Аннотация результатов, полученных в 2020 году
Для реализации поставленной перед проектом цели по разработке научных подходов к модификации поверхности каркасных титановых имплантов на основе комбинации методов химического травления, молекулярного наслаивания и биофункционализации поверхности на первом этапе работ были поставлены и решены следующие задачи: 1) Разработка методики жидкофазного химического травления каркасных титановых структур, с развитым микро и нанорельефом на поверхности. 2) Разработка методики нанесения покрытий диоксида титана на поверхности травленных каркасных структур, с сохранением микро- и нанорельефа поверхности структур методом молекулярного наслаивания (МН) 3) Исследование физико-химических характеристик полученных образцов и их in vitro испытания с использованием клеток остеобластов. 4) Разработка методики и определение оптимальных условий для получения наночастиц серебра на поверхности титана методом МН. На первом этапе был изучен характер и особенностей химического травления модельного титана (плоские полированные диски и неполированные пластины) в смесях стандартных кислотных травителей (смеси HCl, H2SO4) и пиранья (H2SO4/H2O2, NH4OH/H2O2). Согласно полученным данным травление титана значительно изменяет морфологию поверхности. Варьирование типа травителя, его состава и длительности травления позволяет получать на поверхности титана разнообразные нано и микрострукутуры, гибридные наномикроструктуры и таким образом открывает возможности регулирования микро и наноморфологии поверхности титана в широком диапазоне. Измерение смачиваемости образцов показало, что травление в H2SO4/H2O2 приводит к гидрофилизации поверхности титана, а травление в NH4OH/H2O2 к гидрофобизации. Данные атомно-силовой микроскопии (АСМ), рентгеновской фотоэлектронной спектроскопии (РФЭС) и вторично ионной масс-спектрометрии ВИМС позволили предположить, что изменение гидрофильности вызвано изменением содержания гидроксильных групп на поверхности, а изменения рельефа не оказывает значительного влияния на смачиваемость титана. In vitro испытания 4-х наиболее различающихся морфологией образцов были проведены с использованием клеток преостеобластов MG-63. Было обнаружено, что травленная поверхность не оказывает цитотоксическое влияние на преостеобласты. При этом химическое травление титана в H2SO4/H2O2 и NH4OH/H2O2 независимо от его продолжительности стимулирует пролиферационную активность клеток MG-63 на его поверхности. Исследование морфологии клеток после их культивирования на поверхности травленного титана показало, что чем более развит рельеф и морфология поверхности, тем больше клеток на нем адгезируется и происходит лучшее их распластывание. Полученные результаты накопления маркера ранней дифференцировки – щелочная фосфотаза (ЩФ) показали значительное преимущество образцов травленных в H2SO4/H2O2 над травленными в NH4OH/H2O2 на ранних этапах культивирования (2-7 дней), что связано с гидрофобностью поверхности образцов серии NH4OH/H2O2. Однако на поздних стадиях культивирования (14-28 дней) преимущество нивелируется, а образец травленный в NH4OH/H2O2 в течение 2 часов и обладающий гибридной наномикроморфологией поверхности показывает наилучшие результаты по накоплению ЩФ. Таким образом, в результате проведенных исследований была разработана методика, позволяющая создавать на поверхности титана структуры с гибридной нано/микроморфологией. А на основании данных испытаний in vitro показана перспективность жидкофазного химического травления титана в целом и отдельных методик в особенности для ускорения процессов роста и дифференцировки клеток преостеобластов в остеогенном направлении. На втором этапе исследования были смоделированы и напечатаны трехмерные каркасные структуры из титана методом селективного лазерного плавления (SLM). Разработанные на плоских подложках методики травления были апробированы на каркасных структурах. Несмотря на небольшие отличия в форме и размерах образующихся в ходе травления структур, общая характеристика морфологии травленных каркасных структур совпадает с аналогичными травленными плоскими образцами. На следующем этапе были определены условия получения методом МН поликристаллических покрытий оксида титана со структурой анатаза. В качестве исходных титансодержащих реагентов были испытаны хлорид и изопропоксид титана (IV). В ходе исследований по получению покрытий на поверхности травленного титана, обладающего развитым рельефом, была разработана методика нанесения покрытий, сохраняющих особенности сложного рельефа. В дальнейшем были подробно изучены физикохимические характеристики поверхности полученных покрытий и проведены испытания in vitro с использованием клеток преостеобластов. Покрытия не проявили цитотоксичности и значительно улучшали морфологию клеток, их пролиферацию и дифференцировку. При этом был обнаружен положительный синергетический эффект химического травления и нанесения покрытий на дифференцировку клеток в остеогенном направлении. На заключительном этапе работ была разработана методика получения наночастиц серебра методом МН на поверхности титана. В качестве исходного реагента был выбран (триэтилфосфин)(6,6,7,7,8,8,8-гептафтор-2,2-диметил-3,5-октадион) серебра (I) - Ag(fod)(PEt3). В качестве сореагента-восстановителя использовалась водородная плазма. Было изучено влияние температуры нагревателя с емкостью в котором хранился Ag(fod)(PEt3), количества напусков реагента в одном цикле МН и температуры реактора на характеристики роста частиц серебра. На основании полученных данных были определены оптимальные условия для получения наночастиц серебра и возможности регулировать их размер. На основании данных СЭМ и РФЭС было показано, что серебряные наночастицы, полученные методом МН, не образуют сплошной слой и значительная часть подложки остается свободной для дальнейшего модифицирования поверхности. На основе результатов, полученных в данном отчетном периоде, была опубликована статья «The Effects of Chemical Etching and Ultra-Fine Grain Structure of Titanium on MG-63 Cells Response» в журнале Metals. Текст статьи доступен по ссылке https://doi.org/10.3390/met11030510

Аннотация результатов, полученных в 2021 году
Для реализации поставленной перед проектом цели по разработке научных подходов к модификации поверхности каркасных титановых имплантов на основе комбинации методов химического травления, молекулярного наслаивания (МН) и биофункционализации поверхности на втором этапе работ были поставлены и решены следующие задачи: 1) Синтез наночастиц (НЧ) серебра методом молекулярного наслаивание на поверхности плоских и объемных каркасных структур из титана, а также изучение их морфологии и состава. 2) Разработка методики прививки антибиотика на поверхности титана путем последовательной аминосиланизации поверхности, синтеза линкера (полиглицина) и хемосорбции антибиотка - ванкомицина. 3) Исследование бактерицидных свойств полученных материалов с использованием грамположительных и грамотрицательных штаммов бактерий. 4) Изучение цитологического отклика клеток преостеобластов и мезенхимальных стволовых клеток (Исследование адгезии, жизнеспособности, пролиферации и дифференцировки клеток). На первом этапе работ были определены оптимальные условия синтеза и разработана методика получения наночастиц серебра методом МН с использованием триэтилфосфин)(6,6,7,7,8,8,8-гептафтор-2,2-диметил-3,5-октадион) серебра (I) - Ag(fod)(PEt3) и водородной плазмы. Разработанная методика синтеза НЧ серебра диаметром около 20 нм с использованием оптимальных условий, была успешно применена для синтеза НЧ на подложках сложной формы и геометрии. В частности было показано равномерное и однородное покрытие НЧ серебра на поверхности как немодифицированных трехмерных титановых каркасных структур, так и на поверхности каркасов с развитым нано и микрорельефом. Рентгенофазовый анализ показал, что полученные НЧ серебра поликристаллические. А результаты рентгеновской фотоэлектронной спектроскопия (РФЭС) поверхности и объема продемонстрировали наличие в составе НЧ помимо серебра примесей углерода, кислорода, фосфора и фтора в виде остатков непрореагировавшего исходного реагента в количестве не превышающем 1-2%. Нанесение НЧ серебра незначительно увеличивает смачиваемость титановых подложек и увеличивает свободную поверхностную энергию. Антибактериальные свойства НЧ серебра и покрытий поликристаллического оксида титана оценивались с использованием 5 грамположительных и грамотрицательных штаммов патогенов с множественной лекарственной устойчивостью. Оба типа покрытий показали значительное ингибирующее воздействие на штамм S. aureus, однако наилучшими оказались образцы с комбинацией нанопокрытий TiO2 и НЧ Ag. Эти образцы также стимулировали образование наибольшего количества межклеточных контактов остеобластоподобных клеток MG-63. Все полученные образцы не являются цитотоксическими для клеток MG-63 и мезенхимальных стволовых клеток FetMSС, а дифференцировка клеток для всех образцов протекает в остеогенном направлении как в присутствии среды, индуцирующей дифференцировку, так и без нее. Таким образом, полученные результаты показали, что биофункционализация поверхности титановых имплантов с помощью нанопокрытий TiO2 и наночастиц Ag, полученных методом МН, является многообещающей стратегией для предотвращения инфекций и ускоренной остеоинтеграции. На следующем этапе выполнения работ была разработана методика прививки антибиотика – ванкомицина через полипептидный линкер к поверхности титановых каркасных структур. Разработка методики осуществлялась с использованием специально синтезированной для этих целей модельной подложки - ксерогеля оксида титана. Разработанная методика включала иммобилизацию на поверхности ксерогеля амино групп с помощью 3-(аминопропил)триэтоксисилана. Затем на поверхности аминосиланизированного ксерогеля оксида титана проводился твердофазный синтез линкера – полипептида (пентаглицина). На заключительном этапе проводилась хемосорбция (прививка) антибиотика ванкомицина за счет образования пептидной связи между аминогруппой пентаглицина и карбоксильной группой ванкомицина. После отработки методики на ксерогеле аналогичный трехстадийный синтез был воспроизведен на поверхности титановых каркасных структур. Протекание вышеперечисленных реакций и образование конечного продукта было подтверждено методами кондуктометрического титрования, рентгеновской фотоэлектронной спектроскопии и хромато-масс-спектрометрии. Полученные образцы с привитым ванкомицином, а также комбинированные образцы с серебром и ванкомицином показали высокую антибактериальную активность по отношению к грамположительным и грамотрицательным штаммам бактерий, но при этом не оказали цитотоксического воздействия на клетки MG-63 и FetMSС. По результатам исследований, проведенных за два отчетных периода, осуществлен комплексный анализ успешности разработанных методик химического травления, нанесения покрытий и наночастиц серебра, а также хемосорбции ванкомицина для улучшения биомедицинских характеристик титана (антибактериальные свойства, адгезия, жизнеспособность, дифференцировка клеток преостеобластов). Определены основные взаимосвязи и характер влияния физико-химических характеристик поверхности на биомедицинские свойства полученных материалов. На основе проведенного анализа подготовлены рекомендаций для испытаний материалов in vivo. По результатам исследований на данном этапе реализации проекта подготовлено 2 публикации в журналах Scopus/Web of Science 1 и 2 квартиля: Denis Nazarov, Ilya Ezhov, Natalia Yudintceva, Ilya Mitrofanov, Maxim Shevtsov, Aida Rudakova and Maxim Maximov. MG-63 and FetMSC Cell Response on Atomic Layer Deposited TiO2 Nanolayers Prepared Using Titanium Tetrachloride and Tetraisopropoxide // coatings, 2022, в печати, ожидаемая дата выхода начало июня 2022. Denis Nazarov, Ilya Ezhov, Natalia Yudintceva, Maxim Shevtsov, Aida Rudakova, Vladimir Kalganov, Vladimir Tolmachev, Yuliya Zharova, Oleksiy Lutakov, Ludmila Kraeva, Elizaveta Rogacheva, Maxim Maximov. Antibacterial and osteogenic properties of Ag nanoparticles and Ag/TiO2 nanostructures prepared by atomic layer deposition // Journal of Functional Biomaterials, 2022, на рассмотрении в редакции после исправлений, ожидаемая дата выхода начало июня 2022. Результаты исследований по проекту также были отмечены в публикациях отечественных и зарубежных СМИ: Scientists to develop the coatings for titanium implants to fasten osseointegration (https://research.spbstu.ru/en/news/scientists_to_develop_the_coatings_for_titanium_implants_to_fasten_osseointegration/) Scientists to develop the coatings for titanium implants to fasten osseointegration (https://www.eurekalert.org/news-releases/736680)