Аннотация результатов, полученных в 2020 году
Глобальная цель Проекта – выявление роли механических напряжений в процессе производства гемопоэтических стволовых клеток (ГСК) в ходе эмбриогенеза позвоночных на примере эмбриона рыбы Данио-рерио. Все кровяные клетки образуются из ГСК. Большинство ГСК во взрослом организме происходят от клеток эмбриональной дорсальной аорты (ДА). Часть составляющих ее клеток эпителия превращается в ГСК в ходе эндотелио-гемопоэтического перехода (ЭГП). Этот процесс был открыт в 2010 году и до сих пор мало изучен. Одной из особенностей ЭГП в эмбрионах Данио-рерио является то, что во время этого перехода ДА претерпевает значительные изменения формы и размеров, которые скоррелированы с событиями на клеточном уровне. Следуя общему плану Проекта, на первом году исследования мы сконцентрировались на эволюции формы аорты и рассмотрели процессы, протекающие на тканевом уровне, абстрагируясь от клеточной структуры аорты. Основываясь на имеющихся данных о развитии Данио-рерио между ~30 до ~65 часами после оплодотворения (период во время которого осуществляется ЭГП), мы разработали континуальную модель дорсальной аорты, которая описывает ее как изотропную упругую мембрану, а также учитывает давление крови и взаимодействие с окружающими тканями. В рамках модели аналитически найдена область устойчивости системы в пространстве параметров <нормализованный перепад давления, нормализованное осевое напряжение>. Показано, что одна из критических мод ведет к формированию гофрировки с периодом порядка периметра аорты; аналогичные деформации возникают в дорсальной аорте во время производства стволовых гемопоэтических клеток. На основании построенной модели мы проанализировали данные 4D флуоресцентной микроскопии, позволяющие проследить за изменением общей формы дорсальной аорты и экструзией отдельных клеток в эмбрионах дикого типа и мутантных эмбрионах с нарушенным кровообращением и нарушением функций актин-миозинового аппарата. Морфогенез аорты рассмотрен как движение системы в выбранном пространстве параметров. Предложенная интерпретация процесса эволюции формы дорсальной аорты, ставящая во главу угла механические неустойчивости, была представлена впервые и позволила установить, что: - разность скоростей роста аорты и окружающих ее тканей приводит к возникновению механических сжимающих осевых напряжений в стенках аорты; - такие осевые напряжения играют не менее существенную роль в стимулировании изменений фенотипа клеток аорты, чем активно исследуемые в литературе сдвиговые напряжения, вызываемые потоком крови; - механические напряжения не только служат в качестве сигналов, контролирующих экспрессию генов, но и напрямую активируют неустойчивости в аорте, осуществляя необходимые морфологические изменения в системе; - организм использует два типа механических неустойчивостей: первый тип приводит к появлению крупномасштабной деформации аорты, второй – к выгибанию клеток, предшествующему их экструзии в ходе эндотелио-гемопоэтического перехода. Получение ГСК in vitro для медицинских целей все еще остается невероятно сложной задачей. Мы надеемся, что наши результаты привлекут внимание научного сообщества к исследованию роли механических напряжений в процессе ЭГП и будут способствовать совершенствованию методов производства ГСК. Так, выращивая клетки на гибкой подложке, можно попытаться искусственно контролировать механические напряжения в системе и, вероятно, повысить эффективность получения ГСК. Полученные научные результаты были опубликованы в журнале Scientific Reports (Q1, IF 4.149) в статье «Modeling and live imaging of mechanical instabilities in the zebrafish aorta during hematopoiesis» (https://www.nature.com/articles/s41598-021-88667-w). Результаты работы по Проекту также были представлены на международном форуме «ЛОМОНОСОВ-2021» и XVII Ежегодной молодежной научной конференции «Наука и Технологии Юга России».

Аннотация результатов, полученных в 2021 году
Цель проекта – выявить роль механических напряжений в процессе производства гемопоэтических стволовых клеток (ГСК), используя в качестве модельного организма рыбку Danio rerio. ГСК обеспечивают кроветворение на протяжении всей жизни взрослого организма. Процесс превращения эндотелиальных клеток эмбриональной аорты в ГСК известен как эндотелиально-гемопоэтический переход (ЭГП) и впервые был обнаружен в эмбрионах Danio rerio, которая до сих пор остается одним из основных модельных организмов для изучения ЭГП. Следуя основной цели Проекта, на втором году мы продолжили изучение роли механических напряжений в морфогенезе эмбриональной аорты Danio rerio и процессе производства ГСК. Для этого была построена новая микромеханическая модель дорсальной аорты (ДА), основывающаяся на дискретной теории упругих мембран. Разработаная модель позволяет учесть анизотпроное взамодействие аорты с окружающими тканями, разность давлений внутри и снаружи аорты (обусловленную потоком крови), а также неоднородные механические напряжения. Благодаря этому обощению разработанной на первом году аналитической модели, учитывающей лишь однородные напряжения, нам удалось смоделировать наблюдаемую экспериментально асимметричную форму сосуда во время произодства ГСК. Проанализировав данные о положениях ядер клеток аорты и результаты нашего численного моделирования, а затем сравнив их с микрофотографиями аорты, полученными в рамках сотрудничества c научной группой доктора К. Киссы (университет Монпелье), мы показали, что на протяжении большей части процесса производства ГСК, дно аорты находится под действием сжимающих напряжений, вызванных направленной миграцией и ростом составляющих ее клеток. Эти неоднородные напряжения делают осесимметричную форму аорты механически неустойчивой и приводят к возникновению наблюдаемой экспериментально периодической модуляции радиуса на ее дне, которая сохраняется на протяжении большей части процесса и является его неотъемлемой особенностью. При этом однородные напряжения вызванные расширением аорты как целого в упругом окружении, могут приводить к более ранней активации неустойчивости, что и наблюдается в случае помещения эмбрионов Danio-rerio в более концентрированный раствор агарозы, ограничивающий их рост. В рамках разработанной модели мы также исследовали как пересрапределяются деформации/напряжения в сосуде при изменении давления в сердечном цикле до и после изменения формы аорты. Мы продемонстрировали, что первоначально вариация давления приводит лишь к однородному растяжению стенок сосуда, однако после возникновения неустойчивости распределение деформаций в вентральной и дорсальной стенках сосуда становится различным. Поскольку эндотелиальные клетки являются механо-чувствительными, такое распределение в механических сигналах наряду с другими морфогенетическими градиентами может способствовать дифференциации клеток и увеличивать число ЭГП в вентральной области аорты, из которой будущим ГСК проще попасть в вену. Мы рассмотрели начало процесса экструзии клеток, как выгибание участка аорты, вызванное механическими напряжениями, связанными с коллективной миграцией и расширением клеток и действием актинового кольца, опоясывающего покидающие аорту клетки, и локальным изменением упругих констант. Наконец, развивая проблематику проекта, помимо прогиба отдельных клеток мы также рассмотрели топологию сеток, образуемых межклеточными границами, на примере других эпителиальных монослоев. Такие структурные характеристики монослоя, как распределение клеток по числу соседей и площадям, могут быть сравнительно легко извлечены из микрофотографий при помощи машинного распознавания изображений. Далее, эти структурные характеристики могут быть использованы в контексте математических моделей для анализа свойств эпителия, в том числе в ходе процесса производства ГСК, а также для распознавания патологий. На плоскости распределение и динамику межклеточных границ часто описывают в рамках моделей, рассматривающих конфлюэнтный эпителий как совокупность полигонов с упругой энергией. Мы провели анализ соответствия этого класса моделей обнаруженному соотношению между распределением площади, занимаемой клетками с различным числом соседей, и интерквартильным размахом средней площади клетки, и установили, что существующие модели не воспроизводят распределения, наблюдаемые в большинстве реальных эпителиальных монослоев. Мы показали, что подобное несоответствие может быть устранено путем введения разброса площадей, определяемого алгоритмом случайной последовательной адсорбции дисков, предложенного нашими коллегами (группа проф. Рошаля С.Б., ЮФУ, Россия). Таким образом, по результатам второго года выполнения проекта был предложен следующий сценарий процесса производства ГСК в Danio rerio, устанавливающий связь между различными типами механических напряжений в аорте и процессами на тканевом и клеточном уровнях. Увеличение среднего размера клеток и их коллективная миграция в направлении дна аорты приводят к накоплению механических напряжений в нижней части сосуда. На уровне тканей это ведет к неустойчивости симметричной формы аорты, в результате которой ее дно приобретает волнистую форму. Схожим образом природа использует механические неустойчивости для формирования ворсинок и крипт кишечника и извилин головного мозга млекопитающих, однако в отличие от этих процессов изменение формы аорты обратимо. На клеточном уровне механические напряжения на дне аорты служат сигналами для механочувствительных эндотелиальных клеток к осуществлению ЭГП (в совокупности с градиентами морфогенов), а также способствуют инициации процесса их экструзии. Формирование периодической модуляции радиуса на дне аорты не просто свидетельствует о накоплении механических напряжений, но и служит дополнительным фактором, контролирующим в какой области и на каком этапе эмбриогенеза осуществляется ЭГП, изменяя то, как деформируются клетки под действием изменяющегося в сердечном цикле давления крови. Экструзия претерпевающих ЭГП клеток из дорсальной аорты обеспечивает эффективный «сток» площади и релаксацию напряжений, что приводит к восстановлению исходной формы сосуда и механических сигналов, которые получают составляющие его клетки. На этой стадии процесс производства ГСК завершается. Полученные результаты вошли в работу «Simple coarse-grained model of the zebrafish embryonic aorta suggests the mechanism driving shape changes during stem cell production», принятую к публикации в коллективной монографии «Mechanics of Heterogeneous Materials», серии «Advanced Structured Materials», индексируемой в Scopus, а также в работу «Random nature of epithelial cancer cell monolayers» (https://dx.doi.org/10.1098/rsif.2022.0026) принятую к публикации в Q1 журнале «J. R. Soc. Interface», индексируемом в Scopus/Web of Science. Результаты исследования были представлены на конференциях ФизикА.СПБ/2021, «Современные проблемы моделирования материалов для механических, медицинских и биологических приложений» и XVIII Ежегодной молодежной научной конференции «Наука Юга России: достижения и перспективы», а также освещены несколькими СМИ, включая Naked Science (https://naked-science.ru/article/column/zarodyshi-ryb-pomogut-iskusstvenno) и ТАСС Наука (https://nauka.tass.ru/nauka/11452855).