Аннотация результатов, полученных в 2020 году
Основным фактором спорадической эпилепсии, как и целого ряда других нейропатологий, включая болезнь Альцгеймера (БА), является синергия окислительного стресса и гипометаболизма глюкозы в головном мозге. Окислительный стресс повреждает макромолекулы, такие как ДНК, липиды и белки, тогда как гипометаболизм глюкозы ухудшает снабжение клеток энергией и антиоксидантную защиту. Вместе эти клеточные и функциональные изменения могут быть первичными триггерами целого ряда спорадических нейропатологий. Однако точная причина гипометаболизма глюкозы, связанного с эпилепсией, остается неизвестной. С целью выяснения механизмов возникновения дефицита утилизации глюкозы, приводящего к эпилептогенезу, было проведено исследование роли интериктальной активности и острых судорог в развитии гипометаболизма глюкозы в мозге. Для этого был проведен сравнительный анализ эффектов гиперактивации нейрональной сети при наличии или при отсутствии судорожных разрядов на потребление глюкозы. Было показано, что метаболические последствия эпилептогенных воздействий воспроизводятся путем аппликации на срезы мозга активатора NOX – PMA (форбол-12-мистрата-13-ацетата). Аппликация PMA приводила к снижению потребления глюкозы до 68,5 ± 6,4% по сравнению с контрольным уровнем (p <0,0001; n = 10) и падению флуоресцентного сигнала НАД(Ф)Н (овершут сигнала отражает гликолитические реакции) до 70,7 ± 4,8% от контроля (р <0,0001; n = 12). Применение PMA существенно не меняло ни амплитуду окислительной фазы сигнала НАД(Ф)Н, ни потребление кислорода, что свидетельствует об отсутствии эффекта на дыхание. Аппликация антагониста NOX2 полностью предотвращала эффекты PMA. Показано, что GSK2795039 не оказывает прямого действия на PMA и, следовательно, его действие опосредовано только ингибированием NOX2. Эти данные указывают на то, что судорожная активность приводит к подавлению метаболизма глюкозы, вызывая окислительный стресс через активацию NOX2. Было сделано предположение, что активация NOX на фоне сетевой гиперактивности, ведущей к снижению потребления глюкозы нервной тканью, может происходить и без генерации судорожных разрядов. Были проведены эксперименты на переживающих срезах мозга в условиях гиперактивации сети, при замене стандартного раствора, на раствор, содержащий пониженную концентрацию Mg2+ и блокатор калиевых каналов 4-AP. После появления признаков нейронной гиперактивности – интериктальных разрядов, производили измерения потребления глюкозы и кислорода в ответ на электрическую стимуляцию каждые 10 мин. В ответ на первую стимуляцию наблюдался экстремальный рост потребления глюкозы и кислорода, что, безусловно, связано с возросшим энергопотреблением при эпилептогенном воздействии. Однако переходные ответы в потреблении глюкозы с каждой новой стимуляцией падали в течение часа на 35 ±8% (по сравнению с первой стимуляцией p<0.05). При этом показатели потребления кислорода не изменялись, а локальный полевой ответ, отражающий степень гиперактивации сети продолжал расти в течение часа и втрое (!) превышал начальные значения. Предварительное добавление в инкубационную среду ингибитора NOX (GSK2795039) предотвращало подавление утилизации глюкозы, и переходные процессы в потреблении глюкозы в эпилептогенной среде на фоне GSK изменялись пропорционально локальному полевому потенциалу. Более того при возвращении стандартного раствора и восстановления от гиперактивации, потребление глюкозы продолжало оставаться сниженным в среде без ингибитора NOX – на уровне 55%±14% по сравнению с контролем (p<0.05), а в среде с ингибитором возвращалось до контрольных показателей. Таким образом, гиперактивация нейрональной сети, даже без генерации судорожной активности, приводит к активации NOX, которая посредством генерации АФК создает условия для подавления гликолитической утилизации глюкозы в нервной ткани. Применение GSK2795039 эффективно предотвращает метаболические последствия гиперактивации. В экспериментах in vivo была использовала модель интрацеребровентрикулярного введения Aβ1-42, поскольку этот белок является прямым активатором NOX. Используя амперометрическую технику для динамической регистрации внеклеточной глюкозы в мозге наркотизированных мышей in vivo, мы показали, что интрацеребровентрикулярная инъекция Aβ1-42 оказывает сильное ингибирующее действие на потребление глюкозы мозгом, что приводит к долговременной гиперактивности сети и судорожной активности. Чтобы исследовать непосредственные и среднесрочные эффекты Aβ1-42 на электрическую активность нейрональной сети, мы регистрировали локальную полевую активность поля CA1 гиппокампа у бодрствующих мышей в свободном поведении до и после i.c.v. инъекция Aβ1-42. Мы наблюдали быстрое развитие гиперактивности сети после инъекции Aβ1-42, которая сохранялась на высоком уровне в течение 24 часов и более после инъекции. Особенно важно, что новый биодоступный антагонист NOX2 GSK2795039 предотвращал все наблюдаемые негативные эффекты, связанные с Aβ. Ранее было показано, что гиперактивность нейрональной сети, вызванная Aβ, может приводить к изменению поведенческого профиля мышей (Sharma et al., 2016; Sharma et al., 2019). Чтобы оценить возможную роль NOX2-индуцированного окислительного стресса в развитии поведенческих аномалий, мы провели поведенческие тесты на мышах, которым хронически вводили в желудочки мозга активатор и ингибитор NOX (Aβ1-42 и GSK2795039, соответственно). Тесты проводили через 1 и 2 недели ежедневных внутрижелудочковых введений препаратов. Было показано, что активация NOX достоверно повышает тревожность и агрессивность экспериментальных мышей, тогда как ингибирование NOX2 с помощью GSK2795039 полностью предотвращает развитие этих изменений. Полученные данные подтверждают предположение о доминирующей роли окислительного стресса в процессе инициации судорожной активности, и позволяют предположить, что окислительный стресс, вызванный NOX2, может быть ключевой мишенью для терапии судорожных расстройств.

Аннотация результатов, полученных в 2021 году
1. В экспериментах in vitro на срезах мозга экспериментальных животных измеряли активность Na + / K + -АТФазы на отдельных нейронах методом perforated patch-clamp с использованием микропипеток, заполненных грамицидином. Активность непосредственно ионного насоса рассчитывали путем вычитания суммарного ионного тока при блокаде уабаином из контрольных значений. Полученные результаты продемонстрировали высокую чувствительность энергозависимого ионного транспорта к АФК, генерируемым НАДФН-оксидазой, и показали, что ключевую роль в генерации судорожной активности играет нарушение гликолиза, сопровождающееся снижением производства АТФ и подавление внутриклеточной антиоксидантной защиты. 2. В экспериментах in vitro на срезах мозга экспериментальных животных проведена работа по выявлению механизма генерации деполяризационного сдвига (DC-сдвига), предшествующего иктальным разрядам и характерного для большинства эпилептических припадков. Данные анализируются. 3. В экспериментах in vivo на бодрствующих неограниченных в движении экспериментальных животных проведена работа по выявлению специфических для эпилептического статуса нарушений в ритмической активности ритмической активности. На основе полученных экспериментальных данных локальной полевой активности височных структур мозга была предложена операционная модель, впервые объясняющая механизм возникновения и динамику судорог во время эпилептического статуса. 4. В экспериментах in vivo на бодрствующих животных было показано, что нарушение когнитивного поведения у эпилептизированных крыс было связано с нарушением ритмогенеза и корреляционных отношений между тета и гамма ритмами в трех связанных структурах мозга: гиппокампе, медиальной энторинальной коре и медиальной префронтальной коре. Проведен детальных анализ указанных корреляционных отношений. Обнаруженные электрографические маркеры могут быть использованы как для ранней диагностики височной эпилепсии, так и для оценки эффективности терапевтических воздействия в экспериментах на животных. 5. Проведена экспериментальная часть работ по выяснению роли NOX в возникновении судорог in vivo и возможности подавления судорожной активности путем ингибирования NOX2. Проводится анализ полученных экспериментальных данных. 6. Проведен большой теоретический анализ литературных данных о механизмах, которые могут играть роль в инициации эпилептогенеза. По результатам этой работы опубликован обзор в журнале Trends in Pharmacological Sciences с импакт фактором 14.819 (Q1). Обзор удостоен чести быть представленным на обложке выпуска.

Аннотация результатов, полученных в 2022 году
Были проведены следующие работы: 1.Исследования действия GSK2795039, нового низкомолекулярного прямого ингибитора NOX2, на здоровую нервную ткань при введении его в желудочки мозга, на биохимическом и гистологическом уровнях. Ингибитор NOX сильно увеличивал разброс индивидуальных биохимических параметров со сдвигом в индикацию окислительного стресса, хотя и не достигающую статистической значимости. На гистологическом уровне значимых отличий не наблюдалось, что указывает на возможную вовлеченность в реакцию не микроглии, а других клеток, экспрессирующих NOX2 - нейронов и астроцитов. 2. Исследование влияния блокады NOX2 на уровень флуоресценции NAD(P)H в переживающих срезах гиппокампа показали, что у здоровых животных этот уровень длительно стабилен и блокатор NOX целастрол не вызывал существенных изменений. При добавлении блокатора калиевых каналов 4-AP для индукции эпилептиформной активности уровень NAD(P)H заметно падал, что связано с активацией NOX, так как последующая аппликация целастрола повышала сигнал. У животных с хронической гипервозбудимостью, вызванной status epilepticus после системного введения каината, NOX была хронически активирована, так как переживающие срезы их гиппокампа были реактивны к целастролу. Фоновый уровень флуоресценции был длительно стабилен, а блокада NOX приводила к его росту. 3. На модели генерализованной эпилепсии протестировано комплексное терапевтическое воздействие, направленное как на усиление клеточной антиоксидантной защиты, так и на снижение продукции АФК, параллельно с поддержанием энергетического метаболизма нервной ткани. Электрофизиологический анализ. Несмотря на то, что ритмы мозга широко изучены и официально классифицированы, нет единого мнения об их взаимосвязи и остается спорной их роль в формировании нейропатологии. На модели экспериментального эпилептического статуса, вызванного введением каиновой кислоты, была проанализирована взаимосвязь между ритмическими компонентами электрической активности мозга. Локальная полевая активность (ЛПП) регистрировалась одновременно в гиппокампе, энторинальной коре, медиальной септум и амигдале. При эпилептическом статусе в спектрах ЛПП появляются новые компоненты, представляющие собой последовательное удвоение частоты, первоначально доминировавшей в контроле. Спектры разрядных комплексов представляют собой чередование гармонических спектров, где основная частота совпадает с одной из удвоенных частот, доминирующих в межразрядной активности. Используя нелинейную рекуррентную операцию умножения ритмов и полученные данные, мы предлагаем операционную модель генерации ритмов и патологических разрядов в головном мозге, основанную на октавном принципе. Анализ локальной полевой активности, зарегистрированной одновременно в гиппокампе, медиальной префронтальной коре (мПФК) и медиальной энторинальной коре (мЭК) во время выполнения поведенческих задач на эпизодическую память показал у хронически эпилептизированных животных наблюдается специфическое нарушение эпизодической памяти в тесте “что-где-когда”. Эпилептические животные не идентифицировали объекты во время теста. Это нарушение было связано с изменением характеристик тета- и гамма-ритмов и специфического нарушения тета-когерентности и тета/гамма-сцепленности в этих структурах в сравнении со здоровыми животными. Предполагается, что эти нарушения в корковых областях играют роль в нарушении эпизодической памяти у животных с развивающимся эпилептическим очагом. Эти факты могут пролить свет на механизмы когнитивного дефицита при эпилептогенезе, и кроме того, являются новыми электрофизиологическими маркерами эпилепсии. Биохимический анализ выявил развитие окислительного стресса под действием факторов эпилептогенеза и уменьшение его выраженности на фоне комплексного действия блокатора NOX, снижающего продукцию АФК, и метаболической коррекции нарушений энергометаболизма мозга. Были проанализированы такие биомаркеры, как концентрация перекисно окисленных липидов, свидетельствующая о длительном действии окислительного стресса, скорость продукции активных форм кислорода, показывающая его текущее воздействие, и содержание восстановленных сульфгидрильных групп, отражающее состояние клеточной глутатионовой антиоксидантной системы. Биомаркеры в группах животных, подвергавшихся действию эпилептогена, показали значительное увеличение разбросов параметров, что связано с индивидуальными различиями биохимии и физиологии животных и приводило к разнице в устойчивости к первичному воздействию и дальнейшему патогенезу. В результате статистически достоверные различия были выявлены только для контрольной группы и группы с каиновой моделью эпилепсии, а группа с терапией оказалась в промежуточном положении. Во всех фракциях при развитии патологии наблюдалось повышение значений биомаркеров с выраженной разницей между фракциями. Это свидетельствует о вовлечении в патогенез как мембранной NADPH оксидазы, так и митохондрий, на фоне истощения глутатионовой антиоксидантной системы. Группа терапии продемонстрировала промежуточные результаты во всех фракциях, что выявляет компенсаторное воздействие на антиоксидантную систему, протективное действие на митохондриальные аппарат и подавление АФК-продуцирующих агентов. Однако индивидуальный разброс в группах, получавших эпилептогенное воздействие, превышает средне-групповую разницу, так что для получения статистически достоверных результатов требуется проведение исследований на значительно большем количестве животных. Кроме того, представляется крайне необходимым проведение целенаправленного изучения индивидуальной устойчивости/ лабильности организма к воздействию поражающих факторов и последующему формированию патологии или развитию адаптивных компенсаций для выявления механизмов запуска и развития патологии и дальнейшей коррекции терапевтического подхода. Иммуногистохимический анализ микроглии в гиппокампе у экспериментальных животных выявил существенное увеличение площади микроглиальных клеток в зубчатой фасции и поле СА1 эпилептическом гиппокампа, относительно контроля. Эпилептический статус изменял и форму микроглиальных клеток – увеличивались тела клеток, отростков становилось больше, но они были короткими. Таким образом, микроглиальные клетки приобретали вид типичной реактивной микроглии. Блокада NOX2 предотвращала воздействие каиновой кислоты на микроглию. Важно, что при этом не изменялась ветвистость отростков микроглии. Таким образом, впервые показано, что блокада NOX2 блокирует активацию микроглии в гиппокампе, которая наблюдается при развитии патологии. Была проведена практическая методическая подготовка для отработки деталей методов и условий проведения генетических анализов, включая пробоотбор и пробоподготовку, на основе которой выбирался протокол пробоотбора и консервации. Были отработаны все этапы для проведения полного анализа транскриптома мозга и количественного определения фекального и пристеночных микробиомов толстого и тонкого кишечника и произведена криоконсервация образцов. Производство тепла митохондриями имеет решающее значение для регулирования скорости метаболизма и предотвращения окислительного повреждения митохондрий и клеток, возникающее в результате продукции активных форм кислорода как побочного эффекта митохондриального кислородного дыхания. Для его изучения мы использовали нанотермометр на основе алмаза с модифицированной кристаллической решеткой, дефекты которой приводят к сдвигу длины волны флуоресценции в ответ на изменение температуры и не зависит от других факторов, что впервые позволило провести прямое измерение температуры индивидуальных митохондрий. Сброс мембранного потенциала при аппликации разобщителя СССР приводит к нагреванию митохондрий на 4 - 22 ° C, что впервые прямо подтверждает гипотезу “горячих митохондрий”. Проведенные исследования вносят вклад в выяснение основных молекулярных и клеточных механизмов эпилептогенеза, что необходимо для разработки эффективных методов лечения.