Аннотация результатов, полученных в 2020 году
Настоящий проект направлен на изучение цитогенетических и молекулярных механизмов элиминации одного из родительских геномов в ходе гаметогенеза межвидовых гибридов из комплекса среднеевропейских зеленых лягушек Pelophylax esculentus. В ходе выполнения первого этапа проекта был разработан протокол идентификации хромосом P. lessonae на препаратах митотических и мейотических хромосом и тканях гонад с использованием зонда к видоспецифичному повтору. Двуцветная FISH с двумя видоспецифичными зондами впервые позволила надежно идентифицировать геномы обоих родительских видов в митозе и мейозе. Кроме того, разработанный подход позволил впервые идентифицировать геномы обоих родительских видов и плоидность клеток на стадии интерфазы. Для того, чтобы подтвердить элиминацию одного из геномов родительских видов до мейоза мы идентифицировали хромосомные наборы в мейозе у диплоидных гибридных самцов из различных популяционных систем, в которых гибриды обитают с особями P. lessonae (L-E тип), расположенных на территории Словакии и Марий Эл, а также популяционных систем, в которых гибриды обитают с обоими родительскими видами (R-E тип), расположенных на территории Чехии. Мы обнаружили, что большинство диплоидных гибридных самцов из популяционных систем L-E типа производят сперматоциты с 13 бивалентами P. ridibundus, что свидетельствует о премейотической элиминации генома P. lessonae. У диплоидных гибридных самцов из популяционных систем R-E типа мы обнаружили сперматоциты с 13 бивалентами P. ridibundus и сперматоциты с 13 бивалентами P. lessonae. Это свидетельствует о том, что у диплоидных гибридных самцов из популяционных систем R-E типа в гонадах одновременно существуют несколько популяций зародышевых клеток, способных элиминировать один из родительских геномов до начала мейоза. Кроме того, в ходе анализа сперматогенеза гибридных самцов из популяционных систем L-E и R-E типов мы обнаружили сперматоциты с 26 унивалентами, свидетельствующие о нарушениях элиминации и эндорепликации геномов. Следует отметить, что у гибридных самцов из популяционных систем R-E типа таких нарушений было значительно больше. В ходе анализа гонад взрослых гибридных самцов и самок мы не обнаружили микроядер, что свидетельствует об отсутствии элиминации геномов у взрослых животных. В гонадах гибридных головастиков, полученных от скрещивания исследуемых гибридов, мы обнаружили микроядра в цитоплазме зародышевых клеток. С помощью FISH с зондами к двум видоспецифичным повторам, мы обнаружили, что у гибридных головастиков, полученных от скрещивания диплоидных гибридных самок и самцов из популяционной системы L-E типа, микроядра содержат хромосомы P. lessonae. В то же время, у гибридных головастиков, полученных от скрещивания гибридов из популяционной системы R-E типа, мы обнаружили как микроядра с хромосомами P. ridibundus, так и микроядра с хромосомами P. lessonae, что подтверждает результаты анализа гаметогенеза у взрослых гибридных самцов. В отчетном году мы также проанализировали распределение эпигенетических модификаций гистона H3 (H3S28, H3S10, H3T11), связанных с конденсацией и деконденсацией хромосом в профазе, метафазе и анафазе митоза гониальных клеток. Мы не обнаружили различий в фосфорилировании и дефосфорилировании исследуемых модификаций гистона H3 между хромосомами, не способными прикрепиться к веретену деления, и остальными хромосомами в клетках зародышевого пути в гонадах гибридных головастиков. По итогам выполнения первого года проекта подготовлено две статьи (одна статья направлена в журнал, одна статья на финальной стадии внесения исправлений). Результаты представлены на 2х конференциях в виде постерного и двух устных докладов (Международная научная конференция студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов», Москва; 59-я Международная научная студенческая конференция, Новосибирск). Результаты работы вошли в бакалаврскую диссертацию Безлепкиной Светланы, СПБГУ.

Аннотация результатов, полученных в 2021 году
Текущий проект направлен на изучение цитогенетических и молекулярных механизмов, а также роли избирательной элиминации одного из родительских геномов в ходе раннего гаметогенеза межвидовых гибридов из комплекса среднеевропейских зеленых лягушек в комплексе Pelophylax esculentus. В ходе выполнения второго этапа проекта мы провели цитогенетический анализ видоспецифических повторов на хромосомах близкородственных видов для P. ridibundus (P. kurtmuelleri и P. epeiroticus), а также близкородственного вида для P. lessonae (P. shqipericus). В результате двуцветной FISH с двумя видоспецифичными зондами повтор Ples289 (специфичный для хромосом P. lessonae) не был обнаружен у P. kurtmuelleri и P. epeiroticus, в то время повтор RrS1 (специфичный для P. ridibundus) был обнаружен у этих видов. На хромосомах P. shqipericus были обнаружены оба повтора Ples289 и RrS1. Для того, чтобы проверить возникает ли элиминация генома у гибридов F1, мы проанализировали головастиков, полученных от скрещиваний P. ridibundus и P. lessonae друг с другом и с близкородственными видами. Мы обнаружили, что у головастиков, полученных от скрещивания P. ridibundus и P. lessonae, в цитоплазме ядер зародышевых клеток присутствуют микроядра. Помимо микроядер мы также обнаружили отстающие хромосомы во время митозов клеток зародышевой линии. В результате идентификации геномов родительских видов показано, что в большинстве микроядер присутствуют хромосомы P. lessonae. Кроме того отстающие хромосомы являются хромосомами P. lessonae, что свидетельствует об избирательной элиминации хромосом P. lessonae у гибридов F1, полученных от скрещивания P. ridibundus и P. lessonae. Однако у гибридных головастиков, полученных в результате скрещивания P. ridibundus и P. lessonae с родственными видами (P. kurtmuelleri, P. shqipericus и P. epeiroticus), в цитоплазме клеток зародышевой линии микроядера не были обнаружены. Мы продолжили анализ геномной композиции хромосом в сперматоцитах гибридных самцов из популяционной системы R-E типа. Сходно с результатами, полученными в ходе выполнения первого этапа проекта, мы показали, что диплоидные гибридные самцы из популяционной системы R-E типа характеризуются значительными нарушениями гаметогенеза, связанные с формированием сперматоцитов с 26 унивалетнами. Однако такие самцы также производили сперматоциты с 13 бивалентами P. ridibundus и сперматоциты с 13 бивалентами P. lessonae, что свидетельствует о потенциальной возможности таких самцов формировать одновременно два типа гамет: гаплоидных гамет с геномом P. ridibundus и гаплоидных гамет с геномом P. lessonae. Кроме того, идентифицированы геномы в клетках зародышевой линии у головастиков, полученных от скрещивания самцов, для которых проведен анализ мейоза. Показано, что в микроядрах, посредством которых происходит элиминация одного из родительских геномов, присутствуют хромосомы как P. ridibundus, так и P. lessonae. В результате идентификации геномов с помощью 3D FISH показано, что ядра некоторых зародышевых клеток являются анеуплоидными, что свидетельствует о постепенной элиминации одного из родительских геномов. Во время деления клеток зародышевого пути в гонадах гибридных головастиков, в анафазе мы впервые обнаружили нарушение дефосфорилирования гистонов H3S28P и H3S10P в отстающих хромосомах, по сравнению с остальными хромосомами. Кроме того, в кинетехорах отстающих хромосом мы обнаружили Аврора B киназу, что свидетельствует о нарушении сегрегации сестринских хроматид. Кроме того, мы впервые показали связь отставания хромосом и заключения их в микроядра, так как некоторые микроядра содержат эпигенетическую модификацию H3S28P. В отчетном году мы также провели секвенирование поли(А) РНК и сборку транскриптома гонад головастиков родительских видов (P. ridibundus и P. lessonae) и гибридов P. esculentus, у которых наблюдается формирование микроядер, и межвидовых гибридов между P. ridibundus и P. shqipericus, у которых микроядра не были обнаружены. Были определены дифференциально экспрессирующиеся гены между гонадами родительских видов и двух форм гибридов. По итогам выполнения второго года проекта одна статья опубликована в журнале Biological Reviews (IF = 11.70), другая статья принята к публикации в журнале PloS One (IF = 3.24). Результаты представлены на 2х международных конференциях в виде стендового и устного докладов (13th European cytogenomic conference; EMBO Workshop on Chromosome segregation and aneuploidy).