорбции биомолекул на поверхность. Кроме того, для биосенсора была разработана система нагрева пробы в микрофлюидной кювете на основе нанопленочного никелевого нагревателя и электронной схемы для уменьшения неспецифической сорбции нуклеиновых кислот на поверхность одномерного фотонного кристалла. Результаты, полученные в ходе выполнения проекта, представлены в виде публикаций Sizova S, Shakurov R, Mitko T, Shirshikov F, Solovyeva D, Konopsky V, Alieva E, Klinov D, Bespyatykh J, Basmanov D. The Elaboration of Effective Coatings for Photonic Crystal Chips in Optical Biosensors. Polymers. 2022; 14(1):152. https://doi.org/10.3390/polym14010152 (IF 4.329); Митько Т.В., Шакуров Р.И., Ширшиков Ф.В., Сизова С.В., Алиева Е.В., Конопский В.Н., Басманов Д.В., Беспятых Ю.А. Создание микрофлюидного биосенсора для диагностики и типирования Mycobacterium tuberculosis. Клиническая практика. 2021;12(2):14–20. doi: https://doi.org/10.17816/clinpract71815; Беспятых ЮА, Басманов ДВ “ОМИКСНЫЕ ТЕХНОЛОГИИ В ДИАГНОСТИКЕ MYCOBACTERIUM TUBERCULOSIS”, МЕДИЦИНА ЭКСТРЕМАЛЬНЫХ СИТУАЦИЙ, 2, 24, 2022, 18-26, DOI: 10.47183/mes.2022.0

Публикации

1. Митько Т. В., Шакуров Р. И., Ширшиков Ф. В., Сизова С. В., Алиева Е. В., Конопский В. Н., Басманов Д. В., Беспятых Ю. А. Создание микрофлюидного биосенсора для диагностики и типирования Mycobacterium tuberculosis КЛИНИЧЕСКАЯ ПРАКТИКА, 2(2):14–20 (год публикации - 2021) https://doi.org/10.17816/clinpract71815

2. Сизова С, Шакуров Р, Митько Т, Ширшиков Ф, Соловьева Д, Конопский В, Алиева Е, Клинов Д, Беспятых Ю, Басманов Д The Elaboration of Effective Coatings for Photonic Crystal Chips in Optical Biosensors Polymers, 14 (1), 152 (год публикации - 2022) https://doi.org/10.3390/polym14010152

3. Беспятых ЮА, Басманов ДВ ОМИКСНЫЕ ТЕХНОЛОГИИ В ДИАГНОСТИКЕ MYCOBACTERIUM TUBERCULOSIS МЕДИЦИНА ЭКСТРЕМАЛЬНЫХ СИТУАЦИЙ, 2, 24, 18-26 (год публикации - 2022) https://doi.org/10.47183/mes.2022.0

4. Беспятых Ю.А, Басманов Д.В., Шитиков Е.А. ОМИКСНАЯ ЭРА: новый взгляд на вирулентность возбудителя туберкулеза и методы типирования ПРОБЛЕМЫ МЕДИЦИНСКОЙ МИКОЛОГИИ, №2, 2022 (год публикации - 2022)

5. Беспятых Ю.А, Басманов Д.В., Шитиков Е.А. Омиксная эра: новый взгляд на вирулентность возбудителя туберкулеза и способы борьбы с инфекцией -й Российский микробиологический конгресс. (г. Псков, 26 сентября - 1 октября 2021г.): материалы конгресса. - Псков: ООО "Конкорд", Т1, с 108 (год публикации - 2021)

6. Д.В. Басманов, Р.И. Шакуров, С.В. Сизова, Т.В. Митько, В.Н. Конопский, Ю.А. Беспятых Микрофлюидный биосенсор на поверхностных волнах в фотонном кристалле для мультиплексного молекулярно-генетического типирования патогенов III ОБЪЕДИНЕННЫЙ НАУЧНЫЙ ФОРУМ ФИЗИОЛОГОВ, БИОХИМИКОВ И МОЛЕКУЛЯРНЫХ БИОЛОГОВ ♦VII СЪЕЗД БИОХИМИКОВ РОССИИ♦X РОССИЙСКИЙ СИМПОЗИУМ «БЕЛКИ И ПЕПТИДЫ»♦VII СЪЕЗД ФИЗИОЛОГОВ СНГ(Сочи, Дагомыс, 3–8 октября 2021).НАУЧНЫЕ ТРУДЫ. М.: Издательство «Перо»,, Том 2, с 179 (год публикации - 2021)

7. Ф.В. Ширшиков, Т.В. Митько, Р.И. Шакуров, С.В. Сизова, Д.В. Басманов, Ю.А. Беспятых Генотипирование Mycobacterium tuberculosis с использованием микрофлюидного фотонно-кристаллического биосенсора. III ОБЪЕДИНЕННЫЙ НАУЧНЫЙ ФОРУМ ФИЗИОЛОГОВ, БИОХИМИКОВ И МОЛЕКУЛЯРНЫХ БИОЛОГОВ ♦VII СЪЕЗД БИОХИМИКОВ РОССИИ♦X РОССИЙСКИЙ СИМПОЗИУМ «БЕЛКИ И ПЕПТИДЫ»♦VII СЪЕЗД ФИЗИОЛОГОВ СНГ(Сочи, Дагомыс, 3–8 октября 2021).НАУЧНЫЕ ТРУДЫ. – М.: Издательство «Перо», 2021., Том 2, с. 260 (год публикации - 2021)

8. Ю.А. Беспятых, Д.В. Басманов, Е.А. Шитиков Омиксная эра: новый взгляд на вирулентность возбудителя туберкулеза и способы борьбы с инфекцией III ОБЪЕДИНЕННЫЙ НАУЧНЫЙ ФОРУМ ФИЗИОЛОГОВ, БИОХИМИКОВ И МОЛЕКУЛЯРНЫХ БИОЛОГОВ ♦VII СЪЕЗД БИОХИМИКОВ РОССИИ♦X РОССИЙСКИЙ СИМПОЗИУМ «БЕЛКИ И ПЕПТИДЫ»♦VII СЪЕЗД ФИЗИОЛОГОВ СНГ(Сочи, Дагомыс, 3–8 октября 2021).НАУЧНЫЕ ТРУДЫ. М.: Издательство «Перо», Том 2, с 146 (год публикации - 2021)

Аннотация результатов, полученных в 2022 году
В ходе выполнения проекта разработан способ выявления ДНК возбудителя туберкулеза (M. tuberculosis) методом изотермической амплификации (LAMP). Преимуществом данного способа по сравнению с имеющимися технологиями стало использование в качестве молекулярно-генетического маркера участка видоспецифичного однокопийного гена lppQ (синоним: rv2341; идентификатор в базе данных NCBI Gene: 886275). Видоспецифичность гена rv2341 в отношении бактерий M. tuberculosis ранее была подтверждена с помощью методов сравнительной геномики. Основное преимущество использования данного гена-мишени заключалось в возможности сократить длительность стадии амплификации LAMP до 15 минут. Наблюдаемый эффект повышения скорости амплификации, вероятно, связан с тем, что разработанные праймеры отжигаются на участок гена (194 п.н.) с минимальным гуанин-цитозиновым (ГЦ) составом, равным 64%. Предлагаемый способ, таким образом, может применяться для качественной экспресс-диагностики M. tuberculosis. Кроме того, благодаря использованию в качестве мишени однокопийного гена в геноме M. tuberculosis, становится возможным проведение количественного анализа биологического образца пациента с диагнозом туберкулез с целью определения уровня его бактериальной нагрузки, что может найти применение в оценке эффективности назначаемой пациенту схемы антибактериальной терапии. Результаты работы оформлены в виде публикации “ТБ-ИЗАТЕСТ: быстрый и чувствительный способ диагностики Mycobacterium tuberculosis методом LAMP” (журнал Биоорганическая химия), а также заявки (№ 2022133809) на получение патента Российской Федерации на изобретение «Набор праймеров и способ идентификации бактерий вида Mycobacterium tuberculosis с помощью метода петлевой изотермической амплификации». После адаптации предложенной тест-системы под разработанный ранее и серийно выпускаемый в организации заявителя прибор, Изаскрин-8 (Регистрационное Удостоверение No РЗН 2022/17322 от 24.05.2022), была подготовлена публикация “Новый подход к эпидемиологическому контролю за распространением инфекционных заболеваний среди населения России”, которая принята в спецвыпуск №1, 2023 журнала “Проблемы социальной гигиены, здравоохранения и истории медицины”. Разработан альтернативный универсальный метод создания мультиспотовой матрицы из биомаркеров на модифицированной поверхности фотонного кристалла (ФК), использующий адгезивную гидрофобную защитную маску с микро окнами, формируемыми лазером, для доступа реактивов к поверхности ФК. Разработанная методика позволяет создавать матрицы из более чем 100 уникальных спотов на поверхности ФК. Методом микрораскапывания с использованием как контактной методики, так и методики с гидрофобной маской с микроотверстями, на поверхность ФК биочипа нанесены в виде матриц различные синтезированные олигонуклеотидные зонды, обеспечивающие типирование M. tuberculosis. Получены кривые взаимодействия пробы, содержащей олигосенсоры, с зондами, иммобилизированными, самостоятельно или в комплексе со стрептавидином, на поверхности одномерного фотонного кристалла. Разработан новый метод функционализации поверхности одномерного ФК с завершающим слоем из оксида кремния с помощью дендримерных молекул ПАМАМ 4 поколения, позволяющий более чем на порядок увеличить сорбционную емкость и чувствительность безмаркерного биосенсора при детекции как белковых молекул, так и молекул с малой молекулярной массой, в сравнении с классическими “планарными” методами функционализации с помощью силанов или полиэлектролитов. Для эффективного проведения реакций взаимодействия олигозондов с комплементарными мишенями в биосенсоре на поверхностных волнах в одномерном фотонном кристалле с двумерным пространственным разрешением, разработана аналоговая электронная схема нагрева пробы в микрофлюидной кювете с поддержанием заданной повышенной температуры образца. Проведено моделирование и экспериментальная апробация необходимых геометрий и толщин электродов из никеля, платины или титана, напыляемых на микрофлюидную кювету методами магнетронного или термического напыления. Получена серия экспериментальных образцов ФК биочипов для задач типирования возбудителя туберкулеза. На синтетических модельных образцах смесей олигосенсоров проведено тестирование различных фотонно-кристаллических биочипов с функциональными покрытиями. Из экспериментальных данных установлено, что данная технология особенно хорошо подходит для мультиплексной детекции белковых молекул и молекул большой молекулярной массы. Детекция же олигонуклеотидов требует сложной и многостадийной работы по созданию функционального покрытия фотонного кристалла с повышенной сорбционной емкостью. Получены данные о потенциальных возможностях применения биосенсора с двумерным пространственным разрешением с разработанными методами модификации поверхности для анализа связывания белковых молекул между собой на поверхности фотонного кристалла. Были проведены серии экспериментов с иммуноглобулинами класса G (IgG) человека. Данные по иммобилизации IgG на поверхность ФК, модифицированную разработанными в ходе проведения работ способами, показывают эффективность детекции процессов связывания антител и высокие значения отношения сигнал-шум, что является базовым заделом для дальнейших исследований по имплементации полученных результатов в дальнейшие разработки безмаркерных мультиплексных биосенсоров на поверхностных волнах в фотонных кристаллах.

Публикации

1. Беспятых Ю.А., Каныгин А.П., Ширшиков Ф.В., Прусаков К.А., Мингазова Э.Н., Басманов Д.В. НОВЫЙ ПОДХОД К ЭПИДЕМИОЛОГИЧЕСКОМУ КОНТРОЛЮ ЗА РАСПРОСТРАНЕНИЕМ ИНФЕКЦИОННЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙ СРЕДИ НАСЕЛЕНИЯ РОССИИ Проблемы социальной гигиены, здравоохранения и истории медицины, - (год публикации - 2023)

2. Ф. В. Ширшиков, Ю. А. Беспятых ТБ-ИЗАТЕСТ: СПОСОБ ДИФФЕРЕНЦИАЛЬНОЙ ДИАГНОСТИКИ MYCOBACTERIUM TUBERCULOSIS МЕТОДОМ LAMP БИООРГАНИЧЕСКАЯ ХИМИЯ, - (год публикации - 2023)

3. Шакуров Р, Сизова С, Дудик С, Серкина А, Бажутов М, Станайте В, Тюлягин П, Конопский В, Алиева Е, Секацкий С, Беспятых Ю, Басманов Д Dendrimer-Based Coatings on a Photonic Crystal Surface for Ultra-Sensitive Small Molecule Detection Polymers, 15, 2607 (год публикации - 2023) https://doi.org/10.3390/polym15122607

4. Ф. В. Ширшиков, Ю. А. Беспятых ПЕТЛЕВАЯ ИЗОТЕРМИЧЕСКАЯ АМПЛИФИКАЦИЯ: ОТ ТЕОРИИ К ПРАКТИКЕ БИООРГАНИЧЕСКАЯ ХИМИЯ, том 48, № 6, с. 677–693 (год публикации - 2022) https://doi.org/10.31857/S0132342322060227

5. Ширшиков Ф.В., Беспятых Ю.А. Набор праймеров и способ идентификации бактерий вида Mycobacterium tuberculosis с помощью метода петлевой изотермической амплификации ФЕДЕРАЛЬНАЯ СЛУЖБА ПО ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ, 2022133809 (год публикации - 2023)

Возможность практического использования результатов
В ходе реализации данного проекта разработана тест-система для экспресс диагностики возбудителя туберкулеза методом изотермической амплификации. Данная тест-система позволяет выявлять наличие бактерий возбудителя в течение 15 минут, что намного быстрее чем имеющиеся на сегодняшний день технологии. Например, метод выявления с использованием зарегистрированных на территории нашей страны ПЦР набор (например “Политуб”, НПФ Литех) занимает 1 час 40 минут. таким образом, тест система, разработанная в данном проекте позволяет получать результат быстрее, что безусловно актуально на уровне первичного звена медицинской помощи. Использование предлагаемой тест-системы в качестве скрининга, в том числе медицинского персонала, находящегося в зоне риска, позволит сократить финансовые расходы на проведение подобного анализа, а также позволит улушить эпидемиологическую ситуацию в целом, за счет быстрого и эффективного своевременного выявления заболевания. Адаптация тест-системы под зарегистрированный портативный анализатор Изаскрин-8 («Амплификатор изотермический Изаскрин-8 для выявления нуклеиновых кислот с детекцией флуоресценции в реальном времени по ТУ 21.51.53-001-01532685-2021», производства ФГБУ ФНКЦ ФХМ ФМБА России (Россия), регистрационное удостоверение No РЗН 2022/17322 от 24.05.2022) позволит использовать данную тест-систему с анализатором в полевых условиях. Таким образом экспресс тестирование на выявление возбудителя туберкулеза будет доступ в удаленных регионах нашей страны, в том числе это может быть использовано в местах лишения свободы для своевременного выявления очага инфекции и локализации его. При работе в условиях стандарной диагностической лаборатории постановка осуществляется на плашечных амплификаторах типа ioRad (CFX96, IQ5) CorbettResearch (Rotor-Gene6000), Qiagen (Rotor-GeneQ), Roche (LightCycler96), DNA-Technology (DT-Prime, DT-Lite) для экономической целесообразности постановки анализа в таком формате необходимо собирать достаточное количество проб (для заполнения 96-лучного планшета). Зачастую, это приводит к тому, что в условиях медицинского учереждения происходит коллекционнирование проб, т.е. сбор в течение нескольких дней и только затем постановка. При использовании тест-системы с портативным анализатором Изаскрин-8 (Регистрационное Удостоверение No РЗН 2022/17322 от 24.05.2022), адаптированным для постановки 3-6 проб, нет необходимости собирать пробы до нужного количества (например 96) и можно ставить по мере поступления биоматериала в лабораторию. Такой подход безусловно будет способствовать как снижению себестоимости анализа так и ускорению получения результата, что является крайне важным. Разработка тест-системы для выявления туберкулезной инфекции на реакции изотермической амплификации открывает широкие возможности “упаковки” такой реакции в микрофлюидный чип или картридж, по аналогии с широко известными тестами от Cepheid GeneXpert. Это может быть крайне перспективным как с точки зрения продолжения разработки линейки таких тестов на выявление спектра патогенов, так и с точки зрения разработки полностью отечественной картриджной платформы для проведения экспрессных молекулярно-генетических тестов. Научным коллективом разработаны новые и адаптированы уже известные методы модификации фотонных кристаллов для применений в задачах безмаркерного биосенсинга. Это позволило добиться увеличения сорбционной емкости, а, следовательно, и чувствительности биосенсора на поверхнеостных волнах в ФК, в 14 раз. В связи с этим потенциальные возможности применения биосенсора с двумерным пространственным разрешением в комплексе с разработанным методом модификации поверхности для анализа связывания белковых молекул открывают широкие перспективы использования не только для научных задач определения афинностей взаимодействия биомолекул между собой, проверки работы лекарственных препаратов и т.д., но и дают потенциальную возможность имплементации разработанных технологий, протоколов и ноу-хау в клиническую лабораторную практику, например, для скрининга сывороток на наличие большого спектра антител к различным антигенам, нанесенным на поверхность фотонного кристалла в мультиплексном формате. Потенциально, это может существенно сократить время проведения такого анализа, поскольку в настоящее время это реализуется параллельными постановками иммуно-ферментного анализа, с использованием нескольких наборов реагентов.