КАРТОЧКА
ПРОЕКТА ФУНДАМЕНТАЛЬНЫХ И ПОИСКОВЫХ НАУЧНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ,
ПОДДЕРЖАННОГО РОССИЙСКИМ НАУЧНЫМ ФОНДОМ
Информация подготовлена на основании данных из Информационно-аналитической системы РНФ, содержательная часть представлена в авторской редакции. Все права принадлежат авторам, использование или перепечатка материалов допустима только с предварительного согласия авторов.
ОБЩИЕ СВЕДЕНИЯ
Номер 20-74-10076
НазваниеГенетическая и эколого-биохимическая паспортизация и разработка оптимальных технологий культивирования водорослей и цианобактерий для получения биологически активных метаболитов
РуководительМальцев Евгений Иванович, Доктор биологических наук
Организация финансирования, регион Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт физиологии растений им. К.А. Тимирязева Российской академии наук, г Москва
| Период выполнения при поддержке РНФ | 07.2020 - 06.2023 |
Конкурс№50 - Конкурс 2020 года «Проведение исследований научными группами под руководством молодых ученых» Президентской программы исследовательских проектов, реализуемых ведущими учеными, в том числе молодыми учеными.
Область знания, основной код классификатора 04 - Биология и науки о жизни, 04-102 - Ботаника
Ключевые словаСкрининг, водоросли, коллекция культур, биотехнология, эколого-биохимический паспорт, технологическая карта, общие липиды, жирные кислоты, витамины, пигменты, номограмма, стрессирование, культивирование, кривые роста, биореактор
Код ГРНТИ62.09.00, 62.09.39, 69.25.15
СтатусУспешно завершен
ИНФОРМАЦИЯ ИЗ ЗАЯВКИ
Аннотация
Конкурентоспособность экономик будущего неразрывно связана с внедрением биотехнологических разработок, которые открывают новые возможности повышения продуктивности сельского хозяйства и обеспечения продовольственной безопасности. Переход к высокопродуктивному и экологически чистому агро- и аквахозяйству является одной из первостепенных задач для повышения качества и продолжительности жизни каждого отдельного человека и населения страны в целом. Именно характер продовольствия, как базовый показатель жизнедеятельности человека, выступает основным индикатором социально-экономического развития страны.
Обеспечение увеличения производства продуктов питания в ситуации невозможности роста посевных площадей, что связано как климатическими ограничениями, так и необходимостью сохранять баланс с территориями под природными экосистемами, – это задача, которая выходит за пределы возможностей традиционных ресурсов растениеводства и животноводства. Так, для решения проблемы обеспечения необходимых объемов кормов может быть задействован потенциал фотосинтезирующих микроорганизмов – водорослей и цианобактерий, способных синтезировать ценные биопродукты в короткие сроки. Учитывая, что среди водорослей есть представители, накапливающие в больших количествах белки, углеводы и липиды, а также имеющие высокое содержание в биомассе витаминов, соединений обладающих антиоксидантными свойствами, микроэлементов и др. биологически активных метаболитов, использование их в качестве микро- или объемного ингредиента в кормах на сегодняшний момент рассматривается как альтернативный путь удовлетворения спроса на корма в сельскохозяйственной промышленности.
Данный проект предусматривает выполнение исследований по скринингу разных групп водорослей и цианобактерий на основе Коллекции культур водорослей и цианобактерий лаборатории Молекулярной систематики водных растений Института физиологии растений им. К.А. Тимирязева РАН для выявления новых, коммерчески перспективных продуцентов липидов и других ценных биопродуктов, которые могут быть использованы в качестве сырья при производстве кормов и подкормок для агро- и аквахозяйств, разработки для них эколого-биохимических паспортов и технологических карт культивирования.
Для достижения цели поставлены следующие задачи, последовательное выполнение которых позволит протестировать значительный объем штаммов водорослей и цианобактерий и создать эколого-биохимические паспорта для наиболее производительных штаммов, разработать технологические карты их культивирования как в лабораторных, так и промышленных масштабах, а также подобрать оптимальные условия подготовки и хранения биомассы отобранных штаммов:
1. Проанализировать принадлежность штаммов водорослей и цианобактерий к филогенетическим кладам и линиям, для которых уже отмечена генетическая предрасположенность к повышенному накоплению липидов (в том числе полиненасыщенных жирных кислот), белков (в том числе незаменимых аминокислот), пигментов (в т.ч. β-каротина), витаминов и ферментов с антиоксидантной активностью.
2. Провести культивирование в накопительном и квазинепрерывном режиме в лабораторных условиях отобранных штаммов для определения в ходе экспоненциальной и стационарной фаз автотрофного роста темпов накопления биомассы, продуктивности и количества сухого вещества. Составить номограммы для режимов освещения, температуры, рН и состава питательных сред.
3. Определить биохимические характеристики: общее содержание липидов, триглицеридов и белков (в том числе незаменимых аминокислот); пигментов (хлорофиллов, β-каротина), витаминов (A, E). Оценить активность ферментов с антиоксидантной активностью (каталазы, супероксиддисмутазы и др.). Проанализировать состав жирных кислот, при этом особое внимание будет уделено содержанию омега-3 полиненасыщенных жирных кислот (α-линоленовой, стеаридоновой, эйкозапентаеновой и докозагексаеновой), достаточное количество которых позволяет повышать ценность кормов и подкормок.
4. Провести эксперименты по стрессированию во время культивирования для ускорения темпов накопления биомассы и увеличения содержания ценных метаболитов. В качестве стрессовых условий будет использовано увеличение концентрации всех макро-, микро- и ультрамикроэлементов в культивируемой среде в 10 раз, исключение из среды азота, исключение из среды фосфора, одновременное исключение из среды азота и фосфора, а также эксперименты с интенсивностью освещения и величиной pH питательной среды.
5. Провести культивирование отобранных штаммов водорослей и цианобактерий в биореакторах закрытого типа для оценки способности накопления ими больших объемов биомассы.
6. Проанализировать интенсивность процессов пероксидного окисления липидов в биомассе водорослей и цианобактерий при ее длительном хранении и разных видах ее подготовки (лиофильной, тонкослойной и солнечной сушке, замораживании).
Успешная реализация поставленных задач возможна благодаря:
– наличию в коллекции штаммов из основных группы водорослей, а именно диатомовых, зеленых, желтозеленых, эустигматофитовых, золотистых и криптофитовых, а также цианобактерий, что позволит отобрать с помощью скрининга наиболее перспективные штаммы в каждой группе;
– представленности в коллекции штаммов из родов зеленых водорослей Bracteacoccus, Chlorella, Chlamydomonas, Chlorococcum, Coccomyxa, Parietochloris и Scenedesmus; эустигматофитовых Eustigmatos, Pseudocharaciopsis и Vischeria; желтозеленых Pleurochloris; диатомовых Amphora, Aulacoseira, Halamphora, Navicula, Nitzschia и Synedra; цианобактерий Desmonostoc, Nodularia и Nostoc, среди представителей которых уже известны биотехнологически ценные штаммы;
– включению в коллекцию штаммов, выделенных из широчайшего спектра экотопов: от пресных до соленых водоемов, в том числе и гиперсоленной рапы, почвенных и эпифитных, что позволит исследовать штаммы водорослей с разной экологической валентностью;
– депонированию штаммов, представляющих разнообразные географические зоны не только Северного полушария, но и Южного – основными регионами пополнения коллекции являются Россия (Алтай, Байкальский регион, Волжский бассейн, Дальний Восток, Карелия, Москва, Северный Кавказ), Вьетнам, Индонезия, Монголия, Япония, Эфиопия, Украина – это даст возможность тестировать штаммы, представляющие географически отдаленные популяции и, возможно, обладающие разными физиологическими и биохимическими свойствами;
– полученным нуклеотидным последовательностям генов 18S рДНК, 28S рДНК, rbcL, ITS2 (эукариоты) и 16S рДНК, 23S рДНК и ITS (цианобактерии) для многих штаммов – это станет основой для установления принадлежности исследуемых штаммов к филогенетическим кладам, в составе которых уже отмечены высокопродуктивные представители с точки зрения накопления ценных биоактивных метаболитов.
Именно сочетание молекулярно-генетических, морфологических, физиологических и биохимических методов позволит нам отобрать и поддерживать набор биотехнологически ценных штаммов из разных групп водорослей и цианобактерий, которые будут иметь высокие темпы роста и накопления биомассы, характеризоваться высоким процентным содержанием липидов, а также необходимым составом жирных кислот, белков (в том числе незаменимых аминокислот), пигментов, витаминов и ферментов с антиоксидантной активностью. Исследование интенсивности процессов пероксидного окисления липидов в биомассе водорослей и цианобактерий позволит установить время начала накопления в ней вторичных продуктов липопероксидации. На основании этого будут предложены оптимальные способы подготовки и условия хранения биомассы, позволяющие как можно долго сохранять максимальное количество доступных метаболитов.
Разработанные эколого-биохимические паспорта штаммов микроводорослей и технологические карты условий культивирования, апробированные в модельных закрытых биореакторах, создадут надежную платформу для их промышленного использования. Внедрение в производство данных штаммов станет не только новым шагом в повышении эффективности использования биоресурсов, но и позволит улучшить качество и уменьшить себестоимость кормов и подкормок для сельского хозяйства, стимулировать рациональное использование природных ресурсов.
Ожидаемые результаты
Разработанные в результате выполнения проекта научно-практические решения направлены на реализацию государственной политики в сфере повышения продуктивности агро- и аквахозяйства и обеспечения продовольственной безопасности. Выполнение проекта позволит достичь таких социальных и экономических эффектов как улучшение системы управления индустрии кормов, способствующей уменьшению проявлений ресурсного и экологического кризиса через предоставление актуальных научно обоснованных данных о продукционных показателях микроводорослей и технологии их культивирования, а также формирования коллекции высокопродуктивных штаммов микроводорослей и цианобактерий, которые могут быть использованы для биотехнологических целей исследовательского характера, промышленного использования и стать основой альтернативных кормов и ценных прикормок.
Предполагаемый проект станет существенным дополнением в мировую науку в части изучения способностей микроводорослей продуцировать ценные биологически активные соединения с привязкой к современным филогенетическим реконструкциям, установлении диапазонов откликов штаммов на воздействии стрессирующих факторов. Это позволит оптимизировать дальнейший поиск ценных в биотехнологическом аспекте видов, предсказывать состав и количество жирных кислот и других ценных соединений согласно положению в соответствующих филогенетических кладах, что важно для расширения практики научно обоснованного использования биомассы водорослей в различных отраслях народного хозяйства, а также для развития филогенетических исследований с учетом биохимических характеристик клад и таксонов. Это позволит анализировать метаболические пути в филогенетических деревьях, проводить сравнительный анализ генотипов.
1. Результатом работы будет выявление наиболее продуктивных, в контексте накопления мононенасыщенных, полиненасыщенных и насыщенных жирных кислот, белков и незаменимых аминокислот, витаминов Е, А и других биопродуктов с антиоксидантной активностью штаммов водорослей и цианобактерий с привязкой к современным филогенетическим реконструкциям.
2. Накопление биомассы. Для исследуемых штаммов будет охарактеризована кинетика роста, установлено время наступления лаг-фазы и стационарной фазы с разработкой номограмм по выбору режимов освещения, температуры, рН и состава питательных сред. Будут определены: продуктивность биомассы (мг л/сутки) и максимальные величины накопления сухого вещества в конце культивирования (г/л).
3. Общее количество липидов. Для тестируемых штаммов будет установлено общее количество аккумулированных липидов. Планируется создание выборки биотехнологически перспективных штаммов водорослей с показателями общего содержания липидов не ниже 55%, что было бы сопоставимо с другими высокоэффективными штаммами микроводорослей, например, Schizochytrium sp. (77,5% сухого веса) (Yaguchi et al. 1997), Rhopalosolen saccatus (до 70 %) (Challagulla et al. 2015) и Nannochloropsis oceanica (64,3%) (Wan et al. 2013).
4. Состав жирных кислот. Для исследуемых штаммов будет определен состав жирных кислот с помощью газовой хроматографии. Планируется выделить группу штаммов, которые бы характеризовались содержанием не менее 60% мононенасыщенных жирных кислот, 20% полиненасыщенных или не менее 20% насыщенных кислот от общего количества жирных кислот и тем самым могли конкурировать по рентабельности и эффективности с такими общепризнанными источниками растительного сырья как рапсовое (64% олеиновой кислоты, 12-22% линолевой и до 6% пальмитиновой), соевое (21,8%, 54,9%, до 13%) и другие масла.
В липидном анализе основное внимание будет уделяться этерифицированным длинноцепочечным жирным кислотам (C-14 – C-24), которые будут исследоваться с помощью газовой хроматографии (GC) с масс-спектрометрией или без нее (MS). Также будет проверена значимость полученных профилей жирных кислот в филогенетическом контексте на различных таксономических уровнях, т.е. способность предсказать состав и количество жирных кислот и других ценных соединений согласно положению в соответствующих филогенетических кладах.
Предполагается создать выборку штаммов водорослей с высоким содержанием эйкозапентаеновой омега-3 кислоты, которые будут характеризовать не только высокими пищевыми качествами, но и иметь антибактериальную активность, что сделает эти штаммы полезными для борьбы с заболеваниями рыбы, моллюсков и ракообразных в индустрии аква- и марикультуры, где использование обычных антибиотиков нежелательно.
5. Накопление триглицеридов (TAG). Поскольку одними из наиболее ценных компонентов кормов для аквакультуры являются триглицериды, то определению их количественного состава в биомассе исследуемых штаммов водорослей с помощью жидкостной хроматографии будет уделено непосредственное внимание.
В ходе реализации заявки планируется выделение группы штаммов водорослей с относительно высоким содержанием TAG на клетку (в пределах 1,5-15,0 пг/клетка), которое было бы сопоставимо с другими уже используемыми в биотехнологии штаммами, например желтозеленой водорослью Monodus subterraneus, накапливающей до 1,7 пг/клетка во время фосфорного голодания (Khozin-Goldberg, Cohen 2006), диатомовой водорослью Thalassiosira pseudonana (12,4 пг/клетка), динофлагеллятой Heterocapsa sp. (47,8 пг/клетка) (Mansour et al. 2005) и др.
6. Будут созданы новые эколого-биохимические паспорта видов и штаммов микроводорослей и цианобактерий, включающие спектр биопродуктов, которые возможно получить из соответствующего образца, их количество и вариабельность содержания в зависимости от условий культивирования и действия стрессовых факторов. Эти документы сформируют надежный массив данных для дальнейшего использования в лабораторных исследованиях и промышленном использовании для достижения потенциальных целей.
Поскольку содержание клеточных включений и их объемная концентрация в микроводорослях зависит от условий культивирования анализируемых штаммов и может варьировать в широких пределах, нами планируется проведение опытов по стрессированию условий культивирования штаммов с целью возможного увеличения основных биотехнологически ценных параметров (темп накопления биомассы, общее содержание липидов, количество триглицеридов, витаминов, пигментов и состав жирных кислот).
Данные эксперименты позволят стандартизировать условия культивирования для получения максимально выгодного сырья для агро- и аквахозяйств из исследованных штаммов водорослей. Ожидается, что у исследованных штаммов удастся повысить как количество клеток, аккумулирующих липиды в целом, так и содержание жирных кислот и других биопродуктов на 10-40% в частности; увеличить доли отдельных жирных кислот, наличие которых в кормах наиболее ценно. Например, мы предполагаем, что ограниченное питание макроэлементами позволит нам увеличить содержания TAG на 5-10% от сухой массы, что будет сопоставимо с реакцией на голодание у других штаммов. Было установлено, что истощение запасов фосфора может увеличивать содержание TAG с 6,5% при оптимальных условиях до 39,3% у желтозеленой водоросли Monodus subterraneus (Khozin-Goldberg, Cohen 2006), а азота – с 5% до более чем 40% у зеленых водорослей Chlorella vulgaris, Neochloris oleoabundans и Scenedesmus obliquus (Breuer et al. 2012).
При проведении опытов по стрессированию нами непременно будет учитываться тот факт, что истощение питательных веществ помимо увеличения концентрации метаболитов в клетках водорослей и цианобактерий может и уменьшать содержание биомассы водорослей в культуре в результате повышения смертности клеток из-за стресс-воздействия (Li et al. 2008; Ruiz-Dominuez et al. 2015). В связи с этим будет изучена продолжительность стрессирования, необходимая для накопления нужных компонентов и разработана технология выращивания, включающая этапы роста в благоприятных условиях (накопление биомассы) и в стрессовых условиях (накопление в существующей биомассе нужных компонентов).
7. Будут разработаны технологические карты культивирования, обеспечивающие максимально высокие продукционные показатели штаммов водорослей и цианобактерий как в лабораторных, так и промышленных масштабах. Данные протоколы могут представлять коммерческий интерес для предприятий, занимающихся выращиванием микроводорослей, получением БАД и др. биопродуктов.
8. Будут разработаны рекомендации по оптимальным способам подготовки и условиям хранения биомассы, позволяющим как можно дольше сохранять максимальное количество доступных метаболитов.
Итоговым результатом выполнения предлагаемой заявки будет запуск нового центра на территории России по отбору и поддержанию группы штаммов микроводорослей из разных систематических групп с высоким биотехнологическим потенциалом, обладающих особой ценностью для применения в практике агро- и аквахозяйств при разработке инновационных рецептур кормов, которые отвечают современным требованиям высокопродуктивного и экологически чистого производства.
Разработанные в ходе выполнения проекта рекомендации (технологические карты) позволят на уровне конкретных хозяйств производить необходимое количество биомассы микроводорослей или создавать специализированные предприятия по их культивированию для повышения качества кормов, стимулировать процесс постепенного отказа от сырья из сельскохозяйственных культур и продуктов животного происхождения, получить экологически безопасный производственный процесс, который не будет нести угрозы загрязнения окружающей среды.
Также будут предоставлены показательные характеристики темпов накопления биомассы, содержания триглицеридов, состава и количества жирных кислот, выполненные в соответствии с современным пониманием скрининга в этой области и сопоставимые с аналогичными данными других ведущих мировых центров, занимающихся поиском биотехнологически перспективных штаммов водорослей. Данные характеристики могут заинтересовать ведущие мировые компании, занимающиеся развитием биотехнологии водорослей: израильскую фирму «Seambiotic» (промышленное культивирование морских водорослей на выбросах электростанций), японские фирмы «Tokyo Gas» и «NEDO» (разработка систем брожения биомассы водорослей для производства метана), американскую корпорацию «GreenFuel Technologies» (выращивание водорослей на выбросах теплоэлектростанций), международную фирму «EcoFuelUkraine» (производство биодизеля из водорослей) и др.
Успешное внедрение результатов проекта позволит приблизиться к решению ряда общегосударственных задач:
– повышение эффективности ведения животноводства и рыборазведения и улучшение продовольственного обеспечения населения за короткий промежуток времени;
– рациональное использование природных ресурсов за счет уменьшение нагрузки на пахотные земли, водные экосистемы за счет использования микроводорослей в качестве производителей биологического сырья;
– увеличение привлекательности ведения бизнеса агро- и аквапрофиля за счет новых подходов увеличения их производительности на основе использования новых недорогих, экономически обоснованных и экологически безопасных систем формирования кормов;
– обеспечение внутреннего рынка компонентов повышающих качество кормов и подкормок для агро- и аквакультур;
– улучшения инвестиционной привлекательности предприятий агро- и аквапрофиля.
В процессе выполнения проекта планируется опубликовать или сдать в печать десять статьи WoS, которые будут посвящены содержанию липидов и других ценных биосоединений, их вариабельности в результате изменений условий культивирования для выделенных нами наиболее перспективных штаммов водорослей, а также разработанным технологиям культивирования, включая состав среды и систему стрессирующих факторов, обеспечивающих максимальную производительность штамма.
ОТЧЁТНЫЕ МАТЕРИАЛЫ
Аннотация результатов, полученных в 2020 году
Водоросли представляют собой ценный природный ресурс липидов, жирных кислот и других биологически активных соединений. Однако на данный момент для получения коммерческих продуктов используются ограниченное количество видов, прежде всего из родов Aphanizomenon, Botryococcus, Chaetoceros, Chlorella, Cylindrotheca, Crypthecodinium, Isochrysis, Haematococcus, Dunaliella, Neochloris, Nostoc, Nannochloropsis, Pavlova, Phaeodactylum, Porphyridium, Spirulina (Arthrospira), Schizochytrium и Thalassiosira. Однако этим не исчерпывается весь потенциал микроводорослей. Проведенные исследования были направлены на поиск высокопродуктивных видов или штаммов, которые могут быть использованы для получения ценных биопродуктов. Для оценки продукционных возможностей в отчетный год было отобрано 382 штамма водорослей и цианобактерий из разных таксономических групп, а именно из порядка Oscillatoriales – 30 штаммов, Nostocales – 45, Chlamydomonadales – 42, Sphaeropleales – 51, Chlorellales – 32, Trebouxiales – 39, Trebouxiophyceae incertae sedis – 17, Eustigmatales – 22, Mischococcales – 3, Bacillariales – 28, Cocconeidales – 4, Eunotiales – 14, Naviculales – 41, Thalassiophysales – 9, Cryptomonadales – 3, Porphyridiales – 2. В работе в основном использовались штаммы из Коллекции культур лаборатории Молекулярной систематики водных растений Института физиологии растений им. К.А. Тимирязева РАН. Отобранные штаммы формируют достаточно разнообразную группу клад и линий, для которых уже отмечена специфическая, генетически обусловленная способность к аккумуляции биологически активных метаболитов. В отчетном периоде основное внимание было сосредоточено на генетической и эколого-биохимической паспортизации отобранных штаммов водорослей и цианобактерий на стационарной стадии культивирования.
Задокументированные с помощью световой и сканирующей электронной микроскопии морфологические особенности штаммов представлены в опубликованных работах. Для описываемых штаммов проводился анализ морфологической изменчивости как в природных образцах, так и во время культивирования. Среди биохимических показателей определялось содержание хлорофиллов a, b, c, общих каротиноидов, витаминов А и Е, протеина и общих аминокислот, анализировался спектр жирных кислот, проверялась активность ферментов сукцинатдегидрогеназы, супероксиддисмутазы, каталазы и глутатионпероксидазы, оценивалось состояние системы антиоксидантной защиты клеток исследуемых штаммов. Итоги оригинальных исследований стали основой для получения новых, и во многом уникальных, результатов.
Одним из важных направлений работы стало создание коллекции штаммов диатомовой водоросли Hantzschia. Диатомовые водоросли могут служить промышленным источником липидов в связи с их хорошим ростом в условиях культуры, а также высокопродуктивному накоплению хризоламинарина и липидов при дефиците питательных элементов. В профиле жирных кислот диатомовых водорослей доминируют пальмитиновая и цис-7-гексадеценовая кислоты, нередко отмечается высокое содержание эйкозапентаеновой кислоты. До наших исследований разнообразие представителей рода Hantzschia среди почвенных диатомовых водорослей на территории Палеарктики ограничивалось небольшим количеством видов, в первую очередь H. amphioxys, H. elongatа и H. vivax, включая их некоторые формы. В отчетный период мы изучили морфологию, ультраструктуру и филогению 25 почвенных штаммов диатомовых водорослей, которые могли быть отнесены к H. amphioxys sensu lato (Maltsev et al. 2021). Детальные морфологические и молекулярно-генетические исследования показали, что выборка состояла из семи различных видов Hantzschia, включая пять новых для науки: H. attractiva sp. nov., H. belgica sp. nov., H. parva sp. nov., H. pseudomongolica sp. nov. и H. stepposa sp. nov. Созданная коллекция штаммов Hantzschia, выделенных из географически удаленных и разнотипных экосистем, станет основой для поиска новых, коммерчески перспективных продуцентов липидов и других ценных биопродуктов, которые могут быть использованы в качестве сырья при производстве кормов и подкормок для агро- и аквахозяйств.
Большую перспективу с точки зрения практического применения имеет способность микроводорослей накапливать липиды. Разнообразие состава липидов микроводорослей позволяет исследовать широкий спектр их применения: получение биотоплива, продуктов питания, кормов для сельскохозяйственных животных и аквакультуры, пищевых добавок и др. В механизме образования и превращения большинства классов липидов принимают участие жирные кислоты, а их состав во многом определяет свойства и практическое использование биомассы водорослей. Поэтому изучению состава жирных кислот уделяется большое внимание. На основании анализа 222 научных публикаций, а также собственных результатов скрининга Коллекции культур водорослей и цианобактерий, установлено, что в биомассе микроводорослей и цианобактерий можно обнаружить 135 различных жирных кислот (Maltsev, Maltseva 2021). С учетом длины углеводородной цепи, ее структуры и наличия заместителей они распределяются на несколько групп: с четным числом атомов углерода в цепи – 81, с нечетным числом атомов углерода – 33, с разветвленной углеводородной цепью и дополнительными функциональными группами – 21. Среди жирных кислот микроводорослей есть как насыщенные, так и ненасыщенные жирные кислоты с различным количеством двойных связей: насыщенные – 19, мононенасыщенные – 26, полиненасыщенные – 68. В результате проведенного анализа показано, что профиль жирных кислот водорослей проявляет определенную специфику в пределах филогенетически обособленных таксономических групп.
Наиболее ценной группой синтезируемых микроводорослями жирных кислот являются омега-3 кислоты, многие из которых жизненно важные для человека, оказывая многочисленные нейтрализующие и фармацевтические действия. Среди омега-3 кислот к наиболее ценным относятся – α-линоленовая (ALA), стеаридоновая (SDA), эйкозапентаеновая (EPA), докозапентаеновая (DPA) и докозогексаеновая (DHA) кислоты. Установлено, что высокое содержание ALA демонстрирует ряд зеленых водорослей, в первую очередь штаммы Chlamydomonas и Dunaliella, биомасса которых может содержать ее до 62,3%. Несколько меньше ALA у цианобактерий, до 48,6% у штаммов Planktothrix и 54,4–64,0% в биомассе Anabaena и Nostoc. Еще меньше ALA продуцируют золотистые и эустигматофитовые водоросли – до 40%. Среди проанализированных нами штаммов лидером по накоплению α-линоленовой кислоты был штамм Coccomyxa elongata MZ–Ch64, который накапливал её до 50,29% во время длительного культивирования на среде BBM.
Стеаридоновая кислота активно накапливается отдельными штаммами зеленых (у Chlamydomonas до 52,3%, у Chlamydocapsa до 27,2%), криптофитовых (у Cryptomonas до 27,0%), динофитовых (у Amphidinium carterae до 33,0%) водорослей и цианобактерий (у Stigonema до 30,3%). В отчетном году среди исследованных штаммов наивысший показатель содержания SDA обнаружено у штамма Cryptomonas sp. MZ–Cr2 – 5,46%. Лидерами по количеству эйкозапентаеновой кислоты были: штамм Vischeria vischeri MZ–Е3 с содержанием EPA до 26,87% при выращивании в питательной среде BBM, штамм Vischeria vischeri MZ–Е3 с 22,15% в условиях недостатка фосфора в среде BBM и штамм Pseudocharaciopsis ovalis MZ–Е5 с 32,22% EPA при трехкратном увеличении количества азота в среде BBM.
Особый практический интерес представляют исследования состава пигментов водорослей как с точки зрения оценки активности фотосинтетического аппарата и способности к высокой продуктивности биомассы, так и устойчивости к фотоповреждению во время культивирования. Кроме того, способность водорослей к накоплению каротиноидов делает их ценными источниками этих соединений. На мировом рынке наблюдается повышение интереса к каротиноидам из природных источников и микроводорослей в том числе. В этом отношении был произведен скрининг содержания хлорофиллов a, b, c и каротиноидов в исследованной выборке штаммов водорослей и цианобактерий. Согласно количеству накапливаемых хлорофиллов, для дальнейшего биотехнологического использования можно рекомендовать по два штамма зеленых (MZ–Сh5, MZ–Ch33) и диатомовых (BTD1, BTD2) водорослей. Ценность данных штаммов объясняется двумя трендами: высокой фотосинтетической активностью культуры (MZ–Сh5, MZ–Ch33, BTD1, BTD2) и интенсивной скоростью накопления биомассы (BTD1, BTD2). Также было выявлено 6 штаммов зеленых водорослей (MZ–Ch5, MZ–Сh16, MZ–Сh33, MZ–Сh40, SAG 45-86 и SAG 38-72) и 4 штамма цианобактерий (MZ–C23, MZ–C4, MZ–C24, MZ–C17), которые характеризуются высоким содержанием общих каротиноидов на грамм сухой биомассы – от 95 до 345 mg/g. Прежде всего это представители родов Parietochloris, Heterochlamydomonas, Coccomyxa и Desmonostoc, Nostoc. В целом, на основании полученных результатов содержания суммарных каротиноидов, для дальнейшего биотехнологического изучения рационально использовать штаммы Pseudomuriella engadinensis MZ–Ch33, Parietochloris grandis MZ–Сh5, Heterochlamydomonas rugosa MZ–Ch16, Navicula salinicola BTD1 и Nitzschia pusilla BTD2.
В анализируемой выборке водорослей были выделены штаммы, которые могут иметь интерес в качестве источника витаминов А и Е. Витамин А является продуктом вторичного метаболизма микроводорослей, прекурсором которого являются каротиноиды. Ретинол и его окисленные формы способствуют дифференциации и росту тканей человека и животных, выполняют репродуктивную, иммунную и рецепторную функции, проявляют антиоксидантные свойства. В проанализированной нами выборке водорослей и цианобактерий 8 штаммов характеризовалось относительно высоким (более 50 µg/g сухой биомассы) содержанием витамина А. Из них зеленые водоросли: штамм Chlorella sorokiniana Z–7 (146,77 µg/g d.w.), Chlorellales sp. MZ–Ch3 (76,79 µg/g d.w.), Chlorococcum oleofaciens MZ–Ch4 (56,57 µg/g d.w.), Bracteacoccus bullatus MZ–Ch11 (91,72 µg/g d.w.), Heterochlamydomonas lobata MZ–Ch28 (79,44 µg/g d.w.), диатомовые: Nitzschia pusilla BTD7 (65,41 µg/g d.w.) и цианобактерии: Desmonostoc sp. MZ–C9 (54,63 µg/g d.w.).
Витамин Е выполняет в организме ряд важных функций: выступает в качестве низкомолекулярного антиоксиданта в организме человека и применяется в лечении различных патологий, противодействует фотоокислительному стрессу в растительных клетках. Во время скрининга содержания витамина Е было установлено, что только 8 штаммов содержали витамин Е более 300 µg/g сухой биомассы, 5 из которых относятся к эустигматофитовым водорослям: штаммы Vischeria vischeri MZ–Сh18, MZ–Е1, MZ–Е3, MZ–Е4 и Vischeria polyphem MZ–Е6, 2 – к зеленым: Heterochlamydomonas lobata MZ–Сh28, Parietochloris sp. MZ–Сh102 и штамм диатомей Mayamaea sp. MZ–BL6. Наибольшее количество витамина Е обнаружено в биомассе штамма MZ–Сh28 – 773,81 µg/g d.w.
Белковый обмен играет важную роль в жизнедеятельности водорослей, что связано с его участием в формировании ответных реакций клеток водорослей на различные воздействия, а содержание белков в биомассе зависит от видовой принадлежности и условий роста. Анализ выборки штаммов водорослей и цианобактерий показал, что исследуемые культуры значительно различаются по содержанию протеина. Наибольшее его содержание установлено на уровне 10,80% от сухой массы для штамма красных водорослей Porphyridium purpureum IBSS-70. Так же всего 9 штаммов содержали выше 9,0% протеина в сухой биомассе.
Одним из наиболее важных энзимов для процессов роста и развития, интенсивности дыхания, фотосинтеза, накопления АТФ, генерации активных форм Оксигена и регуляции клеточного ответа на стресс у водорослей является сукцинатдегидрогеназа. Штаммы с высокой активность энзимов энергетического обмена (более 20,00 nmol/min×mg prot) могут быть более перспективными для биотехнологического использования особенно в условиях введения дополнительных питательных веществ в среду, поскольку для них характерна большая их усвояемость и, соответственно, продуктивность. С точки зрения активности сукцинатдегидрогеназы в проанализированной выборке наиболее ценными являются штаммы Pseudomuriella engadinensis MZ–Сh33 (69,82 nmol/min×mg prot.), Coccomyxa elongata MZ–Ch64 (36,39 nmol/min×mg prot.) и Karayevia triconfusa BTD4 (52,99 nmol/min×mg prot.).
Сопоставляя результаты комплексной биохимическая паспортизации первой выборки штаммов водорослей и цианобактерий можно рекомендовать следующую группу штаммов для получения вторичных метаболитов: штаммы Pseudomuriella engadinensis MZ–Ch33, Parietochloris grandis MZ–Ch5 и Heterochlamydomonas rugosa MZ–Ch16 в качестве продуцентов каротиноидов; Nitzschia pusilla BTD7 и Chlorella sorokiniana Z–7 – ретинола, Bracteacoccus bullatus MZ–Сh11 – ретинола и протеина, Heterochlamydomonas lobata MZ–Ch28 – ретинола и α-токоферола, Navicula salinicola BTD1 – каротиноидов и α-токоферола, Vischeria polyphem MZ–E6 – α-токоферола и протеина.
По результатам, полученным в отчетном году, в информационных ресурсах в сети Интернет было опубликовано больше 10 пресс-релизов, в частности:
https://nauka.tass.ru/nauka/10832341
https://naked-science.ru/article/column/rossijskie-uchenye-obnaruzhili-pyat-vidov
https://www.gazeta.ru/science/news/2021/03/04/n_15694868.shtml
https://www.gazeta.ru/science/news/2021/04/23/n_15897068.shtml
https://scientificrussia.ru/articles/uchenye-opisali-raznoobrazie-zhirnyh-kislot-v-mikrovodoroslyah?utm_source=yxnews&utm_medium=desktop
Публикации
1. Мальцев Е.И., Мальцева С.Ю., Коциолек Д.П., Ян Р., Куликовский М.С. Biogeography of the cosmopolitan terrestrial diatom Hantzschia amphioxys sensu lato based on molecular and morphological data Scientific Reports, 11, 4266 (год публикации - 2021) https://doi.org/10.1038/s41598-021-82092-9
2. Мальцев Е.И., Мальцева Е.И. Fatty acids of microalgae: diversity and applications Reviews in Environmental Science and Biotechnology, 20: 515–547 (год публикации - 2021) https://doi.org/10.1007/s11157-021-09571-3
3. - Российские ученые открыли пять ранее неизвестных видов евразийских водорослей Информационное телеграфное агентство России (ИТАР-ТАСС), 4 марта 2021, on-line (год публикации - )
4. - Российские ученые обнаружили пять видов диатомовых водорослей, ранее неизвестных науке Naked Science, 4 марта 2021, on-line (год публикации - )
5. - Ученые обнаружили пять видов диатомовых водорослей, ранее неизвестных науке Газета.Ru (Gazeta.Ru), 4 марта 2021, on-line (год публикации - )
6. - Ученые обнаружили пять видов диатомовых водорослей, ранее неизвестных науке Indicator.Ru, 6 марта 2021, on-line (год публикации - )
7. - Ученые описали разнообразие жирных кислот в микроводорослях Газета.Ru (Gazeta.Ru), 23 апреля 2021, on-line (год публикации - )
8. - Ученые описали разнообразие жирных кислот в микроводорослях Научная Россия, 23 апреля 2021, on-line (год публикации - )
9. - Ученые описали разнообразие жирных кислот в микроводорослях Научно-информационный портал “Поиск”, 23 апреля 2021, on-line (год публикации - )
10. - Описано разнообразие жирных кислот в микроводорослях Indicator.Ru, 23 апреля 2021, on-line (год публикации - )
11. - Российские ученые открыли пять ранее неизвестных видов евразийских водорослей Пресс-служба РНФ, 4 марта 2021, on-line (год публикации - )
12. - Ученые описали разнообразие жирных кислот в микроводорослях Пресс-служба РНФ, 23 апреля 2021, on-line (год публикации - )
13. - Ученые обнаружили пять видов диатомовых водорослей, ранее неизвестных науке Российская академия наук, 4 марта 2021, on-line (год публикации - )
14. - Ученые описали разнообразие жирных кислот в микроводорослях Российская академия наук, 23 апреля 2021, on-line (год публикации - )
Аннотация результатов, полученных в 2021 году
В течении отчетного года продолжался скрининг и биохимическая паспортизация штаммов диатомовых, зеленых, желтозеленых, эустигматофитовых микроводорослей и цианобактерий Коллекции культур лаборатории Молекулярной систематики водных растений ИФР РАН. Всего для оценки продукционных возможностей в отчетный период было отобрано 349 штаммов водорослей и цианобактерий из разных таксономических групп: Nostocales 29 штаммов, Oscillatoriales 17, Synechococcales 7, Chlamydomonadales 32, Chlorellales 41, Sphaeropleales 38, Trebouxiales 35, Trebouxiophyceae incertae sedis 22, Watanabeales 5, Eustigmatales 7, Mischococcales 2, Aulacoseirales 9, Bacillariales 18, Cocconeidales 23, Naviculales 20, Rhabdonematales 14, Stephanodiscales 13 и Thalassiosirales 17 штаммов. Для анализируемых штаммов обобщалась информация о таксономическом положении, морфологии, филогенетической принадлежности, особенностях культивирования, продуктивности, физиологических и биохимических характеристиках биомассы.
Результаты, полученные для каждого протестированного штамма, суммировались и вносились в эколого-биохимические паспорта и технологические карты. Каждый паспорт включает информацию о таксономическом статусе штамма, месте обитания, ДНК-баркодинговом участке, условиях поддержания штамма в культуре. Технологическая карта содержит данные о типе культуры, питательной среде, интенсивности и режиме освещения, температуре культивирования и необходимом аппаратном обеспечении. Для всех технологических режимов рассчитаны кинетические закономерности процесса культивирования. Также эколого-биохимический паспорт представляет ключевые физиологические и биохимические характеристики биомассы микроводорослей: количество липидов, состав жирных кислот (соотношение насыщенных, мононенасыщенных, полиненасыщенных, омега-3 и омега-6 ЖК), содержание пигментов (Хл a, Хл b, Хл c, каротиноидов), протеина, витаминов (ретинола, α-токоферола), активность ферментов (каталазы, сукцинатдегидрогеназы, супероксиддисмутазы, глутатионпероксидазы), содержание ТБК-активных продуктов и коэффициент антиоксидантной активности. Также составленные паспорта описывают основные продукционные характеристики штаммов – продуктивность биомассы, липидов, белков, пигментов; концентрацию витаминов, объемную активность ферментов, концентрацию ТБК-активных продуктов. Сформированные эколого-биохимические паспорта приложены в качестве дополнительных материалов к отчету.
За отчетный период по результатам проекта опубликовано 7 научных статей, из которых 4 – в изданиях, индексируемых в системах цитирования WoS и Scopus, 3 – в изданиях, индексируемых в системах РИНЦ и Google Scholar. При этом список публикаций за второй год выполнения проекта включает 3 статьи в высокорейтинговых изданиях из первого квартиля Q1: Scientific Reports (1 статья), Biology (2 статьи). Достигнутые результаты представлены 7-ю устными докладами на 4-х международных и всероссийских научных конференциях.
Результаты выполнения проекта стали основой 10 новостных материалов, опубликованных в ведущих СМИ, в т.ч. ИТАР-ТАСС (https://nauka.tass.ru/nauka/12710031), Газета.Ru (https://www.gazeta.ru/science/news/2021/10/21/n_16726249.shtml?updated), Планета Сегодня (https://planet-today.ru/novosti/nauka/item/139199-vodorosl-dlya-farmatsevticheskoj-promyshlennosti-nashli-v-tulskoj-oblasti), «Комсомольская правда» (https://www.tula.kp.ru/online/news/4485121/?utm_source=yxnews&utm_medium=desktop&utm_referrer=https%3A%2F%2Fyandex.ru%2Fnews%2Fsearch%3Ftext%3D), lenta.ru (https://lenta.ru/news/2021/10/21/vodorosl/) и др.
Новый почвенный штамм зеленой водоросли Coelastrella multistriata MZ–Ch23 выделен из гранитного карьера в Тульской области. Это первая находка C. multistriata в альгофлоре России. Были проведены эксперименты по определению влияния продолжительности культивирования и недостатка азота и/или фосфора в среде на состав жирных кислот и продуктивность липидов. На стандартной среде BBM, а также в условиях фосфорного голодания в профиле ЖК преобладала 18:3n-3 α-линоленовая кислота (до 38,1%). Недостаток азота и одновременно азота и фосфора стимулировал повышение содержания 18:1n-9 олеиновой (до 33,7%) и 18:2n-6 линолевой (11,9%) ЖК. Продление времени роста культуры до 60 дней привело к увеличению содержания длинноцепочечных ЖК до 9,9%. Новый штамм показал способность накапливать липиды в количестве до 639,8 мг/л в условиях азотного и фосфорного голодания, что превышает ранее полученные значения для большинства штаммов Coelastrella.
В ходе выполнения проекта впервые получены данные о элементарном составе диатомовой водоросли Chaetoceros spp., которая вносят значительный вклад в первичную продукцию Северного Ледовитого океана. Установлено содержание основных макро- (Na, Mg, P, S, K, Ca), микро- (Li, Be, B, Al, Ti, Sc, V, Cr, Mn, Co, Fe, Ni, Cu, Zn, Ga, As, Se, Rb, Sr, Mo, Ag, Cd, Sn, Sb, Cs, Ba, Re, Au, Hg, Tl, Pb, Bi, Th, U) и редкоземельных (Y, La, Ce, Pr, Nd, Sm, Eu, Gd, Tb, Dy, Ho, Er, Tm, Yb, Lu) элементов. Биогенный кремний был доминирующим компонентом химического состава Chaetoceros spp., составляя в среднем 19,1% сухой биомассы. Другими важными макроэлементами были щелочные (Na, K) и щелочноземельные (Ca, Mg) металлы, а также биогенные (S, P) и незаменимые (Al, Fe) элементы. Полученные результаты позволят усовершенствовать методологию культивирования штаммов морских диатомовых водорослей, используемых в качестве перспективных продуцентов биогенного кремнезема.
Обобщение достигнутых результатов и обзор мировой научной литературы позволили установить ряд закономерностей во влиянии разных параметров освещения на рост, продуктивность и накопление коммерчески ценных продуктов микроводорослями и цианобактериями. Установлено, что оптимальная интенсивность освещения для роста микроводорослей находиться в узком диапазоне 26–400 мкмоль/м2×с. Только некоторые виды демонстрируют адаптацию к более сильному освещению. Увеличение интенсивности освещения приводит к активизации синтеза липидов. Для максимальной продуктивности липидов многие микроводоросли нуждаются в интенсивности освещения до 700 мкмоль/м2×с. Интенсивность освещения оказывает регулирующее влияние на синтез жирных кислот, каротиноидов, в том числе, β-каротина, лютеина и астаксантина. В условиях интенсивного освещения обычно накапливаются насыщенные и мононенасыщенные жирные кислоты, а количество полиненасыщенных уменьшается. Световой поток специального спектрального состава может изменять метаболические процессы в клетках микроводорослей. Красное и синее светодиодное освещение улучшает продуктивность биомассы микроводорослей различных таксономических групп. Изменение продолжительности фотопериода, использование импульсного света позволяет стимулировать рост микроводорослей, продукцию липидов и каротиноидов.
Проведены эксперименты по исследованию характера действия разных концентраций ионов тяжелых металлов Mn и Zn на зеленые водоросли Bracteacoccus minor и Lobosphaera incisa. Действие каждого металла исследовали в шести вариантах концентрации ионов Zn2+ и Mn2+: 1, 5, 25, 50, 500, 1000 мг/л среды. Установлено, что Zn и Mn оказывают разное токсическое действие на штаммы B. minor MZ–Ch31 и L. incisa MZ–Ch212. B. minor проявил большую чувствительность к действию Zn, а L. incisa – к Mn. Обнаружено, что LD50 Zn для B. minor и L. incisa находиться в диапазоне 1–5 мг/л раствора, а LD50 Mn 1–5 мг/л для B. minor. Для L. incisa LD50 Mn близок к 5 мг/л. Анализ главных компонентов позволил выделить две основные переменные, которые составляют 99% общей дисперсии. Главный компонент 1 (60,47% общей дисперсии) отражает изменения, связанные с концентрациями ионов тяжелых металлов до 5 мг/л. На главный компонент 2 приходится 27,95% общей дисперсии, а связан он с высокими концентрациями ионов Mn и Zn (50 и 500 мг/л). Главные компоненты 1 и 2 демонстрируют специфичность отклика зеленых водорослей B. minor и L. incisa на действие Zn и Mn.
Публикации
1. Кривова З.В., Мальцев Е.И., Куликовский М.С. Сравнение жирнокислотных профилей разных штаммов диатомовой водоросли Cyclotella meneghiniana Kützing из соленого озера Тахилт-Нуур (Монголия) Проблемы ботаники Южной Сибири и Монголии, 20, 1, 246–248 (год публикации - 2021) https://doi.org/10.14258/pbssm.2021047
2. Кривова З.В., Мальцев Е.И., Куликовский М.С. Влияние фосфорного голодания на жирнокислотный состав штаммов рода Vischeria Вопросы современной альгологии, 2, 26, 159–163 (год публикации - 2021) https://doi.org/10.33624/2311-0147-2021-2(26)-159-163
3. Лобус Н.В., Куликовский М.С., Мальцев Е.И. Multi-element composition of diatom Chaetoceros spp. from natural phytoplankton assemblages of the Russian Arctic seas Biology, 10, 10, 1009 (год публикации - 2021) https://doi.org/10.3390/biology10101009
4. Мальцев Е., Кривова З., Мальцева С., Мальцева Е., Горшкова Е., Куликовский М. Lipid accumulation by Coelastrella multistriata (Scenedesmaceae, Sphaeropleales) during nitrogen and phosphorus starvation Scientific Reports, 11, 19818 (год публикации - 2021) https://doi.org/10.1038/s41598-021-99376-9
5. Мальцев Е., Мальцева А., Мальцева С. Differential Zn and Mn sensitivity of microalgae species from genera Bracteacoccus and Lobosphaera Environmental Science and Pollution Research, 28, 57412–57423 (год публикации - 2021) https://doi.org/10.1007/s11356-021-15981-1
6. Мальцев Е.И., Кривова З.В., Мальцева С.Ю., Куликовский М.С. Использование профиля жирных кислот в качестве хемотаксономического маркера для диатомовых водорослей из рода Nitzschia Hassall соленых озер Монголии Проблемы ботаники Южной Сибири и Монголии, 20, 1, 246–248 (год публикации - 2021) https://doi.org/10.14258/pbssm.2021047
7. Мальцев Е.И., Мальцева Е.И., Куликовский М.С., Мальцева С.Ю. Influence of light conditions on microalgae growth and content of lipids, carotenoids and fatty acid composition Biology, 10, 10, 1060 (год публикации - 2021) https://doi.org/10.3390/biology10101060
8. - В Тульской области нашли водоросль с высоким содержанием жирных кислот Информационное телеграфное агентство России (ИТАР-ТАСС), 20 октября 2021, on-line (год публикации - )
9. - В Тульской области нашли водоросль с высоким содержанием жирных кислот Пресс-служба РНФ, 21 октября 2021, on-line (год публикации - )
10. - ВОДОРОСЛЬ ДЛЯ ФАРМАЦЕВТИЧЕСКОЙ ПРОМЫШЛЕННОСТИ НАШЛИ В ТУЛЬСКОЙ ОБЛАСТИ Информационное агентство «Научная Россия», 20 октября 2021, on-line (год публикации - )
11. - Тульская водоросль стала источником жирных кислот для лекарств и биотоплива Газета.Ru (Gazeta.Ru), 21 октября 2021, on-line (год публикации - )
12. - В Тульской области нашли уникальную водоросль для производства лекарств и топлива СМИ Первый Тульский, 20 октября 2021, on-line (год публикации - )
13. - Водоросль для фармацевтической промышленности нашли в Тульской области Планета Сегодня / Planet Today, 20 октября 2021, on-line (год публикации - )
14. - В Тульской области нашли водоросль для фармацевтической промышленности Годнауки.рф, 20 октября 2021, on-line (год публикации - )
15. - На территории Тульской области нашли уникальный штамм водоросли Тульские новости, 20 октября 2021, on-line (год публикации - )
16. - В России обнаружили редкий штамм одноклеточной водоросли lenta.ru, 21 октября 2021, on-line (год публикации - )
17. - Под Тулой обнаружили редкий штамм одноклеточной водоросли АО ИД «Комсомольская правда», 20 октября 2021, on-line (год публикации - )
Аннотация результатов, полученных в 2022 году
В течении отчетного года продолжался скрининг и биохимическая паспортизация штаммов диатомовых, зеленых, желтозеленых, эустигматофитовых, красных микроводорослей и цианобактерий из Коллекции культур лаборатории Молекулярной систематики водных растений ИФР РАН. Всего для оценки продукционных возможностей в отчетный год было отобрано 240 штаммов водорослей и цианобактерий из разных таксономических групп. Для протестированных штаммов создавался эколого-биохимический паспорт и технологическая карта. Каждый паспорт включает информацию о таксономическом положении штамма, месте обитания, ДНК-баркодинговом участке, микрофотографии и ключевые биохимические характеристики: количество липидов, состав жирных кислот и соотношение их основных групп (насыщенных, ненасыщенных, омега-3 и омега-6), содержание пигментов (хлорофиллов, суммарных каротиноидов), протеина, витаминов (ретинола, α-токоферола), активность ферментов (каталазы, сукцинатдегидрогеназы, супероксиддисмутазы, глутатионпероксидазы), содержание ТБК-активных продуктов и коэффициент антиоксидантной активности. Технологическая карта содержит данные о типе культуры, питательной среде, интенсивности и режиме освещения, температуре культивирования и необходимом аппаратном обеспечении.
За отчетный период по результатам проекта опубликовано 8 научных статей, из которых 7 – в изданиях, индексируемых в системах цитирования Web of Science и Scopus. В высокорейтинговых изданиях, входящих в первый квартиль (Antioxidants, Cells, International Journal of Environmental Science and Technology, Journal of Phycology) опубликовано 4 статьи. Достигнутые результаты представлены 5-ю докладами на 4-х международных и всероссийских научных конференциях.
Результаты выполнения проекта стали основой 14 новостных материалов, опубликованных в ведущих СМИ, в т.ч. Indicator (https://indicator.ru/biology/v-pochvakh-vetnama-otkryty-shest-novykh-vidov-vodoroslei-poleznykh-dlya-polucheniya-biotopliva-12-09-2022.htm), Naked Science (https://naked-science.ru/article/column/v-pochvah-vetnama-otkryty-shest-novyh), Научная Россия (https://scientificrussia.ru/articles/pocvennye-mikrovodorosli-pokazali-raznuu-cuvstvitelnost-k-toksiceskomu-vozdejstviu-medi), InScience.News (https://inscience.news/ru/article/world-science/earth-science/11522) и др.
Новый штамм цианобактерий из рода Aliinostoc (Nostocales) выделен из почвы тропического леса, расположенного на территории Национального парка Кат Тьен (Южный Вьетнам). На основании морфологических характеристик и филогенетического анализа с использованием гена 16S рДНК описан новый для науки вид Aliinostoc vietnamicum. Установлены особенности изменения состава жирных кислот при переходе от экспоненциальной к стационарной фазе роста культуры нового штамма. Анализ показал, что доминантными были пальмитиновая, стеариновая и α-линоленовая жирные кислоты. При этом стационарная фаза роста характеризовалась увеличением содержания насыщенных жирных кислот и уменьшением полиненасыщенных.
Изучено функциональное состояние накопительных культур эустигматофитовых штаммов Vischeria vischeri MZ–E3 и MZ–E4. Определена концентрация хлорофилла а, общих каротиноидов, белка, витаминов А и Е, содержание продуктов перекисного окисления липидов, активность антиоксидантных ферментов. Активность сукцинатдегидрогеназы у штамма MZ–E3 была выше в 2,2 раза; при этом штамм MZ–E4 характеризовался в 2,9 раза большей активностью глутатионпероксидазы. Индекс антиоксидантной активности штамма MZ–E3 и ненасыщенность жирных кислот были в 1,3 и 1,3 раза выше, чем у MZ–E4. Содержание ретинола и α-токоферола в биомассе MZ–E3 было на 28,6% и 38,8% выше, чем у MZ–E4. Основным отличием профилей жирных кислот было повышенное в 3,5 и 3,9 раза содержание стеариновой и эйкозапентаеновой кислот в биомассе MZ–E4. В целом, биомасса штамма MZ–E3 имела более высокий антиоксидантный, энергетический, метаболический и фотосинтетический статус, чем MZ–E4. Показано, что изученные штаммы являются ценными для получения биомассы, обогащенной α-токоферолом, омега-3 и омега-6 жирными кислотами.
На основании изучения морфологии, ультраструктуры и филогении восьми штаммов почвенных диатомовых водорослей из тропических экосистем описано 6 новых для науки видов Pinnularia. Проанализированы профили жирных кислот выделенных штаммов –доминирующими жирными кислотами в биомассе диатомовых водорослей, культивируемых на среде Waris-H+Si, были стеариновая (36,0–64,4%), пальмитиновая (20,1–30,4%) и пальмитолеиновая (до 20,8%) кислоты. Высокий содержание насыщенных и мононенасыщенных жирных кислот позволяет использовать биомассу новых штаммов Pinnularia в качестве сырья для производства биотоплива.
Проанализирован рост красной микроводоросли Porphyridium purpureum и продукция B-фикоэритрина в стеклянных фотобиореакторах плоскопараллельного типа при различных способах введения СО2 в культуру: 1) непосредственное введение СО2 в газовоздушную смесь (2–3% v/v) и барботирование культуры через капилляр диаметром 4 мм; 2) подача воздуха через распылитель с диаметром пор 0,1 мм; 3) барботирование воздухом через капилляр без дополнительного введения СО2. Во всех вариантах эксперимента отмечено значительное увеличение продуктивности культуры P. purpureum (до 2,5 раз) и скорости синтеза B-фикоэритрина (до 8,5 раз) по сравнению с его выращиванием на воздухе без распыления или барботирования. Установлено, что самым эффективным способом культивирования P. purpureum является барботирование смесью воздуха и СО2 через капилляр. Этот способ позволил за 16 дней культивирования достичь прироста биомассы 3 г/л и максимальной продуктивности накопления B-фикоэритрина, 12,3 мг/л×сутки. В итоге, использование разработанного технологического приёма барботирования позволило интенсифицировать процессы перехода углекислого газа из воздуха в среду и способствовало поддержанию высокой скорости накопления биомассы P. purpureum и B-фикоэритрина.
Продолжение исследований биохимических характеристик биомассы штамма зеленых водорослей Coelastrella multistriata MZ–Ch23 подтвердило его ценность для биотехнологического использования. Установлено, что во время экспоненциальной и стационарной фаз культивирования клетки C. multistriata характеризуются низкой концентрацией продуктов перекисного окисления липидов. Диапазон продуктов пероксидации, реагирующих с 2-тиобарбитуровой кислотой, составил 0,005–0,015 нмоль/мг протеина. Показано, что именно 25-дневное культивирование позволяет получить биомассу C. multistriata обогащённую биологически-активными веществами, в первую очередь омега-3 жирными кислотами (до 204,4 мг/г сухой биомассы), каротиноидами (11,3 мг/г), витамином А (342,7 мкг/г), протеином (122,2 мг/г) и устойчивую к пероксидному окислению липидов.
Изучено токсическое действие меди на почвенные микроводоросли: Vischeria magna, Botrydiopsis sp., Tetracystis sp. в 28-дневном эксперименте с различной исходной плотностью клеток (×103 и ×106 клеток/мл) с использованием CuSO4 и Cu(CH3COO)2 в качестве источника меди. Установлено, что токсическое действие меди зависит от ее концентрации, исходной плотности клеток водорослей и химического источника меди. Показано, что штамм Tetracystis sp. обладал наибольшей устойчивостью к меди и выдерживал концентрацию меди до 50 мг/л. Botrydiopsis sp. и V. magna были устойчивы к концентрациям меди 30 мг/л и 5 мг/л. Медь оказалась менее токсичной в варианте эксперимента с более высокой плотностью клеток водорослей (×106 клеток/мл). Также установлено, что токсическое действие меди проявляется при более низких концентрациях в варианте с медным купоросом по сравнению с ацетатом меди.
Из лесных почв тропических экосистем Вьетнама выделен новый штамм пеннатных диатомовых водорослей VP57. На основании молекулярных и морфологических данных описан новый для науки вид Placoneis asymmetricus. Моноклональная культура поддерживается на питательной среде WC.
Публикации
1. Боровков А.Б., Гудвилович И.Н., Мальцева И.А., Рылькова О.А., Мальцев Е.И. Growth and B-phycoerythrin production of red microalga Porphyridium purpureum (Porphyridiales, Rhodophyta) under different carbon supply Microorganisms, V. 10, №11. – P. 2124. (год публикации - 2022) https://doi.org/10.3390/microorganisms10112124
2. Кезля Е., Глущенко А., Коциолек Дж.П., Мальцев Е., Генкал С., Куликовский М. A new species of Placoneis (Bacillariophyceae: Cymbellales) from wet soils in Southern Vietnam Cryptogamie, Algologie, V. 43, № 11. – P. 177–188. (год публикации - 2022) https://doi.org/10.5252/cryptogamie-algologie2022v43a11
3. Кезля Е., Мальцев Е., Генкал С., Кривова З., Куликовский М. Phylogeny and fatty acid profiles of new Pinnularia (Bacillariophyta) species from soils of Vietnam Cells, V. 11, № 15. – P. 2446. (год публикации - 2022) https://doi.org/10.3390/cells11152446
4. Мальцев Е., Мальцева С.Ю., Куликовский М.С. Toxic effect of copper on soil microalgae: experimental data and critical review International Journal of Environmental Science and Technology, Published online: 18 January 2023 (год публикации - 2023) https://doi.org/10.1007/s13762-023-04766-3
5. Мальцев Е.И., Кривова З.В., Мальцева С.Ю., Кезля Е.М., Куликовский М.С. Особенности состава жирных кислот нового штамма Aliinostoc (Nostocales) Вестник Башкирского государственного педагогического университета им. М. Акмуллы, Т. 63, № 2. - С. 95-98. (год публикации - 2022)
6. Мальцева С., Кезля Е., Кривова З., Гусев Е., Куликовский М., Мальцев Е. Phylogeny and fatty acid profiles of Aliinostoc vietnamicum sp. nov. (Cyanobacteria) from soils of Vietnam Journal of Phycology, V. 58. – P. 789–803. (год публикации - 2022) https://doi.org/10.1111/jpy.13283
7. Мальцева С.Ю., Куликовский М.С., Мальцев Е.И. Functional state of Coelastrella multistriata (Sphaeropleales, Chlorophyta) in an enrichment culture Microbiology, V. 91, № 5. – P. 523–532. (год публикации - 2022) https://doi.org/10.1134/S0026261722601385
8. Яковийчук А., Кривова З., Мальцева С., Кочубей А., Куликовский М., Мальцев Е. Antioxidant status and biotechnological potential of new Vischeria vischeri (Eustigmatophyceae) soil strains in enrichment cultures Antioxidants, V. 12, № 3. – P. 654. (год публикации - 2023) https://doi.org/10.3390/antiox12030654
9. - В почвах Вьетнама открыты шесть новых видов водорослей, полезных для получения биотоплива Информационное агентство «Научная Россия», 13 сентября 2022, on-line (год публикации - )
10. - В почвах Вьетнама открыты шесть новых видов водорослей, полезных для получения биотоплива Indicator, 12 сентября 2022, on-line (год публикации - )
11. - В почвах Вьетнама открыты шесть новых видов водорослей, полезных для получения биотоплива Naked Science, 12 сентября 2022, on-line (год публикации - )
12. - В почвах Вьетнама открыты шесть новых видов диатомовых водорослей Полит.ру, 13 сентября 2022, on-line (год публикации - )
13. - В почвах Вьетнама открыты шесть новых видов водорослей, полезных для получения биотоплива Новости Науки, 13 сентября 2022, on-line (год публикации - )
14. - В почвах Вьетнама открыты шесть новых видов водорослей, полезных для получения биотоплива Пресс-служба РНФ, 12 сентября 2022, on-line (год публикации - )
15. - Почвенные микроводоросли показали разную чувствительность к токсическому воздействию меди Научная Россия, 31 января 2023, on-line (год публикации - )
16. - Почвенные микроводоросли показали разную чувствительность к токсическому воздействию меди "Поиск" научно-информационный портал, 31 января 2023, on-line (год публикации - )
17. - Микроводоросли и загрязнение почв Полит.ру, 01 февраля 2023, on-line (год публикации - )
18. - Водорослевая биоиндикация загрязнения медью оказалась не столь очевидной CoLab, 31 января 2023, on-line (год публикации - )
19. - Микроводоросли и загрязнение почв ГОСТОНОМИКА, 01 февраля 2023, on-line (год публикации - )
20. - Чувствительность микроорганизмов почвы к тяжелым металлам зависит от плотности колонии InScience.News, 31 января 2023, on-line (год публикации - )
21. - Микроводоросли и загрязнение почв «Информ Вест» газета, 01 февраля 2023, on-line (год публикации - )
22. - Почвенные микроводоросли показали разную чувствительность к токсическому воздействию меди Indicator, 31 января 2023, on-line (год публикации - )
Возможность практического использования результатов
В результате выполнения проекта показано, что разнообразие микроводорослей и цианобактерий составляет природный ресурс получения липидов, ценных жирных кислот, пигментов (В-фикоэритрина и каротиноидов), витаминов и антиоксидантов. Биохимический профиль микроводорослей и цианобактерий проявляет определенную специфику в пределах основных филогенетических и экологических групп, изменяется при смене условий освещения и режима азотного и фосфорного питания во время культивирования, что позволяет регулировать процессы накопления соединений в сторону синтеза ценных для практического использования биопродуктов. Характер изменений в накоплении липидов и составе жирных кислот может отличаться у различных штаммов одного вида, а также видов одного рода, что может быть обусловлено специфическими адаптациями к содержанию питательных веществ, абиотическим условиям в исходных местообитаниях или метаболическими путями преодоления стрессовых воздействий.
В результате проведения биохимического скрининга среди уникальных штаммов из Коллекции культур водорослей и цианобактерий лаборатории Молекулярной систематики водных растений ИФР РАН в опубликованных статьях для производства биотоплива рекомендовано 8 штаммов диатомовых, 4 штамма зеленых водорослей и 1 штамм цианобактерий. Для повышения продуктивности в животноводстве и аквакультуре при создании кормов и подкормок рекомендовано использовать биомассу 5 штаммов зеленых и 2 штаммов эустигматофитовых водорослей. Для производства пигментов, которые могут применяться как функциональные ингредиенты или компоненты пищевых добавок, предложено использовать биомассу штамма красной микроводоросли Porphyridium purpureum для получения B-фикоэритрина.