Аннотация результатов, полученных в 2020 году
Дирофилярии D. immitis и D. repens — инвазивные виды паразитических нематод, высокими темпами продвигающиеся на северные и восточные территории РФ, а также представляющие значительную ветеринарную и медицинскую проблемы. Дирофилярии — гетероксенные биогельминты, использующие в качестве переносчика (промежуточного хозяина) кровососущих комаров. Трансмиссивная фаза в жизненном цикле дирофилярий связана с адаптацией паразита и его расселением. На территории РФ эта фаза гельминто-гостальных отношений мало изучена (распространение, значимость видов комаров в трансмиссии паразита, частота встречаемости в природных популяциях и др. аспекты). Распространенность инвазии В 2020 г. было обследовано 51 местообитание имаго комаров в бассейне Оби (от с. Тюнгур Республики Алтай на Катуни до г. Лабытнанги и г. Салехарда, ЯНАО в низовьях Оби) на участке общей протяженностью 2134 км с целью изучения встречаемости и видового состава дирофилярий, а также связанных с ними видов комаров-переносчиков. Основные исследования 2020 г. проведены в Томском Приобье. Всего изучено свыше шести тысяч особей. В южных областях Западной Сибири (Алтайский край, Республика Алтай, Новосибирская, Омская области) паразит регистрируется уже больше двух десятилетий (Старостина и др., 2018). Северные территории (Томская и Кемеровская область, Ханты-Мансийский и Ямало-Ненецкий автономный округ) до начала наших работ были практически не изучены. Наши исследования показали, что в настоящее время дирофилярии совершенно обычны для большинства населенных пунктов Томской области от южных районов (Томский, Кожевниковский) до северных (Александровский). Местная передача паразита в Томской области показана до р. Васюган (59 ° с. ш.). В ХМАО проведены предварительные исследования, выявившее обитание вида D. repens вплоть до 62,5 ° с.ш. (п. г. т. Приобье), что на сегодняшний день наиболее северная находка не только по Западной Сибири, но и в России. Севернее (Березово, Шурышкары, Лабытнанги, Салехард) дирофилярии в популяциях кровососущих комаров не проявились. Виды комаров-переносчиков В Томской области выявлено три вида малярийных комаров, зараженных дирофиляриями. Наиболее активными переносчиками оказались An. messeae (3,2 %) и An. daciae (3,1 %), менее – An. beklemishevi (1,6 %). Южнее 57-й параллели в Томской области встречался, в основном, An. daciae (>95 %), средняя зараженность которого составила 2,7 %. На экстенсивность инвазии малярийных комаров существенно влияли локальные условия. Так, зараженность правобережных популяций Оби превышала таковую левобережных в 3-4 раза. На левом берегу активнее переносил инвазию An. daciae (2,6 %), на правом — An.messeae (5,8 %). В популяциях An.beklemishevi высокий уровень инвазии (4,4 %) зафиксирован при доминировании вида в местообитании свыше 90 %. В целом, зараженность малярийных комаров по Томской области оказалась в полтора раза выше, чем немалярийных. Виды паразита Практически все случаи заболевания человека в РФ диагностированы как подкожный или офтальмодирофиляриоз, вызываемый D. repens. В целом, он менее опасен, чем легочный дирофиляриоз, вызываемый D. immitis, но в редких случаях летален. Возбудитель легочного дирофиляриоза также продвигается на север и восток, однако медленнее в сравнении с D. repens. В наших исследованиях D. immitis обнаруживалась с частотой не более 5 %, преимущественно на правом берегу Оби. Севернее 57-й параллели начинается обильная заболоченность, возрастает влажность, многократно увеличивается численность комаров. Это создает предпосылки для возникновения устойчивых эпизоотических, а в последующем — возможно и эпидемических очагов циркуляции легочной дирофилярии. На сегодняшний момент наиболее северная находка D. immitis в промежуточном хозяине в Западной Сибири — 58,5 ° с. ш. (с. Новоселово Колпашевского р-на Томской области), однако вопрос о распространенности этого вида по-прежнему открыт. Устойчивость паразита к субпороговым температурам. Климат Западной Сибири существенно отличается от мягких условий эндемичных регионов ареала дирофилярий. Он изменяется от резко-континентального в южных областях Западной Сибири до влажного континентального, субарктического и арктического — в северных. Перепады суточных температур в период сезона развития дирофилярий в Причерноморье (г. Ялта) в 2020 г. составили 7,2 °С, в с. Чемал (Республика Алтай) — 14,7 °С, в Новосибирске — Александровском (Новосибирская, Томская области) — 12,2-12,7 °С, в Ханты-Мансийске — Октябрьском — Березово — 9,7-9,8 °С. Количество дней, когда температура не опускается ниже пороговой (14 °С), в Ялте — более 150, в Западной Сибири — от 16 (с. Березово) до 40 (г. Барнаул). Наши наблюдения в природе и лабораторные эксперименты показали высокую устойчивость микрофилярий к субпороговым температурам от 0 °С до 14 °С. В частности, при температуре 0 °С (ниже активности переносчика) микрофилярии выдерживали до двух суток без заметных потерь. Анализ полученных данных показал, что по мере экспансии на север микрофилярии адаптировались сначала к высоким перепадам суточных температур в южных областях Западной Сибири и с продвижением на север — к пониженным температурам, а также дефициту эффективных температур. В ходе отбора на холодоустойчивость они перешли с непрерывного типа развития на дискретный (дробный), когда периоды умеренного и быстрого роста чередуются с короткими и (или) длительными остановками. Гостальная специфичность в селекции паразита. Помимо климатических и погодных факторов существенное влияние на отбор паразита оказывают его отношения с местными видами и популяциями комара-переносчика. Со стороны промежуточного хозяина влияние оказывают: 1) генетическая структура популяций комаров, определяющая возможность развития паразита в организме хозяина (особенности поведения, активность ферментов пищеварительной системы, устойчивость иммунной системы), 2) представители местной микрофлоры (бактерии, сапрофитные и паразитические грибы, дрожжи, микроспоридии, протисты и пр.) или паразитофауны (гельминтозы, инфестации), находящиеся с переносчиком в широком спектре отношений — от симбиоза до антагонизма. Наиболее существенное влияние на регуляцию численности паразита (интенсивности инвазии) оказывает реакция меланизации (инкапсуляции) нематод со стороны иммунной системы комара, специфично зависимая от особенностей его генома. У малярийных комаров этот барьер чаще срабатывал на ранних стадиях развития микрофилярий (L1), у немалярийных — на поздних (L2-L3). Представители аборигенной микрофлоры (микробиома), также способны подавлять развитие микрофилярий как конкуренты или патогены на всех стадиях развития, вплоть до инфективной. По предварительным оценкам в западно-сибирских популяциях малярийных комаров паразит вызревает не менее, чем в 6 % случаях от первоначального числа зараженных самок. Ожидаемая доля вызревания микрофилярий составляет не менее 10-12 %. Доля заражений комаров будет возрастать по мере адаптации паразита к местным условиям. Температурные модели развития микрофилярий Для оценки перспектив адаптации дирофилярий построены сезонные и многолетние климатические модели. Их исследование выявило тенденции изменения климата бассейна Оби. Показано увеличение средних значений сезонной суммы эффективных температур за последние 45 лет. Тенденция нарастания среднемноголетних значений эффективных температур наблюдалась по всей Западной Сибири, а ее темпы во многом определялись локальными условиями, что создавало неравномерность изменения параметра в географическом плане. Из моделей следует, что северной границей распространения дирофилярий может стать 64-я параллель (c. Березово), до которой популяции паразита способны поддерживать численность выше критической. При дальнейшем потеплении граница может быть сдвинута на север. Среднегодовые температуры за последние 50 лет в северных областях возрастали вдвое быстрее, чем в южных, но это слабо связано с возрастанием эффективных температур. Анализ среднемесячных температур выявил устойчивую тенденцию к раннему приходу весны и позднему окончанию осени. Выявленные изменения климата благоприятны для адаптации дирофилярий, их экспансии на север. Эпидемический и эпизоотический прогноз по дирофиляриозу не критичен, но неблагоприятен.

Аннотация результатов, полученных в 2021 году
Последние десятилетия дирофиляриоз животных и человека захватывает новые территории в Европе и в азиатской части России продвигаясь на север и северо-восток. Одним из главных переносчиков дирофиляриоза в Западной Сибири выступают малярийные комары. На первом этапе проекта нами были собраны имаго малярийных комаров из восьми регионов Западной Сибири и проведена видовая идентификация дирофилярий и их переносчиков, выбраны модельные популяции комаров для проведения годовых и сезонных исследований главных переносчиков дирофилярий из числа кровососущих комаров, а также, впервые, определения взаимосвязи инверсионного полиморфизма и зараженности комаров дирофилярими. В 2021 году нами были сделаны повторные экспедиции на Алтай и в Ханты-Мансийский автономный округ, а также более детально изучена Тюменская и, впервые, Курганская области. В результате уточнена северная граница доминирования инвазивного вида малярийного комара Anopheles daciae, проведено исследование распространения малярийных комаров Горного Алтая: впервые они были обнаружены в Улаганской долине, а также на южном склоне Курайского хребта ( с. Акташ). Подтверждена северная граница заражения малярийных комаров дирофиляриозом – это 62 градуса и 32 минуты с. ш. (с. Приобье, ХМАО), а также сдвинута на один широтный градус на юг южная граница заражения дирофиляриозом малярийных комаров на Алтае – 52 градуса и 24 минуты с. ш. (с. Катунское, Алтайского края). Двухлетний анализ комаров в пгт. Березово (ХМАО), как и с. Перегрёбное (ХМАО) не выявил заражения. Ранее нами было продемонстрировано, что три вида малярийных комаров из четырех, обитающих в Западной Сибири, способны к передаче дирофиляриоза – An. beklemishevi, An. daciae и An. messeae. На текущем этапе проекта впервые было показано, именно An. messeae выступает в качестве доминантного переносчика возбудителей дирофиляриоза. В агломерации г. Колпашево, где в 2016 году был зарегистрирован случай диофиляриоза человека, а также выявлены заражения возбудителями легочной формы дирофиляриоза – Dirofilaria immitis обитают три вида малярийных комаров. В течение сезона 2021 года взяли четыре выборки малярийных комаров и оказалось, что в первой половине сезона An. messeaе демонстрирует высокое заражение по сравнению с An. beklemishevi и An. daciae. An. beklemishevi в проведенных исследованиях показывает достоверно пониженную частоту заражения по сравнению с An. daciae и, тем более, An. messeae даже в тех населенных пунктах, где он численно преобладает. Связи между зараженностью определенных видов малярийных комаров дирофиляриями D. repens, D. immitis или микстовой инвазией не обнаружено. В природных популяциях Алтайского края (г. Новоалтайск и с. Катунское) с применением подхода молекулярно-генетической идентификации видов малярийых комаров на основе однонуклеотидной замены в последовательности ITS2 обнаружены «гибриды» An. messeae и An. daciae, которые не только с высокой частотой присутствовали в выборках (более 60%) но и проявляли достоверно более высокое заражение. Выявлены и зарегистрированы случаи акаридозов, гельминтозов, микозов, бактериозов кровососущих комаров. Впервые проведено исследование ассоциации инверсионного полиморфизма и зараженности малярийных комаров дирофиляриями. An. messeae и An. daciae характеризуются общим набором полиморфных инверсий в аутосомах – 2R1, 3R1, 3L1 и отличаются по инверсиям в Х хромосоме: X2 – у An. messeae и X0 – у An. daciae (X11-2R00-3R00-3L00 – стандартный кариотип). Изучали модельные популяции комаров в с. Коларово и агломерации г. Колпашево. Показаны достоверные различия между набором инверсий в кариотипах комаров An. daciae и An. messeae и выделены некоторые общие для этих двух видов комаров инверсионный генотип. Так, зараженные комары An. daciae из с. Коларово достоверно чаще имели генотип 3R00 (но не 3R01), а также набор X00-3R00 и X01-3R00 (в с. Коларово нет полиморфизма по инверсиям в 2R и 3L плечах), но в Колпашево они имели только генотип 2R00. Популяция An. messeae в с. Коларово крайне малочисленна и не подходила для оценки, но в г. Колпашево пул зараженных самок этого вида отличался от пула здоровых высокой частотой генотипа (но не 3L01) и, как правило, низкой частотой генотипа 3R11. Кариотипы зараженных самок An. messeae, которые имели достоверные отличия от здоровых, были представлены в виде единичных особей с редкими для этого вида генотипами X12, X22, 2R00. Полученные результаты дают нам основания полагать, что и у An. messeae, и у An. daciae восприимчивые к заражению особи должны иметь кариотип состоящий преимущественно из стандартных вариантов аутосом, но не Х хромосомы – X00(X01, X12, Х22)-2R00-3R00-3L00. Методические трудности описания кариотипов зараженных комаров требуют разработки новых маркеров на основе in situ гибридизации и ПЦР. Поэтому нами проведена разработка маркеров для FISH с митотическими хромосомами комара, а также разрботка праймеров ПЦР, фланкирующих точки разрывов полиморфных инверсий Х хромосомы и хромосомы 2R. Эти подходы позволят определять кариотипы без использования политенных хромосом. Для реконструкции распространения инвазивного вида An. daciae и дирофилярий проведено секвенирование последовательности генов цитохромоксидазы I (COI) у этих организмов в «северных» и «южных» популяциях. Для понимания причин высокой восприимчивости и рефрактерности разных видов комаров к заражению проведено исследование состава микробиома кишечника самок малярийного комара An. daciae, зараженных дирофиляриями на разных стадиях развития с помощью севкенирования 16S рДНК технологией Oxford Nanopore.