Аннотация результатов, полученных в 2020 году
Трансдермальные (ТД) препараты (такие как эстрадиол) с контролируемым высвобождением лекарственных средств приобретают все большее значение в фармацевтической промышленности, курс которой направлен на переход к неинвазивному и щадящему для пациента лечению. Импрегнация таких препаратов в трансдермальные патчи с помощью сверхкритического (СК) СО2 обладает рядом преимуществ над традиционными методами. В данной работе исследуются растворимость эстрадиола в объёмно-расширенной смеси этанола и СК СО2, а также структурные изменения, которые претерпевает препарат в такой среде. Было показано, что в СК смеси СО2+этанол при давлениях СО2 выше 200 атм эстрадиол оказывается растворим при концентрации эстрадиола 5 мг/мл в исходном этанольном растворе, что соответствуют современным требованиям по содержанию препарата при введении гормонов в кровь. Обнаружено, что обработка эстрадиола в СК флюиде позволяет снизить размер исходных кристаллитов лекарства примерно в 30 раз, что может повысить равномерность релиза эстрадиола при ТД доставке. А выявленное отсутствие изменений химической структуры гормона при СК расвторении указывает на сохранение лекарственных свойств препарата. В связи с общим вектором развития науки и производства, направленным на бережное отношение к экологии, а также на отказ от использования потенциально аллергенных веществ в биомедицинской сфере, на передний план выходят исследования в биосовместимых и не требующих последующей нейтрализации растворителях, таких, как вода, насыщенная СО2 под высоким давлением (раствор угольной кислоты). Впервые из растворов производного возобновляемого природного полимера хитина, хитозана, в угольной кислоте, а также из композитов на основе таких растворов, сшитых нецитотоксичным агентом природного происхождения генипином получены полимерные губки. Механико-прочностные свойства и внутренняя микроструктура таких пористых объектов была сопоставлена с параметрами аналогичных хитозановых изделий, но полученных в традиционном растворителе для этого полимера - уксусной кислоте. Показано, что добавление сшивающего агента генипина в количестве ~2 вес. % к растворам хитозана в угольной кислоте приводит к уменьшению среднего размера пор ~ в 2,5 раза и значительному улучшению прочностных характеристик получаемых материалов по сравнению с исходной губкой. Полученные результаты имеют важное значение для конструирования новых материалов, в том числе, патчей для трансдермальной доставки биоактивных веществ и лекарственных препаратов. Выявление стратегий эффективной доставки гидрофобных лекарственных средств с целью улучшения их терапевтических свойств и биодоступности является одним из важных направлений исследований в области биомедицины. Технологии сверхкритических флюидов имеют большой потенциал в области создания полимерных носителей с внедрёнными гидрофобными лекарственными средствами. Благодаря высокой диффузии и низкой вязкости сверхкритического флюида и отсутствию сил поверхностного натяжения при сверхкритической импрегнации можно как сохранить неповрежденной пористую структуру матрицы носителя, так и добиться равномерного распределения лекарственного средства в объеме полимерного патча. В настоящей работе показана возможность создания композитных матриц, в основе которых лежит биополимер хитозан с внедрённым сверхкритическим способом эстрадиолом. При этом было продемонстрировано, размер внедрённых кристаллитов не превышает 50 мкм, а распределены эти кристаллиты равномерно по всему объёму полимерной губки. Установлены параметры процедуры импрегнации, при которых происходит максимальная загрузка препарата в матрицу - 600 атм, 35 ° С, 6 часов. Показано, что уменьшение концентрации эстрадиола в реакторе приводит также к уменьшению концентрации препарата в полимерной губке. Плюроники представляют собой семейство триблоксополимеров типа ABA, построенных из двух типов блоков линейных макромолекул: полиэтиленоксида (ПЭО) и полипропиленоксида (ППО). Центральная часть молекулы представлена гидрофобным блоком ППО, а по бокам находятся гидрофильные блоки ПЭО. Плюроники – амфифильные молекулы и при определенных условиях (температура, концентрация) они способны к самоорганизации с образованием как отдельных мицелл, так и новых мезофаз, формируемых из них. Pluronic® F127 используется для формирования различных субстанций фармацевтического назначения (гели, мази, растворы, суспензии), в том числе для включения плохорастворимых в воде гормональных препаратов. В литературе не существуют примеров исследования поведения полоксамеров в среде угольной кислоты под высоким давлением. Исследование данного вопроса представляет как фундаментальный интерес, так и имеет прикладное значение ввиду использования данной среды в проекте для растворения хитозана и формирования новых гелей. В данной работе впервые установлено что плюроник F127 в угольной кислоте подвергается обратимому загеливанию, которое можно контролировать с помощью изменения давления в системе. Было показано, что степень заполнения подложки ультратонким нанометровым покрытием из плюроник F127 и толщина такого покрытия увеличиваются при увеличении ионной силы среды и уменьшения pH среды. Также было обнаружено, что при нагреве раствора происходит самоорганизация макромолекул в мицеллы с максимальным размером 20,5 ± 0,1 нм. Внесение добавок неионогенных биосовместимых ПАВов (таких как плюроники) в растворы полимеров улучшает коллоидную стабильность этих растворов, уменьшает их поверхностное натяжение, что существенно упрощает последующие процедуры формирования материалов из них. Поэтому в рамках данной работы представляет интерес исследование закономерностей получения композитных гелей хитозан-плюроник. В качестве первого этапа была проанализирована зависимость морфологии получемых губок от концентрации плюроника. Было показано, что увеличение концентрации плюроника меняет морфологию поверхности гелей от рыхлой пористой до закрытой сетчатой структуры.

Аннотация результатов, полученных в 2021 году
Сегодня одной из важных и актуальных задач, стоящих перед человечеством, является забота об окружающей среде. Поэтому существенный аспект современных разработок - это их экологическая безопасность. Особенно большую роль она играет для материалов, используемых в пищевой и медицинской отраслях промышленности. Примером такого материала может служить хитозан – биосовместимый, нетоксичный полимер, обладающий антимикробной и гемостатической активностью. В представленной работе мы предлагаем технологию получения хитозановых патчей для трансдермальной доставки лекарств (эстрадиола и этинилэстрадиола), в которой в качестве растворителя для хитозана используется раствор угольной кислоты под высоким давлением СО2, а в качестве экологичной замены органическим растворителям для импрегнации лекарства в хитозановые губки – сверхкритический СО2. Эти среды самонейтрализуются при снятии давления, и потому полностью биосовместимы и не требуют очистки от остатков растворителей. Было исследовано влияние молекулярной массы хитозана и химического сшивания полимерных цепей на механико-прочностные свойства губок, их внутреннюю структуру. Сравнительный анализ кривых растяжения для всех полученных губок показал, что патчи из более высокомолекулярного хитозана обладают большей устойчивостью к силе деформации, однако обладают меньшей растяжимостью, а также при добавлении большего количества генипина губка рвётся при меньшей силе воздействия, но при этом становится более устойчивой к растяжению. Также с помощью СЭМ были оценены микроструктура и пористость патчей и была обнаружена тенденция к появлению более крупных пор с увеличением процентного содержания сшивающего агента в губках. Методом УФ-спектроскопии были исследованы закономерности высвобождения эстрадиола из различных композитных патчей на основе хитозана с применением вертикальной диффузионной ячейки Франца. Разработана и апробирована методика определения эстрадиола в пробах с низким содержанием гормона с применением метода флуориметрии. Для уточнения механизма диффузии лекарственного средства использовали две математические модели: модель Korsmeyer-Peppas и модель Higuchi. Определены основные параметры, определяющие скорость высвобождения гормонального препарата. Установлено, что высвобождение эстрадиола не подчиняется закону Фика (аномальное поведение) и наилучшим образом описывается в рамках модели Higuchi. Показано, что релиз гормонального препарата происходит в течение длительного времени (6 дней). Была разработана новая ультрачувствительная методика определния малых количеств импрегнированного эстрадиола в биополимерную матрицу методом радиоактивных индикаторов. Валидация данного метода была проведена с помощью сопоставления результатов с методом изучения кинетики загрузки лекарственных средств с помощью флуоресцентной спектроскопии. Наблюдался плавный релиз эстрадиола в системе, моделирующей функционирование медицинского устройства местного назначения (пластыря для ГЗТ) с выходом десорбции на плато в течение первых суток. Выделялось около 40 % всего импрегнированного эстрадиола, что позволяет применять такое устройство и для пролонгированной терапии. Среднее количество импрегнированного эстрадиола оказалось равным (1,1±0,2) вес.%. Были изучены процессы самоорганизации смеси блок-сополимера плюроника и полимера природного происхождения хитозана под высоким давлением СО2 с помощью ячейки высокого давления, снабженной сапфировыми окнами. В результате впервые было установлено, что смесь плюроника F127 (1.25 %)/хитозана (0.25 %) даже при низких концентрациях и при комнатной температуре с диоксидом углерода при высоком давлении способно к загеливанию, при этом, при дальнейшем повышении давления до 1500 атм система переходит в гомофазное состояние клатратных гидратов с включенными молекулами диоксида углерода и полимеров. Установлены параметры перехода смесь плюроника F127 (1.25 %)/хитозана (0.25 %) в гелеобразное состояние и гомофазное состояние в среде угольной кислоты под высоким давлением. Были исследованы закономерности адсорбции структур из растворов системы плюроник/хитозан в угольной и уксусной кислоте. Установлено, что морфология поверхности адсорбированных структур определяется ионной силой растворителя, что связано с предполагаемой структурой комплексов плюроник/хитозан в растворах. Было предложено, что комплексы представляют собой композиты с хитозановым ядром и оболочкой плюроника с отрицательно заряженными полиоксиэтиленовыми частями на внешней границе. С помощью модельных экспериментов с применением модельных подложек с различным зарядом поверхности было доказано данное предположение. Была изучена внутренняя микроструктура получаемых композитов на основе плюроника и хитозана, а также характер взаимодействия двух полимеров. Методом СЭМ исследована внутренняя микроструктура полимерных композитных губок на основе хитозана и плюроника. Показано, что для губок, полученных из угольной кислоты добавление плюроника приводит к появлению сплошной сетки открытых мелких пор с размером уже в нанометровом диапазоне – порядка несколько сотен нм. Методом ТГА показано, что композитные губки на основе хитозана отличаются большей термической устойчивостью, чем полимерные губки без добавления плюроника, что также указывает на взаимодействие двух полимеров. Также были изучены механические свойства получаемых композитов на основе плюроника и хитозана. Оказалось, что добавление 1 % вес. не оказывает существенного влияния на механическую прочность губки, в то время как увеличение содержания добавки плюроника до 5% приводит к повышению прочности губки и снижению её эластичности. Была произведена оценка количества эстрадиола внутри таких композитов. Была разработана методика получения мицелл, с включенным гормональным препаратом эстрадиолом. Разработанная методика получения мицелл с инкапсулированным эстрадиолом позволяет получать мицеллы с загрузкой препарата 9.6 %, при этом эффективность загрузки составляет почти 90 %. Содержание эстрадиола в композитах на основе хитозана и плюроника, полученных физическим смешением полимеров в растворах кислот (угольной и уксусной) и последующей лофилизацией этих растворов, составило (18 ± 2) мкг/мг. Показано, что добавка плюроника в полимерную губку значительно улучшает биодоступность эстрадиола, не влияя при этом на механизм выхода препарата. Продемонстрировано, что релиз гормонального препарата происходит в течение длительного времени – за 72 часа в среду высвобождается около 25 % гормонального препарата. Был исследован процесс растворения гормона в 0,04% смеси более доступного синтетического гормонального препарата этинил эстрадиол/CO2 путем визуального наблюдения в оптическом реакторе. Растворение гормона наблюдалось при условиях 35 ºC/740 атмосфер и 40 ºC/793 атмосфер. За отчётный период было подготовлено к публикации 6 статей – одна из них опубликована (“Chitosan oxidative scission in self-neutralizing biocompatible solution of peroxycarbonic acid under high-pressure CO2” Journal of Applied Polymer Science - https://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/app.52514), одна находится на финальной стадии рецензирования (“Supercritical impregnation of chitosan sponges with 17β-estradiol” Journal of CO2 Utilization – Q1), одна находится на начальной стадии рецензирования (“Water saturated with pressurized CO2 as a tool to create various 3D morphologies of composites based on chitosan and copper nanoparticles”, Carbohydrate Polymers – Q1), и для трёх статей получены основные результаты и написан основной текст статьи (“Regularities of formation of ultrathin chitosan/F127 coatings in acetic and carbonic acid”; “Carbonic acid assisted preparation of matrix type chitosan transdermal delivery system supercritically impregnated with β-estradiol”; “Transdermal composite biopatches based on chitosan and pluronic F127 micelles encapsulated with 17betha-estradiol”).

Аннотация результатов, полученных в 2022 году
Было установлено, что при очень высоких давлениях 120-150 МПа в смеси плюроник/хитозан наблюдается переход в гомофазное состояние. В то время как для раствора хитозана наблюдается фазовое разделение плотной флуктуирующей фазы раствора с диоксидом углерода со смазанной границей раздела фаз. Для раствора плюроника также наблюдается почти полное размытие границы раздела фаз. Для смеси плюроник/хитозан наблюдается следующая эволюция фазового состояния при введении диоксида углерода с возрастающим давлением– сжатие раствора (гораздо более сильное, чем для обычного раствора хитозана), сжижение CO2 (10-20 МПа), смешивание жидкого CO2 с системным раствором (30-60 МПа), переходные процессы с существованием нескольких фаз (CO2 в виде жидкого льда, хитозан/плюроновый гель) при 120-150 МПа и увеличение равновесное гомофазное состояние без фазовых границ, представляющее собой состояние клатратных гидратов воды с включенными в них молекулами плюроника, хитозана и диоксида углерода. Газогидраты, или клатратные гидраты, представляют собой группу нестационарных кристаллических соединений, похожих на лед, образующихся в результате сочетания воды и “гостевых” молекул подходящего размера в условиях низкой температуры и высокого давления (Sloan, 1998). Обнаруженное фазовое состояние системы смеси плюроник/хитозан коррелирует с литературными данными о существовании клатратных гидратов кубической структуры I (CS-I), существующих даже при комнатной температуре, но при высоких давлениях 100-500 МПа (Nakano, Moritoki, Ohgaki, 1998). В ходе исследования характеристик растворов была установлена значительная разница в величине дзета-потенциала для систем хитозан/плюроник в углекислоте и уксусной кислоте (Таблица 1.3.3.1.). Данное различие очевидно, обусловлено степенью заряда полимерных цепей в различных растворителях. При более слабой степени заряженности макромолекул хитозана гидрофильные плюроновые группы экранируют положительно заряженные группы хитозана, поэтому покрытие не занимает всю площадь подложки, в отличие от случая нанесения из растворов в уксусной кислоте (Таблица 1.3.3.1.). Действительно, в этом случае плотность заряда макромолекул хитозана высока и преобладает электростатическое притяжение между отрицательно заряженным субстратом и положительно заряженными аминогруппами хитозана. Было обнаружено, что в случае экспозиции смеси плюроник/хитозан на подложку адсорбируются полимерные комплексы в виде компактных "островков" высотой около 100 нм, образованных из большого количества агрегированных мицелл. В то же время большая часть площади подложки остается свободной или занята отдельными мицеллами или их небольшими скоплениями. Размеры отдельных мицелл составляют около 70±15 нм. Наибольшая компактификация полимерных структур в случае осаждения из растворов с клатратными гидратами может быть объяснена очень слабым зарядом плоскости подложки в специальной слабополярной среде, богатой СО2. Оказалось, что просто хитозан в концентрации, соответствующей концентрации этого компонента в исследуемой системе, адсорбируется равномерно по поверхности, но поверхность такого покрытия имеет игольчатую, довольно шероховатую морфологию. Высота слоя хитозана составляет около 10-15 нм. Морфология плюроника характеризуется фрактальной структурой, которая отличается от случая осаждения углекислоты большей компактификацией и конденсацией плюроника. Высота фрактальных структур составляет около 30-40 нм. В случае смеси плюроник/хитозан большая часть гидрофильных частей плюроника связана с молекулами хитозана и в слабополярной среде (клатратные гидраты) имеет тенденцию к большей агрегации из-за высоких флуктуаций и экранирования положительно заряженных звеньев хитозана, что нивелирует взаимодействие со слабозаряженным субстратом поверхность. Высота таких структур (образованных из мицелл плюрона/хитозана) составляет 80-100 нм. Таким образом, из исследования поведения компонентов смеси и смеси плюроник/хитозан следует, что в среде высокого давления плюроник и хитозан образуют структуры с оболочкой из гидрофобных "хвостов" плюроника, в сердцевину которых заключены молекулы полимера. Была исследована кинематика адсорбции плюроника (при росте концентрации) из среды клатратных гидратов путём сравнительного анализа микрографий адсорбированных структур плюроника при низкой и высокой концентрации плюроника. Оказалось, что даже при низкой концентрации, много меньше ККМ при данной температуре (1-7 г/л при 25°С [Gyulai et. al.// eXPRESS Polymer Letters 10 (2016) 216–226]), макромолекулы плюроника стремятся к агрегации. Даже при низкой концентрации плюроника на поверхности модельной подложки проявляются области, не занятые полимером, которые при дальнейшей адсорбции макромолекул превращаются в пустые области, ограниченные фрактальными структурами плюроника. При этом, установлено, что при таких низких концентрациях плюроник F127 представлен в растворе в виде отдельных макромолекул, о чем свидетельствует АСМ микрографии при высоких разрешениях, на которых отчетливо можно выделить отельные макромолекулы с характерным размером контурной длины L~100 нм. Показано, что этинил эстрадиол оказывается растворим при довольно низких значениях плотности CO2 в исследованном интервале температур 40-70ºC, при этом наблюдается небольшой рост значений давления фазовой сегрегации с ростом концентрации. Добавление небольшого количества этанола позволило качественно значительно улучшить растворимость этинил эстрадиола в CO2. Процесс фазовой сегрегации для тройной смеси начинает происходить при более высоких давлениях во всем диапазоне исследуемых температур, что может быть связано с увеличением растворенного вещества гормона в фазе богатой CO2. Добавление плюроника не позволило повысить растворимость этинил эстрадиола в СК флюиде. Впервые In-situ изучены растворимости этинил эстрадиола при высоких давлениях в среде СК-СО2. Получены фазовые диаграммы с и без добавления этанола в смесь. Добавление небольшого количества этанола позволило на качественно значительно улучшить растворимость (визуально практически не наблюдаются частицы гормона в итоговом сверхкритическом растворе). Процесс фазовой сегрегации для тройной смеси начинает происходить при более высоких давлениях во всем диапазоне исследуемых температур, что может быть связано с увеличением растворенного вещества гормона в фазе богатой CO2. В ходе работы по проекту была собрана и протестирована установка для возможности in situ исследования процессов растворимости гормонов в СК CO2. Получены спектры растворенного гормона этинил эстрадиола в оптической ячейке в среде суб- (200 атм, 25ºC) и сверхкритического (307 атм, 40ºC) CO2. Наблюдается рост пика поглощения этинил эстрадиола с увеличением времени экспозиции СК смеси, что связано с ростом концентрации гормона в СК-CO2.