КАРТОЧКА ПРОЕКТА ФУНДАМЕНТАЛЬНЫХ И ПОИСКОВЫХ НАУЧНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ,
ПОДДЕРЖАННОГО РОССИЙСКИМ НАУЧНЫМ ФОНДОМ

Информация подготовлена на основании данных из Информационно-аналитической системы РНФ, содержательная часть представлена в авторской редакции. Все права принадлежат авторам, использование или перепечатка материалов допустима только с предварительного согласия авторов.

ОБЩИЕ СВЕДЕНИЯ

Номер 20-75-00029

НазваниеРазработка диагностических реагентов на основе наночастиц берлинской лазури для колориметрического анализа

РуководительХрамцов Павел Викторович, Кандидат биологических наук

Организация финансирования, регион Федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего образования "Пермский государственный национальный исследовательский университет", Пермский край

Период выполнения при поддержке РНФ

07.2020 - 06.2022

Конкурс№49 - Конкурс 2020 года «Проведение инициативных исследований молодыми учеными» Президентской программы исследовательских проектов, реализуемых ведущими учеными, в том числе молодыми учеными.

Область знания, основной код классификатора 05 - Фундаментальные исследования для медицины, 05-109 - Клиническая лабораторная диагностика и нанотехнологии в медицине

Ключевые словаиммуноферментный анализ, наночастицы, нанозимы, лабораторная диагностика, иммунохроматография, пероксидаза, берлинская лазурь

Код ГРНТИ62.41.31

СтатусУспешно завершен

ИНФОРМАЦИЯ ИЗ ЗАЯВКИ

Аннотация
К заявке приложен PDF файл с текстом заявки, содержащий иллюстрации!!! Научная проблема, на решение которой направлен проект. Разработка новых реагентов для клинической лабораторной диагностики, которые превосходят существующие материалы. Более конкретно, данный проект направлен на разработку диагностических реагентов, которые могут послужить альтернативой ферментным конъюгатам, используемым в иммуноферментном анализе. Иммуноферментный анализ (ИФА) является одним из ключевых методов современной клинической лабораторной диагностики и повсеместно используется в количественной детекции различных биомаркеров (антител, компонентов вирусов, токсинов, гормонов и т.д.) в физиологических жидкостях, прежде всего в сыворотке и плазме крови. Диагностическим реагентом в иммуноферментном анализе являются конъюгаты ферментов и распознающих молекул, зачастую, моноклональных антител. Наиболее популярным ферментом, играющим роль метки в иммуноферментном анализе, является пероксидаза, получаемая из корней хрена (Armoracia rusticana). Существует ряд недостатков пероксидазы хрена, которые ограничивают спектр ее применений: 1) Относительная дороговизна; 2) Необходимость выделения фермента из растительного сырья, трудоемкость технологии выделения и низкий выход; 3) Гетерогенность очищенного фермента; 4) Чувствительность ферментов к воздействию физико-химических факторов; 5) Деактивация в присутствии некоторых металлом, солей, консервантов. Решение описанной проблемы Для преодоления перечисленных недостатков пероксидазы хрена мы предлагаем использовать в качестве альтернативы этому ферменту наночастицы на основе пористого координационного полимера берлинской лазури (KFe[Fe(CN)6] или Fe[Fe(CN)6]), которые обладают высокой пероксидазной активностью, превосходящей таковою пероксидазы хрена. Они могут превращать в окрашенный продукт те же хромогенные субстраты. Таким образом на их основе могут быть разработаны диагностикумы для колориметрического (цветного, ИФА-подобного) анализа. Основой синтеза наночастиц берлинской лазури с высокой каталитической активностью (нанозимов) является восстановление смеси FeCl3 и K3[Fe(CN)6] (соли трехвалентного железа) перекисью водорода, что отличается от традиционного подхода, который основан на смешивании FeCl3 и K4[Fe(CN)6] или FeCl2 и K3[Fe(CN)6] (соли двух и трехвалентного железа) и приводит к получению намного менее каталитически активных наночастиц. Что конкретно будет сделано в ходе реализации проекта: 1)Будут исследованы факторы, влияющие на результативность синтеза наночастиц берлинской лазури (размеры наночастиц, выход синтеза), на основе полученных данных будет разработана технология синтеза нанозимов различного размера. 2)Будут разработана и оптимизирована технология синтеза диагностических реагентов на основе нанозимов. Поверхность наночастиц будет стабилизирована желатином, к которому ковалентно будут “пришиты” аффинные соединения, в частности стрептавидин и моноклональные антитела. 3)Будут разработаны тест-системы для детекции IgG человека и С-реактивного белка, при помощи которых будет произведена оценка функциональной активности разработанных диагностикумов в сравнении с ферментными диагностикумами. Будет исследована коллоидная и функциональная стабильность конъюгатов на основе нанозимов при хранении. Преимущества нанозимов на основе берлинской лазури как метки в колориметрическом анализе Преимущества наночастиц берлинской лазури: 1) Дешевизна; 2) Высокая стабильность; 3) Высокая каталитическая активность; 4) Воспроизводимость синтеза. 5) Безопасность для человека, окружающей среды и простота утилизации. Преимущества желатина, как материала для покрытия наночастиц: 1) Высокая эффективность стабилизации наночастиц; 2) Дешевизна и доступность; 3) Биосовместимость. Новизна: Высокоэффективные нанозимы на основе берлинской лазури еще не были применены в качестве альтернативы пероксидазе хрена в ИФА, следовательно: 1) Впервые будет проведено систематическое исследование влияния различных факторов на размер и выход синтеза высокоэффективных нанозимов на основе берлинской лазури. 2) Впервые будут синтезированы диагностические реагенты для колориметрических анализов на основе высокоэффективных нанозимов берлинской лазури и желатина, а также разработаны тест-системы на их основе. Впервые будут произведены систематические исследования их стабильности (функциональной и структурной) при длительном хранении.

Ожидаемые результаты
По итогам реализации проекта: 1. Впервые будут получены результаты о влиянии различных физико-химических условий на синтез наночастиц берлинской лазури, обладающих высокой каталитической пероксидазоподобной активностью (нанозимов). На основании полученных данных будут разработаны протоколы синтеза наночастиц берлинской лазури с различным размером. Будет осуществлена оценка воспроизводимости, масштабируемости и эффективности разработанных подходов к синтезу наночастиц. 2. На основе синтезированных наночастиц берлинской лазури с высокой каталитической активностью впервые будут разработаны диагностические реагенты которые смогут выступить в качестве альтернативы традиционно используемым диагностикумам на основе пероксидазы хрена. Будет произведено сравнение эффективности диагностикумов на основе наночастиц берлинской лазури и пероксидазы хрена. Будет проведена оценка коллоидной и функциональной стабильности диагностических реагентов на основе наночастиц. Соответствие результатов мировому уровню: Все полученные результаты будут соответствовать мировому уровню исследований, что подтверждается многочисленными разработками и публикациями последних лет, направленными на использование нанозимов в in vitro и in vivo диагностике, терапии и биотехнологии. Возможность практического использования результатов: Будет сделан вывод о возможности использовании диагностикумов на основе берлинской лазури для создания колориметрических (ИФА-подобных и иммунохроматографических) тест-систем. Полученные данные о воспроизводимости, масштабируемости синтеза диагностикумов на основе наночастиц, их стабильности при хранении и эффективности позволят оценить перспективы их трансляции в реальную клиническую практику, выявить технологические аспекты синтеза диагностикумов, которые нужно усовершенствовать, и сформулировать способы такого совершенствования. Помимо этого, результаты исследования могут быть использованы в смежных областях, в которых используются наночастицы берлинской лазури, прежде всего это in vivo применения: УЗИ, МРТ, фототермальная, фотодинамическая терапия, выведение из организма радионуклидов.

ОТЧЁТНЫЕ МАТЕРИАЛЫ

Аннотация результатов, полученных в 2020 году
Наночастицы берлинской лазури обладают каталитической активностью, аналогичной таковой пероксидазы хрена, т.е. являются нанозимами. В 2018 г. группа химиков кафедры аналитической химии химфака МГУ под руководством профессора Аркадия Карякина продемонстрировал возможность синтеза наночастиц берлинской лазури с повышенной пероксидазоподоной активностью. Особенностью нового метода синтеза являлось восстановление смеси FeCl3 и K3[Fe(CN)6] (соли трехвалентного железа) перекисью водорода, что отличается от традиционного подхода, который основан на смешивании FeCl3 и K4[Fe(CN)6] или FeCl2 и K3[Fe(CN)6] (соли двух и трехвалентного железа). Наночастицы берлинской лазури являются перспективной альтернативой пероксидазе хрена, которая используется в качестве метки в иммуноферментном анализе, на котором основано большинство современных тест-систем для лабораторной диагностики заболеваний. В ходе предварительных испытаний мы установили, что метод синтеза наночастиц берлинской лазури, описанный в публикации [Komkova et al. J. Am. Chem. Soc. 2018, 140, 36, 11302–11307] не позволяет точно контролировать размеры наночастиц (как мы предполагаем, это может быть связано с необходимостью более тщательной ультразвуковой обработки суспензий наночастиц, см. ниже). Таким образом, целью всего проекта было получение диагностических реагентов для колориметрического иммуноанализа на основе наночастиц берлинской лазури, синтезированных методом восстановления и стабилизированных желатином. В первый же год проекта планировалось разработать воспроизводимый метод синтеза наночастиц берлинской лазури разного размера. Итогом проведенных исследований является то, что управлять размерами наночастиц можно разными методами (изменение ионной силы, температуры, соотношения концентраций солей и т.д.), но использование лимонной и особенно щавелевой кислоты позволяет осуществлять достаточно тонкую настройку размеров наночастиц. Большая часть протестированных методов позволяет регулировать размеры наночастиц в пределах до 200 нм, но использование лимонной кислоты дает возможность синтезировать наночастицы размером до 400 нм. Полученные данные были использованы при синтезе партий наночастиц разного размера в увеличенном масштабе. Используя полученные данные о влиянии условий синтеза на размеры наночастиц были подобраны условия синтеза наночастиц разного диаметра. Размеры наночастиц, полученных с использованием перекиси водорода варьировали от 90 до 330 нм. Наночастицы были синтезированы в объеме 250 мл, что в 10 раз больше в сравнении с объемом, использовавшимся при исследовании влияния условий синтеза на размеры наночастиц. В целом, воспроизводимость синтеза с точки зрения размеров наночастиц была хорошей, лишь для партий с наибольшим размером наблюдались отклонения в 10-20 нм от среднего значения. Для большинства партий наночастиц полидисперсность была менее 0,2, что свидетельствует о распределении наночастиц по размерам близком к монодисперсному. Размеры наночастиц практически не изменялись при хранении в воде при температуре +4 °С в течение 5 месяцев . Нескольких партий, которые были синтезированы позже, сохраняли стабильность на протяжении от 1 до 3 месяцев. Таким образом, синтезированные наночастицы можно хранить в виде водной суспензии и использовать при необходимости, что весьма удобно с практической точки зрения. Сорбция желатина на наночастицах берлинской лазури обратно зависела от их размера: для наночастиц размером 90-100 нм она составляла 1 -1,5 мг желатина на мг наночастиц, в то время как для частиц размером 330 нм, она была менее 0,2 мг/мг даже при использовании максимальной концентрации желатина, а при меньшей концентрации так и вообще близкой к нулю. Увеличение длительности сорбции с 1 часа до нескольких часов не влияло на количество сорбированного белка.

Публикации

1. М.Д. Кропанева , П.В. Храмцов, М.Б. Раев НАНОЗИМЫ НА ОСНОВЕ БЕРЛИНСКОЙ ЛАЗУРИ И ИММУНОАНАЛИЗ Актуальная биотехнология (МАТЕРИАЛЫ VII МЕЖДУНАРОДНОЙ НАУЧНО-ПРАКТИЧЕСКОЙ КОНФЕРЕНЦИИ «БИОТЕХНОЛОГИЯ: НАУКА И ПРАКТИКА»), Актуальная биотехнология №3 (34), 2020, с. 294-296 (год публикации - 2020)

Аннотация результатов, полученных в 2021 году
Пришивку различных распознающих молекул к наночастицам проводили при помощи глутаральдегида. Смесь наночастиц и желатина добавляли к концентрированному раствору глутарового альдегида с нейтральной рН. Глутаровый альдегид реагировал с первичными аминами желатина, что приводило к перекрестной сшивке желатиновых молекул, сорбированных на поверхности желатина, а также к появлению на поверхности наночастиц свободных карбонильных групп. После удаления избытка желатина и альдегида наночастицы смешивали с целевыми распознающими молекулами (стрептавидином, моноклональынми антителами и т.д.), молекулы которого ковалентно пришивались к наночастицам за счет реакции аминогрупп белка и карбонильных групп наночастиц. После удаления избытка распознающих молекул получали стабильные водные суспензии наноконъюгатов. В ходе исследований мы оптимизировали условия конъюгирования, а именно рН, температуру, ионную силу и длительность. Кросс-сшивка желатина глутаровым альдегидом является необходимой для предотвращения его десорбции с поверхности наночастиц берлинской лазури. Синтезированные наночастицы имели гидродинамический диаметр около 200 нм и индекс полидисперсности ниже 0,2, что свидетельствует об их относительной однородности. Оптимальная соотношение распознающих молекул и наночастиц составило 80-100 мкг/мл по массе. Мы исследовали те свойства синтезированных конъюгатов, которые являются наиболее существенными для их практического применения. Оптимальными режимом использования диагностикумов является длительное хранение в воде с последующим приготовлением рабочих растворов непосредственно перед анализом. Желатиновое покрытие обеспечивает коллоидную стабильность наночастиц в широком диапазоне рН – от 3 до 8, дзета-потенциал менялся от +26 (при рН 3) до -14 мВ (при рН 7). По всей видимости, стабильность наночастиц обеспечивается не электростатическим отталкиванием, а другими типами взаимодействий (например, стерические препятствия, гидратное отталкивание). При хранении в течение 7 месяцев в воде размер наночастиц и их гетерогенность оставались неизменными. Функциональная активность их также оставалась на прежнем уровне. Микроскопическое исследование наночастиц показало, что они имеют неправильную форму и достаточно гетерогенны. Модификация поверхности наночастиц берлинской лазури желатином привела к снижению их специфической каталитической активности примерно в три раза, что связано со снижением доступности молекул субстрата. Были сконструированы модельные системы планшетного колориметрического анализа, дот-иммуноанализа и иммунофильтрационного анализа, предназначенные для прямой детекции Би-БСА, антител к столбнячному анатоксину, ПСА и С-реактивного белка. В качестве диагностикумов в этих тестах использовались модифицированные желатином наночастицы берлинской лазури, конъюгированные со стрептавидином, белком G стрептококка, а также моноклональными антителами против IgG человека, ПСА и С-реактивного белка. Помимо этого, были синтезированы конъюгаты наночастиц с БСА, использованные в качестве отрицательного контроля.

Публикации

1. П.В. Храмцов, М.Д. Кропанева, А.С. Минин, М.С. Бочкова, В.П. Тимганова, А.С. Максимов, А.Ю. Пузик, С.А. Заморина, М.Б. Раев Prussian blue nanozymes with enhanced catalytic activity: size tuning and application in ELISA-like immunoassay Nanomaterials, - (год публикации - 2022)

2. П.В. Храмцов, М.Д. Кропанева, М.С. Бочкова, В.П. Тимганова, Д.М. Кисельков С.А. Заморина, М.Б. Раев Synthesis and application of albumin nanoparticles loaded with prussian blue nanozymes Colloids and Interfaces, - (год публикации - 2022)

Возможность практического использования результатов
не указано