Аннотация результатов, полученных в 2020 году
Согласно поставленным в проекте задачам, за отчетный период были исследованы структурно-функциональные особенности митохондрий скелетной мускулатуры и сердца при развитии мышечной дистрофии Дюшенна (МДД). В задачи этапа входило определить роль MPT поры в данной патологии, а также возможность коррекции митохондриальной дисфункции при МДД с помощью нового ингибитора MPT поры – алиспоривира (Debio 025). Продемонстрировано, что дистрофин-дефицитные мыши линии C57BL/10ScSn-Dmdmdx (mdx мыши) характеризуются снижением мышечной силы и выносливости по сравнению с мышами линии С57ВL/10 «дикого типа». В этом случае внутрибрюшинное введение ингибитора митохондриальной MPT поры алиспоривира (5 мг/кг через день в течение 4 недель) приводило к улучшению мышечной функции дистрофин-дефицитных мышей. Кроме того, показано, что для mdx мышей характерно увеличение абсолютной массы сердца по сравнению с контрольными животными того же возраста в 1.3 раза. Применение алиспоривира привело к нормализации абсолютной массы сердца, а также значительному снижению относительной массы этого органа у mdx мышей. Отмечено, что алиспоривир не влияет на массу сердца мышей «дикого типа», но в то же время способствует снижению общей массы тела животных. Кроме того, дистрофин-дефицитные животные характеризовались достоверным снижением частоты сердечных сокращений (в 1.2 раза по сравнению с контролем). В этом случае животные, получавшие алиспоривир, характеризовались тенденцией к нормализации этого параметра. Дистрофин-дефицитные животные также характеризовались значительным увеличением уровня креатинкиназы, лактатдегидрогеназы (ЛДГ) и аспартатаминотрансферазы (АСТ), ферментов-маркеров воспалительного процесса, в сыворотке крови по сравнению с мышами «дикого типа», что свидетельствует о высокой интенсивности воспалительных процессов в мышечной ткани mdx мышей и нарушении целостности клеточных мембран. Применение алиспоривира сопровождалось тенденцией к снижению активности креатинкиназы и ЛДГ, а также достоверным снижением активности АСТ в сыворотке крови mdx мышей. Таким образом, алиспоривир способствует снижению интенсивности воспалительного процесса в мышечной ткани дистрофин-дефицитных животных, оказывая благоприятное влияние на мышечную силу и выносливость мышей, а также препятствует развитию гипертрофии сердечной мышцы, что говорит о возможном кардиопротекторном действии этого агента. Введение алиспоривира мышам «дикого типа» не оказало существенного влияния на исследуемые параметры, тем не менее мы отметили тенденцию к снижению массы контрольных животных. Показано, что митохондрии скелетной мускулатуры дистрофин-дефицитных мышей обладают повышенной чувствительностью к индукции MPT поры по сравнению с митохондриями контрольных животных «дикого типа». Это проявляется в существенном снижении Са2+ емкости митохондрий скелетной мускулатуры mdx мышей по сравнению с контрольными животными. Нами показано, что снижение резистентности митохондрий скелетных мышц mdx мышей к индукции поры может быть обусловлено увеличением уровня белка ANT2 во внутренней мембране органелл, способного формировать канал MPT поры. При этом уровень других белков, участвующих в индукции формировании поры (ANT1, циклофилин Д и АТФ-синтаза), напротив, снижался. Применение алиспоривира привело к увеличению Са2+ емкости митохондрий скелетной мускулатуры mdx мышей до показателей контрольных животных и не влияло на этот параметр митохондрий мышей «дикого типа». При этом алиспоривир не влиял на уровень белков компонентов MPT-поры. Нами предположено, что эффект этого агента обусловлен фармакологическим ингибированием связывания циклофилина Д, являющегося активатором поры, с компонентами поры, образующими канал во внутренней мембране органелл. Кроме того, показано, что для митохондрий скелетной мускулатуры дистрофин-дефицитных мышей характерно существенное снижение интенсивности дыхания и окислительного фосфорилирования, которое проявляется в подавлении дыхания в состоянии 3 и 3UДНФ (разобщенное дыхание), а также в снижении показателя дыхательного контроля в 1.3 раза по сравнению с контролем. Установлено, что эти изменения могут быть обусловлены снижением содержания белков, входящих в состав комплексов I и V дыхательной цепи митохондрий. В этом случае, митохондрии скелетных мышц mdx мышей, получавших инъекции алиспоривира, характеризовались нормализацией функциональной активности и достоверным увеличением скорости дыхания в состоянии 3 и 3UДНФ до показателей здоровых животных, а также увеличением параметра дыхательного контроля. Нами выяснено, что действие алиспоривира может быть обусловлено увеличением уровня белков, формирующих комплекс I дыхательной цепи митохондрий в скелетной мускулатуре mdx мышей. Установлено, что дисфункция митохондрий в скелетных мышцах mdx мышей также сопровождается увеличением уровня малонового диальдегида (МДА) в органеллах (в 1.8 раз по сравнению с контролем), что свидетельствует об увеличении интенсивности окислительного стресса в скелетной мускулатуре при дистрофии Дюшенна. Применение алиспоривира привело к достоверному снижению уровня МДА. Это говорит о способности алиспоривира снижать интенсивность окислительного стресса в скелетной мускулатуре при дистрофии Дюшенна. В рамках этапа выяснено, что для скелетной мускулатуры дистрофин-дефицитных животных характерно подавление митохондриального биогенеза, который проявляется в снижении экспрессии гена Pgc1a, ответственного за биогенез органелл, а также снижением количества копий митохондриальной ДНК в этой ткани. В то же время при МДД не наблюдается изменений в митохондриальной динамике, экспрессия митофузина 2 (белка, отвечающего за слияние митохондрий) и гена Drp1 (ответственного за митохондриальное деление) не изменялась. Применение алиспоривира привело к снижению уровня экспрессии митофузина 2 в скелетной мускулатуре mdx мышей, уровни Drp1 и Pgc1a также обнаружили тенденцию к снижению, однако количество митохондриальной ДНК достоверно не изменялось. Кроме того, алиспоривир индуцировал снижение размера митохондрий как в группе mdx мышей, так и у контрольных животных. Таким образом, алиспоривир оказывал существенное влияние на митохондриальный биогенез и динамику органелл в скелетных мышцах, которое было наиболее выражено в случае дистрофин-дефицитных животных. Установлено, что mdx мыши характеризуются повышением функциональной активности митохондрий сердца. Это проявляется в увеличении скорости дыхания в состоянии 3 и 3UДНФ, а также параметра дыхательного контроля по сравнению с животными дикого типа в 1.3 раза. Выяснено, что увеличение интенсивности дыхания и окислительного фосфорилирования в митохондриях сердца mdx мышей может быть обусловлено увеличением уровня белков, входящих в состав комплексов I и V дыхательной цепи митохондрий. Применение алиспоривира не оказало существенного влияния на параметры дыхания и окислительного фосфорилирования митохондрий сердца и не влияло на уровень комплексов дыхательной цепи митохондрий сердца обеих групп мышей. Митохондрии сердца mdx мышей также характеризовались увеличением резистентности к индукции MPT поры, которая выражалась в увеличении Са2+ емкости митохондрий дистрофин-дефицитных мышей в 1.4 раза по сравнению с митохондриями контрольных животных. При этом установлено, что уровень белков ANT2 и циклофилина Д не изменялся. В то же время в сердечной мускулатуре mdx мышей отмечено увеличение уровня белка АNT1, что, как мы полагаем, может обуславливать увеличение функциональной активности митохондрий сердца дистрофин-дефицитных животных. Применение алиспоривира не оказало влияния на Са2+ емкость митохондрий сердца mdx мышей и контрольных животных «дикого типа», а также не влияло на уровень белков MPT-поры в сердечной мускулатуре экспериментальных групп животных. Нами установлено, что для сердечной мускулатуры mdx мышей также характерно подавление митохондриального биогенеза, проявляющееся в снижении экспрессии гена Pgc1a. В то же время количество митохондриальной ДНК, а также уровень экспрессии гена митофузина 2 и гена Drp1 (ответственных за процессы слияния и деления митохондрий соответственно) не изменялись. Алиспоривир индуцировал дальнейшее снижение уровня экспрессии Pgc1a и количества копий митохондриальной ДНК по сравнению с контрольными mdx мышами, но не влиял на уровни Drp1 и митофузина 2. Более того, алиспоривир также снижал экспрессию Pgc1a в сердечной мускулатуре контрольных мышей. Такое действие алиспоривира сопровождалось достоверным снижением размера митохондрий в группе mdx мышей и, напротив, увеличением размера органелл в сердечной мускулатуре контрольных животных. Это также свидетельствует о способности алиспоривира оказывать существенное влияние на митохондриальный биогенез в сердечной мускулатуре. Кроме того, нами установлено, что митохондрии скелетной мускулатуры и сердца mdx мышей обладают более низкой скоростью транспорта ионов К+ по сравнению с митохондриями контрольных животных. Содержание ионов К+ в митохондриях также снижалось. Это свидетельствует о подавлении работы митохондриального АТФ-зависимого К+ канала при развитии дистрофии Дюшенна. При этом алиспоривир также способствовал восстановлению гомеостаза этого иона, по крайней мере в случае митохондрий скелетной мускулатуры. Таким образом, исходя из полученных в работе результатов, можно заключить, что алиспоривир является эффективным протекторным препаратом, снижающим развитие дисфункции в митохондриях скелетной мускулатуры и поддерживающим функционирование митохондрий сердца при развитии дистрофии Дюшенна.

Аннотация результатов, полученных в 2021 году
Согласно поставленным в проекте задачам, за отчетный период было изучено влияние модуляции митохондриального АТФ-зависимого К+ канала, а также Са2+-активируемого К+ канала (BKCa) на дисфункцию митохондрий и состояние скелетной мускулатуре и сердца при мышечной дистрофии Дюшенна (МДД). Кроме того, продолжено исследование молекулярных механизмов, лежащих в основе влияния ингибитора митохондриальной MPT поры алиспоривира на функционирование митохондрий скелетных мышц. При решении первой задачи выяснено, что в митохондриях скелетной и сердечной мускулатуры дистрофин-дефицитных мышей происходит снижение скорости транспорта К+ по сравнению с митохондриями животных дикого типа и количества белка АТФ-зависимого К+ канала (MITOK), а также кальций-зависимого калиевого канала (BKCa). Кроме того, наблюдается снижение общего уровня К+ в митохондриях mdx мышей. При решении второго блока задач исследовано влияние уридина (предшественник природного активатора MITOK УДФ), а также NS1619 (активатор BKCa) на развитие дистрофии Дюшенна и сопутствующей этой патологии дисфункции митохондрий скелетной мускулатуры и сердца. При проведении эксперимента использованы 8-недельные дистрофин-дефицитные мыши (mdx мыши) и мыши дикого типа (контрольная группа), которым вводили уридин и NS1619 внутрибрюшинно в течение 4 недель в дозе 30 мг/кг и 0,5 мг/кг в день, соответственно. Введение уридина или NS1619 привело к увеличению скорости транспорта К+ и содержания иона в митохондриях скелетных мышц и сердца mdx мышей. При этом уридин не влиял на уровень экспрессии гена MITOK. NS1619 восстановил уровень экспрессии гена BKCa в скелетных мышцах mdx мышей до уровня контрольных животных. Отмечено увеличение уровня BKCa и у mdx мышей, получавших уридин. Уридин и NS1619 также способствовали достоверному снижению скорости дыхания митохондрий mdx мышей в состоянии 4, выявлена тенденция к дальнейшему снижению скорости потребления кислорода в фосфорилирующем состоянии (V3) и 3UДНФ. Более того, в случае животных дикого типа введение уридина и NS1619 привело к снижению скорости дыхания митохондрий в состояниях 3 и 3UДНФ. В этом случае применение NS1619 сопровождалось снижением скорости дыхания митохондрий в состоянии 2, а также параметра дыхательного контроля. В случае митохондрий сердца нами отмечено сохранение увеличенной интенсивности дыхания и окислительного фосфорилирования в митохондриях mdx мышей, что проявляется в увеличении скорости дыхания в состоянии V3, скорости разобщенного дыхания, а также параметров дыхательного контроля и ADP/О. При этом введение как уридина, так и NS1619 не привело к изменениям этих параметров. Установлено, что дисфункция митохондрий в скелетных мышцах mdx мышей сопровождается увеличением уровня малонового диальдегида (МДА) в органеллах, что свидетельствует об увеличении интенсивности окислительного стресса в скелетной мускулатуре при МДД. Применение уридина привело к достоверному снижению уровня МДА в митохондриях сердца по сравнению с контрольными mdx животными, в случае скелетных мышц выявлена тенденция к снижению уровня МДА. Введение NS1619 привело к снижению уровня МДА как в митохондриях скелетных мышц, так и сердца. Продемонстрировано, что введение mdx мышам уридина не влияет на кальций-аккумулирующую способность митохондрий скелетных мышц, а также на их устойчивость к индукции MPT поры. В то же время NS1619 вызывает достоверное увеличение кальциевой емкости митохондрий скелетных мышц mdx мышей. Применение этих модуляторов не оказывало влияния на кальций-аккумулирующую способность митохондрий сердца. Выявлено нарушение ультраструктуры митохондрий сердечной и скелетной мускулатуры mdx мышей, которое проявлялось в изменении упаковки крист и развитии гипертрофии. Введение mdx мышам NS1619 привело к нормализации ультраструктуры и размера органелл. Уридин не оказал подобного влияния. Установлено, что при развитии дистрофии Дюшенна происходит снижение экспрессии генов Mfn2 и Ppargc1a, что может свидетельствовать о нарушении митохондриальной динамики и биогенеза. Введение уридина привело к увеличению экспрессии гена Drp1 в митохондриях mdx мышей, что может свидетельствовать об увеличении интенсивности деления органелл. NS1619 не влиял на уровень экспрессии генов, отвечающих за митохондриальную динамику в скелетных мышцах mdx мышей, но увеличивал экспрессию гена Drp1 в мышцах мышей дикого типа, активизируя процессы деления. Оба исследованных агента не влияли на экспрессию гена Ppargc1a, отвечающего за биогенез органелл, и при этом существенно снижали уровень экспрессии этого гена в скелетных мышцах мышей дикого типа. Отмечено, что введение уридина не влияет на экспрессию гена Pink1, но приводит к нормализации уровня Parkin в скелетных мышцах mdx мышей. Таким образом уридин может способствовать восстановлению митофагии в мышцах mdx животных. В этом случае NS1619 не влиял на уровень экспрессии этих генов в мышцах mdx мышей, но значительно повышал экспрессию Pink1 и Parkin в скелетной мускулатуре мышей дикого типа, что также может свидетельствовать об активации митофагии. Выяснено, что применение уридина и NS1619 не оказывает влияния на уровень ферментов-маркеров воспалительного процесса (креатинкиназа, АСТ, ЛДГ) в сыворотке крови и, соответственно, на интенсивность воспаления в мышечной ткани mdx мышей. Уровень фиброза в скелетной мускулатуре, выраженный у mdx мышей, также не изменился. Уридин и NS1619 не оказали влияния на мышечную силу и выносливость животных, а также на уровень псевдогипертрофии в скелетных мышцах mdx мышей. На основе полученных результатов можно сделать вывод о том, что введение уридина и NS1619 mdx мышам приводит к некоторой нормализации митохондриальной функции в скелетной мускулатуре и сердце, что проявляется в улучшении транспорта ионов калия в этих органеллах и снижении интенсивности перекисного окисления липидов их мембран. В случае NS1619 отмечено достоверное улучшение кальций-аккумулирующей функции митохондрий скелетных мышц mdx мышей, а также некоторые положительные изменения в ультраструктуре органелл. Однако указанные эффекты не оказывают влияния на развитие структурных и функциональных нарушений в мышцах mdx животных. В следующей части работы в условиях in vitro было изучено влияние ингибитора митохондриальной Са2+-зависимой MPT поры алиспоривира и его природного предшественника циклоспорина А (ЦсА) на функционирование митохондрий скелетных мышц. Установлено, что оба агента способны дозозависимо угнетать дыхание органелл в фосфорилирущем состоянии (V3). При этом алиспоривир также вызывал значительное снижение скорости ДНФ-стимулированного дыхания, а также снижение дыхательного контроля. Оба агента также снижали коэффициент АДФ/О. Подавляющее влияние ЦсА и алиспоривира также сопровождалось снижением мембранного потенциала (Δψ) митохондрий. Выяснено, что ЦсА и алиспоривир способны снижать общую активность комплексов I+III и II+III дыхательной цепи митохондрий. Действие алиспоривира было несколько более выражено и также проявлялось в снижении активности цитохром с оксидазы. С помощью флуоресцентного зонда лаурдана показано, что такой эффект ЦсА и алиспоривира может быть связан с тем, что эти соединения способны увеличивать микровязкость митохондриальной мембраны и снижать мобильность переносчиков дыхательной цепи и, в частности, кофермента Q. Спектроскопия ЯМР и молекулярная динамика выявила, что структуры ЦсА и алиспоривира имеют много общих черт. Поэтому нами сделан вывод, что различное влияние ЦсА и алиспоривира на функционирование митохондрий не связано со структурными особенностями агентов и может быть обусловлено их различной гидрофобностью, что обуславливает взаимодействие с мембранами органелл. Полученные в ходе этапа результаты свидетельствуют о том, что ЦсА и алиспоривир наряду со специфическим ингибированием МРТ поры в митохондриях способны в высоких концентрациях повышать микровязкость липидного бислоя митохондриальных мембран, что способствует общему ингибированию функционирования мембранных структур этих органелл.

Аннотация результатов, полученных в 2022 году
Согласно поставленным в проекте задачам, за отчетный период была оценена перспективность нового подхода к терапии мышечной дистрофии Дюшенна (МДД), основанного на трансплантации аллогенных митохондрий в скелетную мускулатуру дистрофин-дефицитных мышей. Кроме того, продолжено исследование молекулярных механизмов, лежащих в основе влияния активатора кальций-зависимого калиевого канала (BKCa) NS1619 на функционирование митохондрий скелетных мышц. При решении первой поставленной задачи установлено, что инъекции аллогенных митохондрий в скелетную мускулатуру дистрофин-дефицитных mdx мышей сопровождаются успешной интеграцией органелл в мышечные волокна мышей-реципиентов. Показано, что введение аллогенных митохондрий mdx мышам оказывает существенное влияние на ультраструктуру скелетной мускулатуры мышей-реципиентов – наблюдается нормализация размера саркомеров до уровня мышей дикого типа, отмечается увеличение количества митохондрий в ткани, а также существенное уменьшение их размера. Митохондрии демонстрируют признаки нормализации ультраструктуры (темный матрикс и плотная упаковка крист) по сравнению с контрольными mdx мышами. Выяснено, что митохондриальная заместительная терапия способствует снижению интенсивности циклов дегенерации/регенерации в скелетной мускулатуре mdx мышей, о чем свидетельствует достоверное снижение содержания мышечных волокон с центрально расположенным ядром. Кроме того, отмечено достоверное снижение уровня креатинкиназы в сыворотке крови mdx мышей по сравнению с контрольными mdx животными, что может свидетельствовать о снижении интенсивности воспалительных процессов в мышечной ткани mdx мышей и сохранении целостности клеточных мембран. Показано, что для mdx мышей, получавших инъекции аллогенных митохондрий, характерна тенденция к увеличению мышечной силы в тесте силы хватки (Grip Strength Test) при использовании четырех лап. В случае оценки мышечной силы задних лап животных, в которые производилась инъекция аллогенных митохондрий, различия были достоверными и свидетельствовали о нормализации этого параметра. Установлено, что митохондрии скелетных мышц mdx мышей, получавших инъекции аллогенных митохондрий, характеризуются снижением скорости АDP-стимулированного дыхания (состояние 3) и параметра дыхательного контроля. Наряду с этим также отмечено снижение скорости разобщенного дыхания в состоянии 3UДНФ. Способность митохондрий mdx мышей аккумулировать ионы кальция не изменялась. В то же время нами выяснено, что митохондрии скелетных мышц мышей-реципиентов характеризуются снижением уровня МДА-продуктов по сравнению с контрольными mdx мышами, что может свидетельствовать о снижении интенсивности перекисного окисления и окислительного стресса в скелетной мускулатуре. Исходя из полученных результатов сделан вывод о том, что митохондриальная заместительная терапия может быть использована в терапии МДД. Введение аллогенных митохондрий mdx мышам сопровождается улучшением ультраструктуры скелетной мускулатуры животных, снижением интенсивности дегенеративных процессов, а также улучшением их функции. При этом такой эффект не приводит к изменению параметров, отражающих функциональную активность митохондрий скелетных мышц мышей и, более того, нами отмечено дальнейшее снижение эффективности окислительного фосфорилирования органелл этих животных. С другой стороны, можно отметить снижение интенсивности окислительного стресса в митохондриях mdx мышей-реципиентов, что может способствовать смягчению развития патологии МДД. При выполнении второй поставленной задачи продемонстрировано, что активатор Са2+-чувствительного калиевого канала большой проводимости (ВКСа) NS1619 обладает плейотропным действием и способен также оказывать влияние на функционирование других систем митохондрий. Установлено, что NS1619 дозозависимо подавляет дыхание и окислительное фосфорилирование митохондрий скелетных мышц мышей, энергизованных как в присутствии глутамат/малата (субстраты комплекса I дыхательной цепи), так и сукцината (субстрат комплекса II дыхательной цепи). Такое действие NS1619 обусловлено ингибированием активности комплексов I, III и IV дыхательной цепи органелл, а также АТР-синтазы. Кроме того, NS1619 существенно снижает способность митохондрий поглощать и аккумулировать ионы кальция в матриксе. Предположено, что указанные эффекты NS1619 могут лежать в основе его побочного действия, выявленного нами ранее. Исходя из результатов этого этапа, наших предыдущих и литературных данных, сделан вывод, что in vivo эффект NS1619 обусловлен суммарным действием этого агента на различные митохондриальные и клеточные системы и во многом зависит от особенностей функционирования этих систем в норме и патологии. Это требует тщательного подбора терапевтических концентраций NS1619 и условий его введения в организм.