Аннотация результатов, полученных в 2020 году
В ходе синтеза белка в результате ошибок транскрипции, повреждения мРНК или действия антибиотиков рибосомы могут быть заблокированы, высвобождение таких рибосом необходимо для выживания бактериальной клетки. Для решения данной проблемы существуют разные системы контроля качества бактериальной трансляции. Наиболее распространённая система высвобождения заблокированных рибосом основана на использовании специализированной транспортно-матричной РНК, которая помогает терминировать трансляцию в отсутствии или в результате пропуска стоп-кодона. В тоже время многие бактерии имеют дополнительных системы высвобождения рибосом, при этом одна из характерных особенностей факторов в них входящих – это GGQ домен, отвечающий за гидролиз связи между тРНК и пептидом. Данный проект посвящен изучению функциональной роли двух бактериальных белков RtcB и PrfH, последний из который имеет сходство с факторами терминации. Гены этих белков всегда располагаются в одном опероне, возможно, они являются еще одной системой высвобождения заблокированных рибосом Несмотря на встречаемость у разных бактерий, в том числе у большинства энтеробактерий, у наиболее распространенного модельного штамма E.coli K12 часть данного оперона отсутствует. Возможно, что в штамме E.coli K12 данная система не функционирует, поэтому для исследований был выбран другой распространенный штамм E.coli ATCC 25992. При помощи нескольких независимых методов в геноме данного штамма нами были удалены вместе и по отдельности гены rtcB и prfH, в качестве контроля аналогичная процедура была проведены и в штамме К12, где были удалены оставшиеся части этих генов. Удаление данных генов приводит к небольшому снижению скорости роста, а также штаммы с делецией проигрывают при конкурентном культивировании штаммам с обоими генами. Для изучения функциональной роли белков RtcB и PrfH были созданы конструкции для наработки и выделения данных белков, с их помощью были получены образцы белков для проведения реакций в бесклеточных системах. RtcB обладает сходством с белками семейства РНК-лигаз, способных лигировать 5’-OH c 3'-фосфатом, однако полученный в данном исследовании белок не продемонстрировал подобной активности в модельной реакции. В связи с наличием GGQ мотива у белка PrfH мы предположили, что он может терминировать синтез белка в обычных или специфических условиях. Удалось показать, что данный белок не может заменить собой фактор терминации RF1 или RF2 при классической терминации, однако способен высвобождать застрявшие рибосомы. При помощи тоепринтинга было обнаружено, что PrfH может высвободить застрявшие под действием макролидов или хлорамфеникола рибосомы, а также были обнаружены и изучены новые ингибиторы синтеза белка, вызывающие остановку трансляции.

Аннотация результатов, полученных в 2021 году
На втором году исследования мы сосредоточились на обнаружении функциональной роли генов оперона rtcB2-prfH при различных стрессовых условиях. Стремясь выживать и процветать в окружающей среде, разные виды бактерий постоянно взаимодействуют и конкурируют за ресурсы и пространство. Некоторые из них приспособились к использованию различных антибиотиков и токсинов для борьбы с соперниками. Одновременно они развили способность противостоять направленному против них оружию. Некоторые бактерии содержат колициногенные плазмиды, которые кодируют токсины, нарушающие работу аппарата трансляции. Один из них риботоксин колицин Е3 вызывает расщепление 16S рРНК в центре декодирования рибосомы, чтобы выживать в присутствии таких риботоксинов, бактерии должны были выработать механизмы противодействия. Недавние исследования продемонстрировали роль модуля PrfH и RtcB2 в спасении поврежденной рибосомы и последующем повторном лигировании расщепленной 16S рРНК колицином Е3 в бесклеточной системе. В текущем годы мы показали, что модуль RtcB2-PrfH придает устойчивость к токсичности колицина E3 в клетках E.coli ATCC25922. Мы показали, что жизнеспособность штамма E. coli ATCC25922, лишенного генов rtcB2 и prfH, нарушается под действием колицина Е3, в отличие от родительского штамма с интактными генами rtcB2 и prfH. Комплементация нокаутного гена rtcB2 и prfH плазмидой с высоким числом копий, кодирующей либо только RtcB2, либо оперон RtcB2-PrfH, восстанавливала устойчивость к колицину E3. Эти результаты подчеркивают систему противодействия конфликтам, которая эволюционировала, чтобы помешать активности колицина E3. Кроме того нами был изучен механизм действия антибиотика аргирина Б, нарушающего транслокацию, рибосомы заблокированные этим антибиотиком могут быть потенциальной мишенью для действия системы rtcB2-prfH. Также нами был проведен поиск новых ингибиторов синтеза белка и обнаружены молекулы из класса альдгамицинов, для которые ранее был неизвестен механизм действия. Альдгамицины структурно похожи на макролиды, однако ранее для них не была показана способность ингибировать синтез белка.

Аннотация результатов, полученных в 2022 году
В процессе эволюции прокариотические клетки разработали целый арсенал инструментов для выживания. Многие бактериальные популяции являются носителями колициногенных плазмид, которые они используют в стрессовых условиях. В нашей работе мы продемонстрировали защитный эффект, оказываемый модулем rtcB2-prfH в ответ на обработку колицином E3 (ColE3). На данном этапе проекта мы показали в условиях in vitro, что RtcB2 может осуществлять репарацию 16S рРНК, разрезанной колицином E3, не только в составе «свободных» рибосом 30S или 70S, но и в составе “застрявших” транслирующих рибосом 70S. Мы также показали, что PrfH способен вытеснять «застрявший» пептид из повреждённых ColE3-70S рибосом и способствовать ре-инициации трансляции. Это свидетельствует о том, что поврежденные ColE3-70S с помощью системы rtcB2-prfH могут восстанавливаться и продолжать синтезировать полноразмерные белки в стрессовых условиях. При этом другие риботоксины, разрезающие тРНК, а не 16S рРНК, не являются мишенями для модуля rtcB2-prfH. Кроме того, мы разработали репортерную систему, которая позволяет детектировать RtcB2 и PrfH, меченные, соответственно, Flag и HA, с помощью Вестерн блоттинга, и впервые продемонстрировали индукцию обоих белков в клетках в ответ на обработку ColE3. Наличие эпитопов никак не влияло на функциональность RtcB2 и PrfH, таким образом данные конструкции могут быть широко использованы в дальнейшем для поиска ингибиторов и активаторов данной защитной системы бактерий. На основе биоинформатических данных мы предсказали наличие малой ОРС в 5’-UTR оперона rtcB2-prfH и предложили механизм регуляции его экспрессии, основанный на переключении вторичных структур РНК в процессе трансляции лидерного пептида LP. Наличие стабильных РНК-шпилек было косвенно подтверждено в ходе экспериментов по определению стартовой точки транскрипции, однако наиболее достоверные данные были получены в случае мутаций в малой ОРС. Мы впервые показали, что делеция LP, так же, как и аминокислотные замены в предполагаемом консервативном домене TLCR, приводит к дисфункции всего оперона rtcB2-prfH и снижению выживаемости клеток E. coli в присутствии ColE3. Кроме того, мы обнаружили, что активация экспрессии нативного оперона rtcB2-prfH происходит не только в ответ на обработку ColE3, но и в присутствии хлорамфеникола, что позволяет предположить еще более значимую роль белков RtcB2 и PrfH в модуляции защитных механизмов клетки, в том числе при действии антибиотиков.