Аннотация результатов, полученных в 2020 году
Процесс клональной эволюции, приводящей к развитию рецидива, характеризуется изменением пропорций клонов и субклонов, трансформацией существующих и появлением новых лейкемических клонов. Большая часть исследований в области клональной эволюции лейкозов ограничена «балковым» анализом клональности. Однако очевидно, что на современном этапе развития этой области знаний необходим качественный переход к более прецизионному анализу клональных иерархий. Необходимую в настоящее время точность и информативность может обеспечить только исследования на уровне единичных клеток. Данный проект направлен на исследования особенностей формирования и эволюции клональных архитектур лейкемических клеток детских острых лимфобластных лейкозов (Т-ОЛЛ и В-ОЛЛ) на уровне единичных клеток c использованием перестроек иммуноглобулиновых генов в качестве клональных маркеров. На первом этапе проекта был разработан ключевой компонент для анализа клональной архитектуры лейкозов на уровне ДНК - уникальная, не имеющая в мире аналогов, мультиплексная система для одновременной амплификации полных и неполных перестроек всех 7-ми иммуноглобулиновых генов: TRA, TRB, TRG, TRD, IGH, IGK и IGL. Благодаря высокому уровню чувствительности разработанная система позволяет реконструировать репертуары малых популяций Т и В клеток, включая образцы, содержащие не более 50-ти лимфоцитов, что принципиально для конечных целей проекта. Кроме того, на основе эталонной программы MiXCR разработан интегрированный пайплайн для реконструкции максимально полных репертуаров перестроек иммуноглобулиновых генов, включая неполные перестройки: DJ, DD и IGK-Kde. Кроме того, на основе предложенной концепции о нефункциональных перестройках, как о естественном вложенном контроле, был разработан алгоритм определения и коррекции мультиплекс-специфических количественных перекосов в репертуарах перестроек TCR/BCR. Разработанные алгоритмы были реализованы в виде интегрированной программы iROAR. Разработанная программа была применена при ребалансировки концентраций праймеров для снижения уровня мультиплекс-специфических перекосов. Сверх заявленного плана, в рамках данного проекта впервые в геномной ДНК лимфоцитов человека были идентифицированы D1-D2 перестройки локусов TRB. Так же впервые получены и проанализированы репертуары таких перестроек в лимфоцитах здоровых добровольцев. Полученные результаты свидетельствуют о том, что такие перестройки происходят перед D-J2 рекомбинацией, приводят к делеции С1 сегмента и кассеты J1 сегментов, ограничивая варианты формирования зрелого гена Т-клеточного рецептора только рекомбинацией с J-сегментами из кассеты J2. Факт существования D1-D2 перестроек, их частота и разнообразие, а также особенности их структуры указывают на то, что их формирование неслучайно и является продуктом ранее неизвестной стадии VDJ-рекомбинации. D1-D2 перестройки TRB также были включены в разработанную мультиплексную систему и будут использоваться в качестве клональных маркеров на следующем этапе проекта. Таким образом, на первом этапе проекта не только сформирован необходимый методический задел для успешного выполнения следующего этапа проекта, но и совершено важное фундаментальное открытие.

Аннотация результатов, полученных в 2021 году
За отчетный период разработан, успешно протестирован и применен новый высокопроизводительный метод реконструкции клональных архитектур лимфоидных новообразований на уровне единичных клеток. Разработанный метод основан на флуоресцентном сортинге единичных ядер в отдельные пробирки, с последующим получением таргетных библиотек, их массированным секвенированием и анализом полученных данных. Особенность разработанного метода заключается в существенном повышении производительности данного классического подхода, для чего в каждую пробирку сортируются единичные ядра сразу из нескольких десятков разных образцов, при этом уникальные клональные перестройки, специфичные для каждого образца, используются в качестве вложенного молекулярного идентификатора для последующего демультиплексирования образцов на стадии анализа данных. На первом этапе отчетного периода завершена разработка мультиплексной системы для совместной высокопрецизионной амплификации перестроек генов всех существующих семейств Т- и В-клеточных рецепторов в одной пробирке. Созданная мультиплексная система не имеет в настоящее время аналогов. Ее дополнительными отличительными особенностями является низкий уровень количественных перекосов при амплификации перестроек, содержащих разные V, D и J гены для каждого отдельного семейства TCR и BCR, а также сильно редуцированные количественные перекосы амплификации между разными цепями Т- и В-клеточных рецепторов. Разработанная система может быть использована для исследования ДНК и кДНК-матриц, а также цельных клеточных ядер без необходимости предварительного выделения ДНК. Протестированное на настоящий момент минимальное количество ДНК на старте составляет эквивалент 15 клеток. С помощью разработанной системы в сочетании с массированным секвенированием и последующим анализом с использованием оригинального модифицированного программного обеспечения MIXCR были выявлены клональные перестройки генов TCR и BCR более чем в 200-х образцах Т-ОЛЛ и В-ОЛЛ. Выявленные перестройки затем использовались в качестве маркеров для реконструкции клональной архитектуры ОЛЛ, а также в качестве молекулярных идентификаторов образцов. Также в ходе исследования был создан оригинальный протокол получения смесевых микро-аликвот ядер. Протокол основан на получении общей равномерной смеси ядер лейкемических клеток из анализируемых образцов с последующей флуоресцентной сортировкой считанного числа ядер в отдельные пробирки для последующей амплификации. Получение равномерной смеси обеспечивается за счет точного и воспроизводимого измерения содержания ядер в образце по количеству ДНК в пробе ядер, лизированных в буфере RLT. Чистота сортировки ядер обеспечивается использованием комбинации флуоресцентных ядерных красителей: DAPI и SYTOX Red. Созданный протокол получения микро-аликвот ядер и мультиплексная система для одновременной и равномерной амплификации перестроек всех генов TCR и BCR являются главными компонентами разработанного метода реконструкции клональной архитектуры ОЛЛ на уровне единичных клеток. На матрице микро-аликвот ядер минуя стадию выделения ДНК с помощью разработанной мультиплексной системы были получены библиотеки для таргетного секвенирования перестроек генов TCR и BCR. Из данных секвенирования с помощью модифицированной программы MIXCR были экстрагированы искомые перестройки, с помощью которых были демультиплексированы образцы. После демультиплекса, была сформирована матрица встречаемости отдельных перестроек, совместной встречаемости пар перестроек, троек и т.д. для каждого образца отдельно. На основе полученной матрицы были реконструированы клональные структуры исследуемых образцов. На данном этапе исследования успешно реконструированы клональные архитектуры более 100 образцов Т и В ОЛЛ.

Аннотация результатов, полученных в 2022 году
На третьем этапе проекта проведен комплексный анализ особенностей клональных архитектур Т- и В-линейных острых лимфобластных лейкозов. В анализ были включены полученные за предыдущие два года проекта данные полных адаптомов (репертуары Т- и B-клеточных рецепторов), реконструированные клональные структуры лейкемических клеток, собранные за все время исследования данные иммунофентипов, полученные с помощью проточной цитофлуориметрии и данные полных транскриптомов, полученные на последнем этапе исследования. В ходе проведенного анализа были определены основные паттерны клональных архитектур T-клеточных и B-клеточных лимфобластных лейкозов, особенности клональных перестроек, составляющих ядро клональных архитектур и присутствующих в большинстве субклонов. Также были охарактеризованы субклональные перестройки в разветвленных клональных архитектурах. Были выявлены характерные отличия клональных архитектур Т- и B-клеточных лейкозов, заключающиеся в доминировании разветвленных структур при B-ОЛЛ и линейных структур при Т-ОЛЛ. Еще одним важным отличием является состав “коровых” перестроек: в случае B-ОЛЛ доминируют нетранскрибирующиеся неполные перестройки VD дельта цепей Т-клеточного рецептора и нетранскрибирующиеся перестройки гамма цепей Т-клеточного рецептора; в случае Т-ОЛЛ транскрибирующиеся полные перестройки дельта и гамма цепей Т-клеточного рецептора. В обоих типах лейкозов были найдены аномальные сочетания перестроек Т- и В-клеточных рецепторов как на уровне мажорных клонов, так и среди топовых субклонов. Сравнительный анализ иммунофенотипов, а также анализ дифференциальной экспрессии генов в транскриптомах, полученных для образцов с аномальным (химерным) и нормальным сочетанием клональных перестроек, показал ассоциацию химерных генотипов с химерными иммунофенотипами. Кроме того, за отчетный период завершен анализ нетипичных перестроек между D сегментами бета цепей Т-клеточного рецептора. В ходе анализа выявлено, что такие перестройки консервативны среди млекопитающих, встречаясь как у человека, так и у грызунов, подчиняются правилу 12/23, встречаются как в тимоцитах, так и в зрелых клетках, а также в лейкемических Т-клетках. Эти перестройки имеют бимодальное распределение длин, которое связано с тем, что рекомбинация, в ходе которой они формируются, происходит по двум разным сайтам RSS. Функционально DD перестройки являются химерными D-сегментами с интактными в 96% случаев сайтами рекомбинации, поэтому могут перестраиваться дальше с J-сегментами и затем с V-сегментами. Поэтому такие перестройки могут быть использованы в качестве дополнительного маркера клональной эволюции. Таким образом, за финальный этап проекта выполнены все запланированные экспериментальные и аналитические работы, получены важные фундаментальные знания об особенностях клональных перестроек генов Т- и B-клеточных рецепторов, свойственных острым лимфобластным лейкозам, и особенностях формирования клональных архитектур лейкозов с участием таких перестроек.