Аннотация результатов, полученных в 2020 году
План проекта на первый год выполнен в полном объеме В ходе выполнения проекта, были исследованы различные красители как фотоакустический и флуоресцентный компонент для контрастных агентов. Стабильность под влиянием различных полимеров, их спектральные характеристики были рассмотрены для каждого красителя. Была отмечена возможность формирование J- и H- агрегатов для метиленового синего и индоцианина зеленого (ICG). Далее предварительно была рассмотрена возможность включение каждого красителя или их смесей, агрегатов на биодеградируемую оболочку BSA/TA. Были рассмотрены фотоакустические и флуоресцентные характеристики полученных контрастных агентов. На основе полученных данных в качестве перспективных были выбраны ICG и J-ICG в качестве перспективного компонента для контрастных агентов. Более детально были исследованы эффективные методы включения ICG и J-ICG в состав оболочки BSA/TA. Полученные данные показали, что наиболее эффективным методом для включения ICG на слой BSA является метод ИКА (FIL), что приводило к высокой загрузке ICG и соответственно, фотоакустическим и флуоресцентным свойствам. В случае с J-ICG, лучшим методом для загрузки оказался метод ИКА на слой дубильной кислоты (ТА). Было отмечено, что после формирования агрегата ICG сохранял свой отрицательный заряд, однако, изменял конформацию вследствие чего отсутствовала возможность связывания J-ICG с BSA. Предпринятые попытки осуществить включение агрегата через электростатические взаимодействия с Parg привела к разложению пика. Для полученных оптимальных образцов были исследованы фотоакустические и флуоресцентные свойства. ICG-FIL показал хорошие фотоакустические (785 нм) и флуоресцентные свойства. J-ICG FIL показал хорошие фотоакустические характеристики как при 785 нм, так и 900 нм. При исследовании стабильности полученных контрастных агентов в различных физиологических средах, была отмечена возможность детекции момента разрушения контрастных агентов с J-ICG, ввиду его постепенного разрушения и изменения спектра до исходного ICG и ввиду этого, увеличения сигнала флуоресценции в области 785 нм. Для обеспечения наведения и визуализации в МРТ установке, были получены контрастные агенты с включением частиц магнетита. Для увеличения загрузки частицами магнетита нами был оптимизирован для данных носителей метод ИКА (FIL). Для подбора оптимальной концентрации для визуализации и возможности передвижения, варьировали концентрацию магнетита. Скорость передвижения частиц была пропорциональна концентрации магнитных частиц в них. Наибольшую скорость релаксации R2 показали образцы 2 и 1.5, так как они содержат наибольшее количество наночастиц магнетита. Частицы 1.5 обладают большей интенсивностью флуоресценции, чем образец 2 и при этом скорость релаксации R2 данных образцов сопоставимы (то есть релаксивность образца 1.5 выше релаксивности образца 2). Таким образом образец 1.5 5 (с концентрацией магнетита в частицах 0,018 мг/мл) оказался оптимальным с точки зрения мультимодальности. Так, для дальнейших исследований будем рассматривать следующие комбинации: 1,5 MNP BSA/TA контрастные агенты J-ICG и ICG, и 1,5MNP BSA/TA с высокими загрузками ICG. Для получения модифицированных частицами лимфоцитов, помимо рассматриваемых ранее структур также были получены частицы 300 нм и их сжатая до 150 нм форма. Для обеспечения возможности сжатия полученных структур вместо термочувствительной пары была использована пара Parg/Dex. Полученные структуры были исследованы на взаимодействие с лимфоцитами. 300 нм и 150 нм частицы были обнаружены, как на мембране, так и внутри клеток, что говорит об их превосходных поверхностных качествах, так как процесс загрузки частиц внутрь клеток лимфоцитов считается крайне сложной задачей, требующий использования частиц с очень маленьким размером и требуемыми механическими свойствами. В то время, как 500 нм частицы не были обнаружены внутри клеток, но большое количество адгезировалло на поверхность клеточной мембраны, что также делает их интересным объектом для различных применений. Были исследованы цитотоксические свойства полученных контрастных агентов. В результате исследования было установлено, что все исследуемые мультимодальные частицы в количестве 10, 50, 100, 250, 500 частиц на клетку после 24 и 48 часов совместной инкубации не оказывали значимого цитотоксического эффекта на культуры клеток NIH и 4T1. При исследовании интернализации полученных частиц, было отмечено, что после суточной совместной инкубации мультимодальных носителей с клетками культур NIH и 4T1, 48,3 и 46,5 % частиц были поглощены клетками или адсорбировались на них, соответственно. Был разработан протокол получения метастазирующей модели раковой опухоли на основе клеточной линии 4Т1. Клеточная линия 4Т1 проверена на туморогенность с определением оптимальной прививочной дозы в экспериментальной линии мышей BALB/c. Проведено исследование роста опухолей. Проведен гистологический анализ образцов лимфатических узлов и некоторых других органов, в которые потенциально метастазируют клетки 4Т1. По результатам анализа роста опухолей и гистологического исследования образцов на предмет способности опухолевых клеток 4Т1 к метастазированию в них подобрана метастазирующая модель раковой опухоли. Разработанная модельная система на экспериментальных животных in vivo и отработанные методические подходы позволят в дальнейшем провести тестирование контрастных агентов. Разработан двухслойный микрофлюидный чип, который выступает в качестве модели лимфатического узла. В каждом слое чипа сформирован входной и отводящий канал, которые соединены в центральной части чипа сквозным резервуаром цилиндрической формы, ограниченного с двух сторон герметизирующими покровными стёклами и разделённого в центральной части мембраной, которая разделяет верхние и нижние каналы микрофлюидного чипа. В данной системе, мембрана выступает в качестве клеточной подложки, на которой будет культивироваться монослой эндотелиальных клеток, которые в свою очередь моделируют внутренний слой клеток лимфатического сосуда\узла и выступают в качестве фильтрующей мембраны. Подобрана мембрана для клеток на основе гидрогеля геллановой камеди. В ходе работы были опубликованы 2 статьи в журналах Q1, еще одна статья: M.A. Kurochkin, S. V. German, A. А. Abalymov, D. А. Vorontsov, D.A. Gorin, M.V Novoselova: "Combination of imaging technique and contrast agents for sentinel lymph node detection: state of art and perspectives" Journal of Biophotonics, находится на рецензии и одна статья «Submicron BSA/TA contrast agents with Indocyanine Green J-Aggregates» подготовлена для подачи.

Аннотация результатов, полученных в 2021 году
План проекта на второй год выполнен в полном объеме В ходе выполнения второго года проекта были продолжены исследования по контрастным агентам с J-ICG. Была собрана оптическая система для решения проблемы с определением флуоресцентного сигнала с J-ICG. Была оценена визуализация разработанных носителей на современных интраоперационных установках. Далее были проведены in vivo и ex vivo исследования контрастных агентов на основе ICG и J-ICG на фотоакустических и флуоресцентных установках. На основе полученных данных показана возможность детектирования контрастные агентов, а также управления биораспределением и временем выведения в зависимости от вида ICG (исходная форма, агрегированная или капсулированная). Следующим шагом в разработке контрастных агентов являлось обеспечение селективности их действия для раковых клеток. Для этого было рассмотрено 2 подхода: 1) модификация с помощью DARPin к HER2/neu рецептору 2) использование 5-ала кислоты. Так, была успешно проведена модификация полученных контрастных агентов DARPin продемонстрирована их селективность действия на 3D-клеточных структурах – сфероидах. Было показано отсутствие связывания частиц (модифицированных и немодифицированных DARPin) со сфероидом, полученным из NIH клеток. Однако, капсулы захватывались 4Т1 сфероидом, причем в случае модифицированных капсул было замечено значительное количество контрастных агентов внутри сфероида, в то время как немодифицированные частицы адсорбировались в основном на поверхности сфероида. Была продемонстрирована способность селективного воздействия 5-ала кислоты при концентрациях 1.25мМ-15мМ на раковые клетки, в частности рака молочной железы (по сравнению с эпителиальными здоровыми клетками). Далее были использованы различные подходы и методики для получения контрастных агентов, содержащих 5-ала кислоту. В результате, наиболее перспективными оказались образцы, полученные путем включения 5-ала при термосжатии капсулы и при использовании «core-shell» структуры. Полученные данные также показали более низкую эффективность 5-ала в капсулах по сравнению с исходным раствором, что скорее всего связано с тем, что 5-ала весьма нестабильна и может разрушаться в процессе получения капсул. Далее были проведены исследования цитотоксичности модифицированных частиц на различных культурах, в результате которых цитотоксичного воздействия на клетки выявлено не было. При конструировании и доработке модели микрофлюидного чипа лимфатического узла, для более тщательного понимания структуры лимфатического узла и локализации метастазов, на базе Нижегородского Областного Клинического Онкологического Диспансера (ГБУЗ НО НОКОД) было проведено гистологическое исследование образцов лимфатических узлов пациентов с раком молочной железы, в результате которого были получены данные, необходимые для чипа. Далее были подобраны материалы для конструирования чипа с точки зрения их токсичности для клеток. В результате проекта было разработано 2 модели микрофлюдного чипа: 1) проточный чип конструкции №1, который моделирует участок лимфатического узла, предназначенный для изучения доставки через эндотелиальный барьер при помощи функционализированных лимфоцитов (разработанный чип позволял формировать монослои клеток с 2 независимыми проточными каналами по обе стороны клеточной мембраны), 2) чип конструкции №2, который моделировал структуру лимфатического узла с метастазирующими клетками. Данная конструкция была выполнена в виде быстроразборного проточного микрофлюидного чипа, полость которого формировала канал, в центр канала был установлен пористый вкладыш из коллагена (полученный по оптимизированной технологии) имитирующий пористую структура лимфатического узла, в центре которого был помещен исследуемый сфероид из клеток 4Т1. Таким образом поток жидкости поступал по каналу и проходя через пористый вкладыш взаимодействовал с исследуемым сфероидом, который имитировал метастазы в лимфатических узлах. Далее была исследована селективность накопления частиц на модели лимфатического узла. Согласно полученным результатам, частицы размером 300, 500 нм и 3.5 мкм имели хорошее распределение в коллагеновой матрице. Частицы и клетки проходили сквозь коллагеновую матрицу по каналам, образованным в результате заморозки раствора полимера. Так, 300 нм нанокапсулы были замечены в основном в центре и прицентральной зоне сфероида. На поверхности сфероида частицы обнаружены не были, что позволило говорить нам о том, что клетки достаточно быстро поглощали частицы данного размера и аккумулировали их в центре микроткани. Частицы размером 500 нм и 3.5 мкм так же были обнаружены в центре сфероида, что подтверждали ортогональные проекции сфероида, однако, количество частиц данного размера значительно меньше, что подтвердило перспективность использования носителей 300 нм и меньше. Был продемонстрирован захват лимфоцитов, функционализированных магнитными контрастными агентами из потока крови с помощью электромагнитного пинцета. Для визуализации течения форменных элементов крови в модельных капиллярах и магнитного захвата функционализированных лимфоцитов линии Jurkat при помощи электромагнитного пинцета была собрана экспериментальная установка на базе инвертированного микроскопа. Смесь лимфоцитов после 2 ч инкубации с магнитными 300 нм частицами, ресуспендированную в цельной крови прокачивали через модельный капилляр при помощи шприцевого насоса. После активации магнитного пинцета, в пристеночной области капилляра, где располагались концентраторы электромагнитного пинцета, формировалась зона с захваченными лейкоцитами, которые захватывались из потока посредствам их движения по градиенту магнитного поля в сторону к концентраторам электромагнитного пинцета. Показано, что лимфоциты функционализированные магнитными частицами захватываются в цельной крови точно также, как и в деионизированной воде при помощи электромагнитного пинцета и под действием магнитного поля формируют зоны высокой концентрации эритроцитов одинаковой формы в воде и в цельной крови. Был проведен анализ биораспределения и выбор подходящих контрастных агентов для дальнейшей работы (исследования in vivo). Так, в исследование оценили биораспределение следующих размеров немодифицированных контрастных агентов: 100-200, 300, 500-700 нм и 3-5 мкм. Визуализация отдельных органов показала, что больше всего капсул в точке 1 ч накапливается в печени, а распределение по другим органам зависит от размера частиц. Для 100-200 и 300 нм частиц характерно накопление в печени и лишь небольшая часть приходилась в равной степени на легкие и почки. Для 500 нм и 3-5 мкм частиц характерно накопление почти в равной степени в печени и легких. Конъюгированный раствор BSA-Cy5 по достижению 1 ч с момента инъекции распределился по органам (расположены в порядке убывания сигнала): печень, легкие, почки, сердце и селезенка, что может быть объяснено относительно малым размером данного коньюгата. Сигнал в лимфатических узлах коррелировал с размером частиц, которые были инъецированы, т.е. чем меньше размер частиц, тем больше детектировался сигнал и наоборот, с увеличением размера частиц уровень сигнала падал. Для обеспечения более эффективной доставки также решено было рассмотреть возможность инъекции носителей в межпальцевые промежутки. Как показывают полученные данные, доставка и скорость движения контрастных агентов в лимфатический узел с помощью такого способа инъекции также зависела от размера носителей. Наиболее перспективными в рассматриваемый промежуток времени оказались частицы PB и BSA-Cy5, 150 нм, в то время как частицы более 300 нм преимущественно задерживались в месте инъекции (лапе). Таким образом, размер частиц непосредственно оказывает влияние на их биораспределение в органах. Результаты будут представлены на конференции Всероссийская конференция «Синтетическая биология и биофармацевтика», Новосибирск (июль, 2022) и XXXIV Симпозиум «Современная химическая физика», Туапсе (сентябрь, 2022).

Аннотация результатов, полученных в 2022 году
В ходе выполнения третьего года проекта были продолжены исследования по оценке потенциала различных частиц для детекции сторожевых лимфатических узлов. Были получены данные о селективности накопления модифицированных DARPin EpCAM частиц в лимфатическом узле с помощью оптимизированной версии микрофлюидного чипа, а также in vivo на мышиной модели метастатического рака с помощью флуоресцентной томографии. Так, была успешно продемонстрирована их селективность действия на 3D-клеточных структурах – сфероидах в микрофлюидном чипе. Модель лимфатического узла, разработанная в ходе выполнения 1 и 2 этапов проекта была оптимизирована, и после была исследована селективность накопления частиц (DARPin- и DARPin+). Согласно полученным результатам, частицы DARPin+ отлично задерживались и накапливались в сфероидах, в то время как частицы DARPin- проходили через сфероид и был отмечен их поток из лунки. Как показали данные проточной цитометрии трипсинизированных сфероидов, после прохождения частиц через микрофлюиный чип, только 24% клеток 4Т1 сфероидов содержали частицы, в то время как в случае с DARPin+ частицами – 95%. При in vivo и ex vivo исследовании указанных частиц (DARPin+ и DARPin-) на модели метастатического рака, было показано, что оба варианта частиц подходят для визуализации лимфатического узла. Однако, функционализация с помощью DARPin необходима для накопления и удерживания частиц в метастазированном лимфатическом узле – косвенной идентификации метастазирования. Полученные данные подтверждены с помощью гистологии и были сопоставлены с распределением красителя ICG, используемого в клинике. Где ICG показал более скоротечное удерживание в лимфатическом узле и быстрое распространение по всему организму. Была продолжена работа с 5-ала кислотой, как одной из возможностей обеспечения селективности к раковым клеткам. Для оценки эффективности новых капсул было рассмотрено их взаимодействие с клетками 4Т1 и NIH в течение 48 часов. Согласно полученным данным, капсулы с 5-ала работали после инкубации клеток с частицами с 24 ч, в то время как раствор 5-ала действует уже в точке 2-4 часа, что объясняется более медленным релизом 5-ала и деградацией капсулы. При этом, при взаимодействии частиц с клетками NIH флуоресценция клеток отсутствовала, что позволяет говорить о селективности действия 5-ала. Также, схожие результаты были продемонстрированы на 3D-клеточных сфероидах, в том числе слитых. С целью исследовать возможность детекции опухолевой ткани и в частности наличия метастаз в лимфатическом узле были проведены in vivo исследования по воздействию 5-ала кислоты, а также частиц с 5-ала кислотой. Согласно представленным данным, действие 5-ала кислоты проявлялось по достижению 1-2 ч с постепенным уменьшением сигнала с течением времени. При вскрытии области опухоли можно было отметить соответствие области действия 5-ала и опухолевой ткани, что косвенно позволяло говорить об специфичности 5-ала раствора. При введении частиц, содержащих 5-ала кислоту, уровень сигнала был значительно ниже по сравнению с введением исходного раствора, что возможно связано с трудностями высвобождения 5-ала кислоты (к примеру скорость и концентрация высвобождаемого вещества может быть достаточно небольшими). Также была проведена оценка возможности использования опухоль-ассоциированных лимфоцитов для детектирования сторожевых лимфатических узлов и опухоли. Исследования in vivo проводились на полученных мышах с опухолями 4T1. Как показали результаты, при достижении 24 ч точки Т-лимфоциты специфично накопились в месте опухоли и сторожевого лимфатического узла. Однако, лимфоциты, связанные с Су7 капсулами данный результат повторить не смогли, что может быть связано с несколькими причинами. В связи с чем, данная работа требует дополнительных исследований. Бвла разработана система анализа эффективности проницаемости клеточных мембран на основе разборной модульной системы культуральных вкладышей, которые изготавливались методом 3D печати. Данный подход позволяет тестировать и оценивать эффективность различные системы адресной доставки лекарственных средств проникать через естественные клеточные барьеры. Исследование показало, что магнитное поле может использоваться для улучшения проникновения магнитных частиц через клеточные барьеры. Кроме того, концентрация частиц также оказывает влияние на эффективность проникновения клеточных мембран. Также был изучен потенциал новых наночастиц на основе наночастиц берлинской лазури. C целью изучения потенциала применения наночастиц берлинской нами были получены частицы размером 35 нм методом каталитического синтеза, стабилизированные путем покрытия оболочкой (BSA/TA)2. В зависимости от метода очистки от несвязавшихся компонентов были получены наночастицы размером 100-120 нм и 200-300 нм. Было показано, что данные частицы обладают контрастирующей способностью с помощью оптоакустической томографии и могут быть потенциально использованы для визуализации области интереса (в данном случае лимфатического узла) при введении животным. Было показано, что данные частицы эффективно визуализируют лимфатические узлы уже через 1,5 часа после введения с максимумом накопления на 3 ч. Также данные частицы показали возможность контрастирования с помощью оптоакустической томографии. Полученные данные позволяют предположить высокую эффективность PB наночастиц в качестве перспективного контрастного агента для визуализации лимфатических узлов методом оптоакустической томографии. Также были продолжены исследования по контрастным агентам с J-ICG. Были более детально изучены фракции J-ICG. Удалось получить спектры флуоресценции J-агрегатов. Были исследованы смеси ICG и J-агрегата в различных сочетаниях (смешанные растворы ICG и J-ICG и раздельное инкапсулирование). Показано, что возбуждение ICG может приводить к реабсорбции его флуоресценции J-агрегатом и тем самым может возбуждать последний. В основном, это означало передачу энергии от ICG к J-ICG. Также, был отмечен пик флуоресценции при 1055 нм как для капсул со смесью, так и для капсул только с J-ICG или ICG. Результаты проекта были опубликованы в журналах Q1 и представлены на конференциях: «Annual international conference, saratov fall meeting XXVI» и XVIII международная научно-практическая конференция «Новые полимерные композиционные материалы», 4-9 июля 2022 г. / п.Эльбрус, Россия.