Аннотация результатов, полученных в 2020 году
В рамках данного проекта мы планируем создать эффективную систему доставки миРНК на основе липидных наночастиц и частиц берлинской лазури для терапии заболеваний печени. Присутствие частиц берлинской лазури будет обеспечивать снижение уровня активных форм кислорода (АФК) в клетках (антиоксидантная активность) и уменьшение воспаления, а также защищать миРНК от действия АФК. На первом году проекта нами были отвалидированы миРНК к различным белка-мишеням (убиквитин-лигазы, Ras-связанный белок, ганкирин). Также были синтезированы наночастиц берлинской лазури различного диаметра, проведена их физико-химическая харатеристика, оценена каталитическая активность, проведена оценка цитотоксичности и антиоксидантной активности. Полученные наночастицы стабильны при хранении в растворе электролита 0.1М КСl/0.1M HCl и сохраняют свой гидродинамический размер (38, 57 или 98 нм) после диспергирования и обработки в ультразвуковой ванне. Было показано, что с увеличением диаметра наночастиц берлинской лазури растет их каталитическая активность (от 610±50 с-1 для 38 нм НЧ БЛ до 5371±80 с-1 для 98 нм НЧ БЛ.). С помощью проточной цитометрии было показано, что все полученные частицы обладают антиоксидантной активностью и не обладают цитотоксическим эффектом на культуре гепатоцитов мыши. Синтезированные наночастицы берлинской лазури были использованы для разработки методики синтеза липидных наночастиц. Липидные наночастицы синтезировали путем смешения растворов липидов, миРНК и НЧ БЛ различного диаметра в микрофлюидном картридже. Увеличение размеров НЧ БЛ ведет к увеличению диаметра итоговых частиц (с 150 нм до 250 нм), а также их каталитической активности (до 667 с-1). Эффективность загрузки НЧ БЛ составила не менее 85-90%, что также было подтверждено с помощью крио-электронной микроскопии. Было показано, что все липидные наночастицы содержат НЧ БЛ. На основе полученных данных было принято решение попробовать уменьшить загрузку НЧ БЛ в липидные наночастицы с целью возможности уменьшения итогового размера. Было показано, снижение эффективности загрузки НЧ БЛ, а также уменьшение количества загружаемых НЧ БЛ (50 нм) в 4 раза возможно получить гибридные липидные частицы с диаметром 95 нм. В следующем году планируется оценить влияние снижения загрузки НЧ БЛ на антиоксидантную активность итоговых частиц. Также была оценена цитотоксичность синтезированных гибридных липидных наночастиц, содержащие НЧ БЛ и миРНК к ганкирину. Данные частицы эффективно подавляют пролиферацию клеток и влияют на их жизнеспособность по сравнению с контрольными частицами (липидные наночастицы с миРНК к ганкирину, липидные наноастицы с миРНК к люциферазе, липидные наночастицы с НЧ БЛ и миРНК к люциферазе). Полученные данные позволяют предположить эффективность разработанных частиц, которую планируется оценить в рамках проекта в следующем году

Аннотация результатов, полученных в 2021 году
В рамках второго года проекта нами были запланированы работы по оценке эффективности разработанных гибридных наночастиц для улучшенной доставки миРНК в печень в экспериментах на культуре гепатоцитов, а также в модели гепатоклеточной карциномы. Ранее было показано, что наночастицы берлинской лазури обладают высокой антиоксидантной активностью и не обладают цитотоксичным эффектом, при этом увеличение размера НЧ БЛ ведет к повышению каталитической активности и как сдествие, увеличнению результирующего диаметра при загрузке в липидные частицы (с 150 нм до 250 нм). Нами было проведена оценка биораспределения частиц различного диаметра и продемонстрировано, что оптимальным размером для доставки миРНК в печень являются частицы диаметром 80-110 нм. В связи с этим на второго году проекта была проведена оптимизация синтеза гибридных липидных частиц и получены частицы с различным соотошением миРНК: НЧ БЛ, используя НЧ БЛ различного диаметра (30, 50 и 120 нм), проведена их физико-химическая характеристика. Было показано, что при загрузке НЧ БЛ в липидные частицы при соотношении миРНК:НЧ БЛ =1:8 получаются частицы диаметром 87 нм и высокой каталитической активностью (k cat 2.2*10^3 c-1). Эффективность загрузки миРНК при этом составила около 50% при любом варианте синтеза. С помощью проточной цитометрии было показано, что липидные наночастицы с НЧ БЛ демонстрируют более высокую антиоксидантную активность по сравнению с неинкапсулированными НЧ БЛ на культуре клеток AML12. Методом ОТ-ПЦР было показано, что полученные частицы также улучшают эффективность ингибирования мРНК ганкирина по сравнению с липидными наночастицами без НЧ БЛ на культуре гепатоцитов Hepa 1-6. Полученные данные были также подтверждены в эксперименте при введении гибридных липидных частиц здоровым животным. Частицы, содержащие НЧ БЛ, позволяют увеличить эффективность ингибирования мРНК ганкирина, по сравнению с контрольными частицами через 72 часа после внутривенного введения. На основе совокупности полученных данных нами были выбраны частицы, содержащие НЧ БЛ 120 нм, для дальнейших экспериментов. Для финального этапа работ нами была проведена валидация модели гепатоклеточной карциномы на мышах путем гидродинамической инъекции плазмид в хвостовую вену мыши. Было показано, что с 3 по 14 день развития опухолевого процесса наблюдается повышение провоспалительных цитокинов, маркеров активации антиоксидантных систем (пероксиредоксинов, глутатионпероксидаз), повышение АЛТ/АСТ в сыворотке крови. Развития опухолевого процесса было также подтверждено с помощью гистологического анализа (гематоксилин-эозин) и соотношения веса печени к общему весу мыши. Повышение уровня активных форм кислорода было также подтверждено с помощью электрохимической микроскопии. Было показано, что однократно введение гибридных НЧ БЛ-липидных наночастиц с миРНК позволяет снизить уровень мРНК ганкирина после однократного введения. Полученные системы могут стать перспективным инструментом для доставки малых интерферирующих РНК в терапии гепатоклеточной карциномы.