Аннотация результатов, полученных в 2020 году
Когнитивные и депрессивные расстройства, зачастую коморбидные, могут быть отдаленными последствиями ишемического инсульта. На основании собственных экспериментальных исследований, а также клинических наблюдений нами была сформулирована гипотеза, связывающая постинсультные нарушения когнитивной и эмоциональной сферы с дистантным кортикоид-зависимым повреждением гиппокампа, предполагающая, что избыток глюкокортикоидов при вызванной инсультом активации гипоталамо-гипофизарно-адренокортикальной системы запускает трансдукцию сигнала через кортикоидные рецепторы, плотность которых особенно высока в гиппокампе, вызывая развитие нейровоспаления и нейродегенерацию. Проект направлен на подтверждение кортикоид-зависимого дистантного повреждения гиппокампа и связанных с ним отдаленных нарушений когнитивной и эмоциональной сферы при моделировании ишемического инсульта на лабораторных грызунах, а также на выявление патогенетических механизмов этих расстройств на молекулярном, клеточном и геномном уровне. Сравнительный анализ двух широко используемых в мире моделей окклюзии средней мозговой артерии (МСАО) у крыс показал, что при отсутствии различий неврологического дефицита в остром периоде после фокальной ишемии, эти модели существенно отличаются по выбросу в кровь кортикостерона, связыванию его в гиппокампе и развитию нейровоспаления. МСАО1 (Koizumi et al.1986) характеризуется более высокой смертностью, выраженной гиперкортикостеронемией, достоверно более высокими связыванием кортикостерона в гиппокампе и аккумуляцией интерлейкина 1 бета по сравнению с МСАО2 (Longa et al. 1989). Таким образом, впервые показано, что МСАО1 и МСАО2 могут быть использованы как модели ишемического инсульта в условиях различной активации гипоталамо-гипофизарно-адренокортикальной системы и гиперкортизолемии в клинике и представляют собой оптимальный инструмент для проверки гипотезы о дистантном кортикоид-зависимом повреждении гиппокампа. Подготовлен биоматериал (гиппокампы) животных после МСАО1 и МСАО2 для проведения полногеномного анализа экспрессии и идентификации дифференциально экспрессирующихся и альтернативно сплайсирующихся генов. Механизмы отсроченных негативных психоэмоциональных и когнитивных последствий острого ишемического повреждения могут включать дисрегуляцию экспрессии вовлекаемых в контроль этих функций определенных генов и регуляторов их транскрипционной активности. Для проверки возможной индукции длительных изменений экспрессии генов в гиппокампе, ключевом для регуляции психоэмоциональных и когнитивных функций отделе мозга, сопровождающим ишемию нейровоспалением, взрослым самцам крыс в стриатум, наиболее поражаемую при ишемии наряду с корой структуру, был введен бактериальный липополисахарид (LPS). Важным аргументом в пользу введения для активации нейровоспаления эндотоксина именно в стриатум послужило обнаружение в предварительных исследованиях ослабления у животных памяти через 3 месяца после введения LPS. Полногеномный транскриптомный (RNA-Seq) анализ гиппокампа, проведенный через сутки и 3 месяца после введения LPS в стриатум, выявил значительные острые и отдаленные генетические эффекты эндотоксина. Среди 613 генов, экспрессия которых изменилась через сутки после LPS по сравнению с соответствующим контролем, наибольшее количество было связано с воспалением, апоптозом, нейродегенеративными процессами. Список из 458 генов с увеличившейся экспрессией включал гены провоспалительного цитокина интерлейкин-1бета (Il1b), каспазы-1 (Casp1), матриксной металлопротеиназы-9 (Mmp9), транспортеров простагландинов (Slco2a1) и глутамата (Slc1a2). Обнаружено снижение экспрессии генов транспортеров-2 (Slc6a13) и 3 (Slc6a11) гамма-аминомасляной кислоты (ГАМК) - важнейшего тормозного медиатора в центральной нервной системе. Большинство этих изменений было полностью нормализовано через 3 месяца. В эти сроки, через 3 месяца после введения, среди выявленных 160 дифференциально экспрессирующихся генов значительное количество оказалось связанным с обеспечением функциональной активности нейротрансмиттерных систем. На изменения в глутаматергической и ГАМК-ергической системах указывают увеличение уровней мРНК глутаматдекарбоксилазы-2 (Gad2), везикулярного транспортера 2 глутамата (Slc17a6), субъединицы 4 глутаматного ионотропного рецептора AMPA (Gria4), субъединицы бета 2 рецептора ГАМК (Gabrb2), а также снижение экспрессии гена глутаматного метаботропного рецептора 2 (Grm2). Выявленные увеличение экспрессии гена серотонинового рецептора 2А типа (Htr2a) и снижение везикулярного моноаминового транспортера (Slc18a1) могут свидетельствовать о длительных изменениях в серотонинергической системе, а увеличение экспрессии мРНК субъединицы 4 никотинового ацетилхолинового рецептора (Chrna4) – в холинергической системе. Кроме выявления генов, изменивших экспрессию, был проведен анализ дифференциального сплайсинга. Обнаружено нарушение соотношения сплайс вариантов фактора сплайсинга Ptbp1, свидетельствующее об увеличении нейрогенеза в гиппокампе через сутки после введения LPS. Дифференциальная экспрессия ряда генов, связанных с миграцией нейронов и аксоногенезом, подтверждает активацию нейрогенеза. Полученный оригинальный результат будет способствовать пониманию механизмов парадоксального усиления гиппокампального нейрогенеза, отмечаемого вскоре после инсульта, а также сохраняющегося длительное время после патологического воздействия и коррелирующего с нарушением контекстной и пространственной памяти.

Аннотация результатов, полученных в 2021 году
Рецепторы глюкокортикоидов вовлекаются в гиппокампе в контроль множества функций, прежде всего, связанных с обучением и памятью, нарушение которых в результате ишемии представляет значимую медицинскую и социальную проблему. В течение отчетного периода продолжалась проверка основной гипотезы о том, что при инсульте избыток глюкокортикоидных гормонов, обусловленный активацией гипоталамо-гипофизарно-адренокортикальной системы, оказывает через свои рецепторы модифицирующее влияние на развитие нейровоспаления и дегенерацию нейронов в гиппокампе, что, как предполагается, является важным звеном механизма формирования отсроченных постинсультных функциональных нарушений. Задачей междисциплинарного исследования была оценка роли ассоциированных с ишемическим повреждением повышенных уровней кортикостерона и маркеров нейровоспаления в изменении экспрессии генов в гиппокампе животных после фокальной ишемии (окклюзии среднемозговой артерии, ОСМА) с использованием двух моделей ишемического повреждения, методы Koizumi et al. 1986 (ОСМА1) и Longa et al. 1989 (ОСМА2), которые используются в доклинических исследованиях в качестве альтернативных. При прямом сравнительном исследовании этих моделей у крыс было выявлено, что динамика неврологического дефицита и объем инфаркта мозга не различались в этих моделях, однако животные группы ОСМА1 (но не ОСМА2) характеризовались повышением уровня кортикостерона и ИЛ1β в крови в остром периоде и долгосрочной аккумуляцией кортикостерона и провоспалительных цитокинов в гиппокампе и фротальной коре. Проведенное сравнение транскриптомных профилей гиппокампа от крыс двух моделей ишемии выявило сходство большинства выявленных изменений в экспрессии генов после ОСМА1 и ОСМА2 в острый период (через сутки после воздействия). Среди увеличивших более чем в 2 раза экспрессию 175 генов выраженное повышение демонстрировали гены, являющиеся ключевыми участниками активации нейровоспаления, такие как хемокины (Ccl7, Ccl2), молекулы клеточной адгезии (Itgam, Ptx3), цитокины (Lif, Socs3), рецепторы фактора некроза опухоли (Tnfrsf1a, Tnfrsf26), ферменты синтеза простагландинов (Ptges, Ptgs2). Ряд повысивших экспрессию генов (Casp4, Pawr, Gadd45, Tnfrsf12a) связывают с индуцируемой ишемией гибелью нейронов. Функциональная аннотация дифференциально экспрессирующихся генов выявила характерные для ОСМА функциональные группы генов, ассоциированные со сходными в обеих модельных группах биологическими процессами, в т.ч. «response to lipopolysaccharide», «inflammatory response», «positive regulation of cell proliferation», «negative regulation of cell proliferation», «negative regulation of apoptotic process», «positive regulation of apoptotic process». Изменения в экспрессии генов (напр маркера астроцитов Gfap), особенно после ОСМА1, более тяжелого ишемического повреждения, наблюдались и в отдаленные после воздействий сроки. Специфические для моделей различия включали, в частности, увеличение экспрессия гена SPP1 (Secreted Phosphoprotein 1) через сутки после ОСМА1, а через месяц – после обоих типов ОСМА. Эксперимент с конкурентным антагонистом глюкокортикоидов мифепристоном должен был ответить на несколько важных вопросов, связанных как с выяснением механизмов избыточной генерации кортикостерона и его аккумуляции в гиппокампе при ОСМА1, так и с потенциальной возможностью использования мифепристона для коррекции кортикостероид-зависимых нарушений (в т.ч. в трансляционной перспективе). Неожиданным результатом явилось нивелирование ряда вызванных ОСМА биохимических изменений в мозге и крови за счет использования пропиленгликоля в качестве растворителя для мифепристона. Данные о том, что пропиленгликоль оказывает специфическое влияние на функционирование гипоталамо-гипофизарно-надпочечниковой оси и изменения цитокинов при ОСМА важны как для фундаментальных исследований с использованием этого растворителя, так и в трансляционной перспективе, поэтому анализ его эффектов будет продолжен. На фоне влияния пропиленгликоля на секрецию и аккумуляцию кортикостерона эффекты растворенного в нем мифепристона не были ярко выраженными, хотя отмечено снижение уровня кортикостерона в крови и гиппокампе через месяц после ОСМА1. В этот период у крыс, перенесших ишемию, наблюдали нарушение обучения и памяти, которое предотвращалось введением мифепристона. Через сутки после ОСМА1 на фоне блокады стероидных рецепторов 52 гена изменяли экспрессию с высокой достоверностью (padj < 0.05). Среди этих генов в сравнении с ОСМА1 без мифепристона повышенная экспрессия в гиппокампе показана для Kdm7a (Lysine Demethylase 7A), Map3k2 (Mitogen-Activated Protein Kinase Kinase Kinase 2), Lcor (Ligand Dependent Nuclear Receptor Corepressor, регулятор транскрипционной активности), Mob1b (MOB Kinase Activator 1B, регулятор генов, важных для клеточной пролиферации, гибели и миграции) , Alg10 (Glucosyltransferase). Наиболее заметным длительным последствием перенесенного тяжелого ишемического воздействия на фоне блокады глюкокортикоидных рецепторов явилось обнаруженное через месяц увеличение в гиппокампе экспрессии генов Fmod (Fibromodulin, предположительно участвует в сборке внеклеточного матрикса) и Anxa2 (Annexin A2 кальций-зависимый фосфолипид-связывающий белок, вовлеченный в регуляцию роста клеток и различные пути сигнальной трансдукции). В завершающей части работы отчетного периода для исследования механизмов провоспалительного воздействия инсульта на гиппокамп новосибирский коллектив провел сравнение профилей экспрессии генов гиппокампа после ОСМА (материал получен московской группой) и внутримозгового введения липополисахарида (LPS) с целью выявления генов, изменяемых провоспалительными стимулами. Поскольку ОСМА вызывает серьезное повреждение нейронов в ипсилатеральном стриатуме у крыс, LPS вводили в стриатум. Для биоинформатического анализа использовали три списка DEGs, выявленных после ишемии: (1) все гены; (2) гены, которые отвечали на ишемию и LPS, а также (3) гены, которые отвечали на ОСМА, но не на LPS. Через сутки после тяжелой ОСМА1 в гиппокампе было выявлено 213 DEGs. Из этих 213 транскриптов, 182 были повышены и 31 - снижены. Сравнение изменений экспрессии генов после ОСМА с изменениями после LPS определило 84 DEGs, общих для обеих парадигм. Из 84 одинаково реагировавших на оба воздействия генов экспрессия только одного гена (P2ry12) снижалась. Гены из списка всех 213 выявленных после ишемии DEGs были представлены в биологических процессах, связанных с иммунной / воспалительной активацией (“inflammatory response”, “response to cytokine”, “response to lipopolysaccharide”, “cellular response to fibroblast growth factor stimulus”, “cellular response to ATP”, “positive regulation of tumor necrosis factor biosynthetic process”, “neutrophil chemotaxis”, “cellular response to lipopolysaccharide”, “positive regulation of glial cell proliferation”, “cell adhesion”, “cellular response to interleukin-1”), клеточной гибелью (“positive regulation of apoptotic process”) и репарацией (“positive regulation of angiogenesis”, “positive regulation of cell proliferation”). Большинство функциональных групп составляли гены, как отвечающие, так и не отвечающие на LPS, за исключением двух групп (“positive regulation of tumor necrosis factor biosynthetic process” и “positive regulation of glial cell proliferation”), которые были представлены только отвечающими на LPS генами. Анализ KEGG pathway выявил для всех всего списка DEGs 20 путей с наиболее высокой достоверностью для “cytokine-cytokine receptor interaction”, “proteoglycans in cancer”, “TNF signaling pathway”, и “MicroRNAs in cancer”. Для 84 генов, реагирующих сходным образом и на ОСМА, и на LPS, наиболее достоверные изменения обнаружены для “Pertussis” и “Phagosome”, в то время как для 129 генов, не реагирующих на LPS, наиболее достоверным был “HIF-1 signaling pathway”. Неожиданный результат получен из функционального кластерного анализа (functional annotation clustering). Этот анализ выявил для списков из всех генов (213), генов, отвечающих на ОСМА и LPS (84), а также дополнительно оцененных для всех повышающих экспрессию генов (182) достоверный (enrichment score: 2.58-3.39) кластер, обогащенный функциональными группами «Innate immunity», «Immunity» и «innate immune response» и состоящий в сумме из одного и того же набора 10 чувствительных к LPS генов: Clec5a, CD14, Fgr, Hck, Anxa1, Lgals3, Irf1, Lbp, Ptx3, Serping1. Проведенные обоими коллективами в течение отчетного периода междисциплинарного проекта комплексные исследования позволили получить новые данные, позволяющие сопоставить изменения транскриптома, происходящие в остром и отдаленном периодах после ОСМА в гиппокампе, с изменениями на уровне поведения, неврологического состояния, функционирования нейрогуморальной системы и воспалительных процессов. Получены новые сведения, важные для понимания молекулярных механизмов влияния индуцированной ишемией иммунной/провоспалительной активации на экспрессию генов в гиппокампе.

Аннотация результатов, полученных в 2022 году
Механизмы отсроченных функциональных расстройств после фокальной ишемии мозга (ишемического инсульта), включающих ослабление когнитивных функций, остаются малоизученными, несмотря на высокую актуальность поиска подходов к их предупреждению. Предполагается, что ключевыми звеньями патогенеза таких расстройств могут быть развитие нейровоспаления и избыточная секреция гормонов гипоталамо-гипофизарно-адренокортикальной системы, прежде всего глюкокортикоидов, уровень которых повышается при стрессе, вызываемом инсультом. Выяснение молекулярных процессов и возможного взаимодействия между процессами нейровоспаления и сигнальными путями, запускаемыми в мозге глюкокортикоидами, представляет собой важную задачу на стыке трансляционной нейробиологии и фундаментальной медицины. Моделирование инсульта на животных - необходимый предклинический этап в рамках такого исследования, трансляция результатов которого зависит от валидности использованной модели. Сравнение разных моделей инсульта может быть полезным подходом для дальнейшего понимания механизмов патогенеза этого тяжелого заболевания; сравнительный анализ может способствовать выявлению ключевых генетических процессов, активируемых при индукции патологии различными способами. В рамках выполнения данного проекта московской группой было показано, что наиболее популярные модели фокальной ишемии (окклюзии средней мозговой артерии, МСАО) на крысах по протоколам Koizumi et al. (1986) (MCAO-KM) и Longa et al. (1989) (MCAO-LM), которые широко используются как альтернативные в предклинических исследованиях, различаются по высвобождению глюкокортикоидных гормонов и накоплению этих гормонов и провоспалительных цитокинов в лимбической системе (Onufriev et al., 2021, 2022). Как в остром, так и в отдаленном периодах в гиппокампе и фронтальной коре животных при моделировании MCAO-KM происходила аккумуляция кортикостерона, которая не наблюдалась в группе MCAO-LM. Дальнейший анализ этих моделей в рамках совместного проекта показал, что в остром периоде воспалительный ответ активировался в гиппокампе в большей степени после MCAO-LM, чем MCAO-KM, что может указывать на более выраженную активацию адаптивных процессов у MCAO-LM. Новосибирская группа показала, что воспалительный ответ у MCAO-LM обусловлен увеличением экспрессии нижестоящих сигнальных молекул, таких как Myd88 и Nfkb1, Toll-подобных рецепторов. Эти результаты участниками междисциплинарного проекта были оформлены в виде статьи «Inflammatory response to middle cerebral artery occlusion (MCAO) may depend on toll-like receptor signaling activity» для международного журнала. Еще одна совместная статья членов междисциплинарного проекта: «Сравнительное исследование экспрессии генов глутаматергической и гамкергической систем в гиппокампе крысы после окклюзии средней мозговой артерии и центрального введения липополисахарида», планируется к опубликованию в первой половине 2023 года в журнале БИОХИМИЯ/Biochemistry (Moscow). В этой статье описываются и обсуждаются результаты сравнительного исследования экспрессии генов, кодирующих транспортеры и рецепторы глутамата и ГАМК, а также маркеров воспаления в гиппокампе через сутки после двух видов ишемического воздействия и прямой провоспалительной активации центральным введением бактериального липополисахарида (LPS). После MCAO-LM и введения LPS обнаружено большее число изменивших экспрессию генов, связанных с активацией апоптоза и нейровоспаления, рецепцией глутамата, а также маркеров ГАМКергической системы, чем после MCAO-KM. MCAO-KM и введение LPS демонстрировали изменение большего числа генов, вовлекаемых в транспорт глутамата, по сравнению с MCAO-LM. Наиболее ярким отличием MCAO-LM от MCAO-KM и введения LPS были изменения в экспрессии генов кальмодулина и кальмодулин-зависимых киназ. Для выявления возможных связей между избытком глюкокортикоидов и процессами нейровоспаления московская группа в соответствии с планом на 2022 г начала моделирование и сравнительное исследование MCAO-LM на фоне хронической гиперкортикостеронемии. Проведено сравнительное исследование моделей гиперкортикостеронемии, и одна из них адаптирована для использования в основном эксперименте. Наряду с проведением оценки уровня кортикостерона в крови и регионах мозга, уровня провоспалительных цитокинов, а также изменений поведения, для последующего анализа транскриптома были подготовлены животные (4 группы в соответствии с дизайном эксперимента по влиянию гиперкортикостеронемии на модели) и получен биоматериал (гиппокампы), который далее будет использован в транскриптомных исследованиях новосибирской группы. Новосибирской группой на предыдущих этапах выполнения проекта была разработана на крысах модель хронического нейровоспаления, на которой через 3 месяца после центрального введения LPS обнаружено сходное с характерным постинсультным нарушением ослабление памяти. В отчетном году на этой модели для оценки участия глюкокортикоидов в поведенческих эффектах провоспалительной активации было проанализировано влияние блокады или стимуляции глюкокортикоидных рецепторов (GR) мифепристоном (MF) и дексаметазоном (DEX), соответственно, на индуцированные провоспалительным стимулом (LPS) изменения экспрессии генов в гиппокампе и поведения животных. MF и DEX, а также их растворитель (VEH - DMSO) вводили внутрибрюшинно за полчаса до введения эндотоксина. LPS или его растворитель (физиологический раствор, SAL) под изофлурановым наркозом вводили в стриатум. Эта структура входит в число первоочередных повреждаемых ишемическим воздействием структур мозга, в то время как вторичное повреждение гиппокампа считают ответственным за развитие постишемической деменции. Оба предварительных фармакологических воздействия - стимуляция GR введением DEX, а также блокада рецепторов введением MF, ослабляли отсроченное повышение у животных когнитивной дисфункции. Такое сходство отдаленных эффектов после разнонаправленных воздействий может указывать на адаптивные изменения механизмов регуляции этого типа поведения в похожем итоговом направлении. Однако введение блокатора глюкокортикоидных рецепторов MF за полчаса до LPS практически не повлияло на транскриптомный ответ на эндотоксин. Выявленные изменения были не достоверными при использовании в качестве отборочного критерия padj<0.05. Сходные результаты были получены и на моделях ишемии. Животные, получавшие на фоне ишемии (модель MCAO-КM) и сопровождающей ее провоспалительной активации в гиппокампе блокатор GR, не отличались от контрольных животных с ишемией, но без введения блокатора, по экспрессии генов через месяц после моделирующего инсульт воздействия. В отличие от MF, введение DEX оказало заметное влияние на транскриптомный ответ гиппокампа на LPS, что могло проявиться изменением и функциональных ответов, в частности, ослаблением нарушения памяти через 3 месяца после ведения LPS совместно с DEX. Из 35 значимых биологических процессов генной онтологии, значительную часть списка занимали процессы, связанные с развитием мозга и морфогенезом, сигнальной регуляцией, а также когнитивными функциями. Среди нейротрансмиттерных систем, наиболее выраженные изменения наблюдались в глутаматергической и ГАМК-ергической системах. Комплексные исследования, проведенные обоими коллективами в течение отчетного периода междисциплинарного проекта, позволили получить новые важные данные, способствующие пониманию молекулярных механизмов влияния иммунной/провоспалительной активации, индуцированной ишемией, на экспрессию генов в гиппокампе. В частности, получены новые знания об ассоциации глюкокортикоидного сигнала и экспрессии генов, отвечающих на провоспалительные стимулы.

Аннотация результатов, полученных в 2023 году
Глюкокортикоидные гормоны, высвобождающиеся в ответ на стресс, вызванный неблагоприятными событиями, включающими травматические повреждения головного мозга, могут вовлекаться как в негативные для организма последствия, так и адаптивные процессы, способствующие регенерации поврежденных тканей и восстановлению их функций. Молекулярные пути этих эффектов гормонов ясны далеко не полностью, что обусловливает дальнейшие исследования механизмов ответов на повреждения мозга и влияния на них гормонов стресса. На модели MCAO-LM в условиях гиперкортикостеронемии за счет введения экзогенного кортикостерона его уровень в крови был повышен через 1.5 часа после операции и оставался высоким в течение суток, но не выявил изменений через 1 месяц после операции. Несмотря на то, что гиперкортикостеронемия негативно влияла на восстановление массы тела и неврологических функций животных после инсульта, она практически не оказала влияния на уровни кортикостерона и провоспалительных цитокинов в гиппокампе и фронтальной коре. Через 1 мес. после перенесенной MCAO-LM крысы демонстрировали признаки ангедонии в тесте предпочтения сахарозы, что свидетельствует о развитии депрессивно-подобного поведения у крыс. Кортикостеронемия не повлияла на поведение животных в этом тесте. МСАО-LM и кортикостеронемия по-разному влияли на показатели поведения, характеризующие когнитивные функции. Изменения поведения в модели MCAO-LM были менее выражены, чем в модели Коизуми (MCAO-KM). Кроме того, имелись принципиальные отличия. Так в модели MCAO-KM изменения были более выражены в когнитивном домене, и применение блокатора глюкокортикоидных рецепторов мифепристона улучшало когнитивные функции, нарушавшиеся в результате МСАО. В модели MCAO-LM наиболее ярким изменением было усиление депрессивно-подобного поведения, но этот эффект не зависел от кортикостеронемии. Исследование состояния структуры гиппокампа у крыс, перенесших МСАО, через 4 дня после операции показало, что кортикостеронемия сама по себе или в периинсультный период не приводила к существенной утрате клеток или нарушению гематоэнцефалического барьера, а также существенным изменениям астроцитов и микроглии. Проведен сравнительный анализ острых (через сутки) и отсроченных (через месяц) транскриптомных ответов гиппокампа крыс на модели MCAO-LM на фоне гиперкортикостеронемии, вызванной введением экзогенного кортикостерона. MCAO-LM вызывала значительное изменение экспрессии генов в гиппокампе через сутки: по сравнению с ложнооперированными 359 ДЭГ, из которых, экспрессия 265 генов была повышена, а 94 – снижена. Показана достоверная ассоциация этих генов с 38 биологическими процессами (FDR < 0.05), в т.ч. связанных с регуляцией клеточной пролиферации, миграции, ангиогенеза, клеточного гомеостаза ионов кальция, ответами на гипоксию и цитокины, процессами апоптоза, иммунной активации и воспаления. С ответами на глюкокортикоиды ассоциированы семь ДЭГ: Ccl2, Adm, Anxa1, C1qb, Ptgs2, Si, Sdc1. MCAO-LM на фоне гиперкортикостеронемии повлияла через сутки на экспрессию всего двух генов: кортикостерон снизил повышаемую ишемией экспрессию гена AABR07060872.1 (KACB_RAT - Ig kappa chain C region, B allele) и усилил экспрессию гена провоспалительного цитокина Il6, то есть острое провоспалительное действие данного типа ишемии. Через месяц после MCAO-LM обнаружено увеличение после введения кортикостерона экспрессии шести генов: Aebp1, Fmod, Fcrl2, Igfbp2, RT1-Bb и Vim. Наиболее высокий уровень белок-белкового взаимодействия продуктов этих генов (Combined Score = 0.765) показан между Fibromodulin, кодируемым Fmod, и Adipocyte enhancer-binding protein 1, кодируемым Aebp1, последний принимает участие в организации и ремоделировании внеклеточного матрикса и положительно регулирует активность NF-каппа-B в макрофагах, приводя к усилению воспалительной реакции макрофагов. В отдельных экспериментах также проверялась возможность длительного влияния сопровождающего ишемию нейровоспаления в стриатуме на экспрессию генов в гиппокампе и модуляцию этого влияния глюкокортикоидными стимулами, поскольку стриатум находится в списке структур, повреждаемых ишемией в первую очередь. Также, через 3 месяца после введения провоспалительного стимула липополисахарида (ЛПС) в стриатум новосибирская группа обнаружила ослабление памяти, сходное с характерным постинсультным нарушением. По сравнению с животными, которым в сходных условиях вводили физиологический раствор, через сутки после ЛПС выявлено 900 ДЭГ (626 - с повышенной и 274 - со сниженной экспрессией). Через 3 месяца после ЛПС, 32 гена еще демонстрировали измененную экспрессию (у 28-ми – повышение, у 4-х - снижение). Ослабление глюкокортикоидного сигнала на модели нейровоспаления вызывали введением за полчаса до ЛПС блокатора глюкокортикоидных рецепторов мифепристона (МФ), усиление – введением в этих же условиях синтетического глюкокортикоида дексаметазона (ДЕКС). Введение МФ до ЛПС привело к изменению через сутки экспрессии 6 генов, из которых 4 гена (Aqp1, Kl, Prdm6 и Ttr) демонстрировали нормализацию сниженной эндотоксином экспрессии. Снижение экспрессии 2 генов (рибосомальных белков AC141489.1 и Rps9) было специфичным для МФ и не менялось ЛПС. Введение МФ не повлияло на отдаленный транскриптомный эффект ЛПС. Выраженные острые и длительные изменения в транскриптомных ответах гиппокампа на ЛПС обнаружены после введения ДЕКС до ЛПС. Через сутки было выявлено изменение экспрессии 284 генов. Большая часть различий между группами ДЕКС+ЛПС и растворитель+ЛПС обусловлена нормализацией вызванных эндотоксином острых изменений. Отдаленные эффекты ДЕКС включали ослабление гормоном ассоциированного с ЛПС нарушения памяти, которому сопутствовали длительные изменения экспрессии регуляторов глутаматергического сигналинга. В процессе исследования были установлены важные ограничения экспериментального подхода, которые могут влиять на его трансляционную валидность. Один из них - достаточно высокая смертность в моделях МСАО, которые используются в предклинических исследованиях. Это приводит к так называемой "систематической ошибке выжившего" (survivorship bias), в результате которой выживают только наиболее устойчивые животные. Недавно на другой модели фокального повреждения мозга в результате черепномозговой травмы нами было показано, что результаты этой ошибки зависят от уровня кортикостерона после повреждения мозга (doi: 10.3390/ijms24054542). С учетом проблем и ограничений интерпретации результатов поведенческих тестов, особенно с точки зрения трансляции в клинику (doi: 10.3390/biomedicines10123119), это следует учитывать при дизайне предклинических исследований механизмов фокального повреждения мозга. Результаты исследований влияния кортикостеронемии свидетельствуют о необходимости более глубокого изучения изменения состояния кортикостероидных рецепторов в мозге, которые не были запланированы в данной работе. Есть основания полагать, что именно изменение функционирования этих рецепторов в отделах лимбической системы мозга тесно связано с развитием наблюдаемых нами нейровоспалительных процессов. Выявленные нами воспалительные процессы в гиппокампе после МСАО и их различия в моделях MCAO-KM и MCAO-LM дают основания для их дальнейшего сравнительного исследования с целью трансляции в клинику, поскольку отдаленные постинсультные нарушения когнитивной сферытесно связаны с изменениями уровня кортизола у пациентов (doi: 10.3390/cimb44120429). В целом комплексные исследования, проведенные коллективами в рамках задач междисциплинарного проекта, привели к получению новых данных об изменениях экспрессии генов в гиппокампе в остром и отдаленном периодах после МСАО, зависимости этих изменений от выраженности глюкокортикоидного сигнала и уровня провоспалительной активации. Результаты сопоставления выявленных изменений в экспрессии генов с поведенческими изменениями важны для понимания молекулярных механизмов острых и отсроченных негативных последствий ишемических повреждений.