Аннотация результатов, полученных в 2020 году
В течение первого отчетного периода настоящего проекта был осуществлен сбор биологического материала на территории подведомственных регионов Северо-Западного Федерального округа и в южных регионах Российской Федерации. Из материала, хранящегося в коллекции ФКУЗ Ставропольский противочумный институт отобран биоматериал для исследования генетического разнообразия вируса Крымской-Конго геморрагической лихорадки - положительные на наличие РНК вируса ККГЛ, отрицательные на КГЛ от лихорадящих больных, положительные на наличие IgG к вирусу ККГЛ) и суспензий иксодовых клещей, положительных на наличие РНК вируса ККГЛ. Из ранее собранных в рамках Российско-Гвинейского сотрудничества по борьбе с инфекционными заболеваниями в Западной Африке образцов (клинический материал и клещи) были отобраны образцы для текущих исследований по проекту. Для создания диагностических систем были выбраны праймеры и зонды для идентификации таких патогенов, как вирус клещевого энцефалита, вирус бешенства, хантавирусы Пуумала и Добрава. Для разрабатываемых систем был произведен дизайн и сборка генетических конструкций, которые в дальнейшем будут использоваться как положительные контроли. Методом высокопроизводительного секвенирования был расшифрован геном редкого клещевого орбивируса Вад Медани, который впервые был изолирован на территории Российской Федерации. Штамм вируса был охарактеризован филогенетически и методами протеомного анализа. Для вируса впервые показана множественная внутривидовая межсегментная реассортация. Установлена филогенетическая связь секвенированного штамма с другими штаммами вируса Вад Медани, выделенными в разное время на различных территориях. Таким образом показано, что вирус имеет широкий ареал циркуляции, поддерживаемый, вероятно, за счет перелетных птиц. По результатам исследования подготовлена публикация Dedkov VG et al, Isolation and Characterization of Wad Medani Virus Obtained in the Tuva Republic of Russia. Ticks Tick Borne Dis. https://doi.org/10.1016/j.ttbdis.2020.101612 Проведен молекулярно-эпидемиологический анализ штаммов вируса Крымской-Конго геморрагической лихорадки (CCHFV), циркулирующих на территории Российской Федерации. В ходе исследования получены новые данные о генетическом разнообразии и географическом распространении генетических вариантов CCHFV в России. Показано, что на юге Европейской части России в популяции CCHFV преобладают штаммы линии Europe 1. Выявлены процессы сегментарной реассортации между штаммами различных подгрупп в пределах линии Europe 1. По результатам исследования подготовлена и направлена журнал PloS Pathogens статья «Molecular epidemiology of Crimean–Congo Hemorrhagic Fever in Russia». Проведен анализ превалентности Крымской–Конго геморрагической лихорадки в сельских районах Гвинейской республики. Образцы сыворотки крови от людей (N=2207) были исследованы с помощью иммуноферментного анализа (ИФА) на наличие специфических IgG против вируса CCHFV. Кроме того, 4273 образца клещей из нескольких источников (крупный рогатый скот, домашние и бродячие собаки, а также мелкие млекопитающие) были собраны и изучены с использованием ИФА и ОТ-ПЦР для выявления антигена CCHFV и специфической РНК. Изучение совокупных данных о клещевых пулах CCHFV-позитивных клещей по видам клещей выявило некоторые особенности. В частности, совокупное число (процент) положительных проб по видам клещей составило: 3,1% у A. variegatum; 5,6% у R. annulatus; 5,1% у R. geigyi; 1,8% у R. decoloratus; и 10,0% у R. sanguineus s.l. Так, наибольшее количество положительных проб наблюдалось у R. sanguineus s.l. Среди клещей H. leachi и H. truncatum положительных проб не обнаружено. Превалентность CCHFV среди различных видов клещей коррелировала с количеством образцов в положительных пулах. Таким образом, превалентность CCHFV среди клещей R. sanguineus s.l. составила 3,5%, что выше некоторых предварительных оценок. Превалентность CCHFV среди других видов клещей составила: 1,9% у R. annulatus; 1,7% у R. geigyi; 1,0% у A. variegatum; и 0,6% у R. decoloratus. Средняя превалентность CCHFV среди гвинейских клещей составила 1,2%. По результатам исследования опубликована статья: Naidenova EV et al. Prevalence of Crimean-Congo hemorrhagic fever virus in rural areas of Guinea. Ticks Tick Borne Dis. 2020; 11(5): 101475. doi: 10.1016/j.ttbdis.2020.101475. Было проведено исследование структуры заболеваемости лихорадками неясного генеза в Республике Гвинея. Диагноз был установлен чуть более чем в 40% исследованных образцов; были идентифицированы вирусные и бактериальные патогены. Среди вирусных патогенов большинство случаев приходилось на желтую лихорадку (12,2%) и лихорадку ласса (4,3%), кроме того, были выявлены случаи лихорадок Крым-Конго (0,6%), Зика (0,6%) и денге (1,2%). По результатам данного фрагмента работы была подготовлена и направлена в журнал Advances in Virology статья «Differential Laboratory Diagnosis of Acute Fever in Guinea: How many pathogens can masquerade as Ebola?». В целом план работ на 2020 г. выполнен. Кроме того, в 2020 г. научным коллективом выполнены масштабные сверхплановые работы по тематике проекта, давшие ряд новых результатов, значимых для изучения вирусов -возбудителей природно-очаговых инфекций. План публикаций выполняется с опережением.

Аннотация результатов, полученных в 2021 году
В сентябре 2021 г. состоялся визит руководителя научного проекта во ФБУН НИИЭМ им. Пастера. Был проведен рабочий семинар с членами научного коллектива, в ходе которого были доложены научные результаты, полученные на момент визита, а также определена тематика и перечень публикаций, которые необходимо подготовить по представленным материалам. Научным руководителем Проекта для сотрудников ФБУН НИИЭМ им. Пастера, а также для студентов биологического кластера Университета "ИТМО" и аспирантов медицинских ВУЗов был прочитан цикл лекций по биологической статистике и частным вопросам эпидемиологии природно-очаговых заболеваний. https://www.pasteurorg.ru/article/261/3474/Aleksandr-Platonov-prochtet-uchenym-cikl-lekciy-po-biostatistike-i-epidemiologii В ходе двух визитов Лукашевым А.Н., являющимся приглашенным ученым в 2021 году, был прочитан курс лекций по филогенетическому и филодинамическому анализу генетических последовательностей вирусов. https://www.pasteurorg.ru/article/261/3456/Seminar-Geneticheskaya-i-populyacionnaya-dinamika-virusov-cheloveka-sostoyalsya-v-Institute Доктором У. Фае проведен полногеномный сиквенс восьми штаммов вирусов Буньямвера и Нгари с помощью платформы для полногеномного секвенирования Illumina MiSeq (USA). Обработка данных проводилась совместно с сотрудниками ФБУН НИИЭМ им. Пастера. Таким образом, удалось осуществить полную сборку геномов восьми штаммов вирусов Буньямвера и Нгари во время визита сотрудников ФБУН НИИЭМ им. Пастера в Сенегал. В настоящее время последовательности аннотированы и готовятся к депонированию в Gen Bank NCBI. В соответствии с годовым планом работы два сотрудника ФБУН НИИЭМ им. Пастера выезжали в р. Сенегал для проведения молекулярных исследований совместно с сотрудниками Института Пастера в Дакаре, а также для участия в экспедиционных работах по сбору полевого материала (клещей). В ходе визита были проведены консультации с сотрудниками групп паразитологии и вирусологии, в ходе которой был согласован протокол сбора, сортировки, типирования эктопаразитов (клещей) - переносчиков арбовирусных инфекций. Были определены принципы пулирования образцов, согласован протокол гомогенизации, выделения нуклеиновых кислот и спектр молекулярных исследований. Были определены точки сбора эктопаразитов в различных регионах Сенегала, согласованы сроки сборов, с учетом сезонности и миграционных путей диких животных. В ходе полевых выездов проведена имплементация разработанных протоколов по сбору эктопаразитов. В результате экспедиционных работ, проведенных как совместно, так и без участия сотрудников ФБУН НИИЭМ им. Пастера, были собраны 2000 пулов клещей - переносчиков вирусов Крымской-Конго геморрагической лихорадки, Вад Медани, вируса Бандия. На модельных образцах (панель образцов РНК вирусов КГЛ, Нгари, Буньямвера, Вад Медани, Денге, ЛЗН, бешенства, Чикунгунья, Рифт Валлей) был отработан протокол ПЦР в формате мультипрайм для последующего высокопроизводительного секвенирования РНК с целью скрининга арбовирусов в собираемом материале. Согласованы проекты двух совместных научных публикаций, которые в настоящее время готовятся к подаче в печать. Также намечен план еще двух публикаций по теме Гранта, которые планируется подготовить к печати в следующем году. Определен список актуальных для Сенегала арбовирусных инфекций, изучению которых планируется посвятить следующий год в случае продления финансирования. В качестве объектов исследования были определены вирусы Крымской-Конго геморрагической лихорадки, вирусов Денге, Зика , Чикунгунья, Рифт валлей, Лихорадки Западного Нила, Бандия, Буньямвера, Нгари, Батаи, Вад Медани. Была подготовлена техническая документация для производства наборов реагентов для диагностики вирусов клещевого энцефалита, бешенства и хантавирусов Пуумала и Добрава. Были разработаны методики для выявления генетических маркеров вирусов Нгари, Буньямвера, Крым-Конго, Ниппах и Хендра. Для этих вирусов созданы контрольные образцы, выбраны праймеры и зонды. Проведены работы по оптимизации методик проведения ПЦР в реальном времени. В дополнение к запланированным разработкам нами была проведена разработка диагностической методики в формате ОТ-ПЦР в реальном времени для выявления генетических маркеров вируса Банья. Такое решение было принято после посещения Института Пастера в Дакаре в ходе совместного обсуждения планов исследования в 2022 году.

Аннотация результатов, полученных в 2022 году
В 2023 году были продолжены работы по изучению разнообразия арбовирусов на территории Республики Сенегал. В частности, с рогатого скота был собран материал (2860 клещей), из которого было сформировано 844 пула с учетом вида, пола клеща, стадии развития и региона сбора. Сбор проводили в восьми различных провинциях (Баньдия, Татки, Тессекере, Сент-Луис, Колда, Хаэре Лао, Кассак) находящихся в различных климатических зонах, от сухого тропического на границе с Мавританией, до влажного тропического на границе с Гвинеей Биссау. Было проведено видовое типирование собранных клещей с помощью морфологических "ключей", проведена гомогенизация и выделение нуклеиновых кислот. Полученные таким образом образцы были исследованы на наличие генетических маркеров вируса Крымской-Конго геморрагической лихорадки. При этом средняя превалентность вируса крымской-конго геморрагической лихорадки в клещах Сенегала составила 3,6%. Наибольшая часть положительных находок относилась к материалу, собранному в северной части страны, на границе с Мавританией, что обусловлено трансграничными перемещениями рогатого скота. Это предположение получило поддержку в результате филогенетического анализа полученных изолятов с использованием генетических последовательностей S сегмента. Таким образом можно сделать вывод о том, что в Республике Сенегал происходит интенсивная циркуляция вируса крымской-конго геморрагической лихорадки. При этом большое влияние на эпидемический процесс оказывает трансграничное перемещение групп рогатого скота между Мавританией и Сенегалом, что привело к формированию общего для этих стран природного очага. В соответствии с планом нами были изучены особенности эпидемического процесса лихорадки Денге в Республике Сенегал. Начиная с 2017 г. в Сенегале регистрируется рост заболеваемости лихорадкой Денге, характеризующейся множественной очаговостью и циркуляцией нескольких серотипов. В 2018 г. в Сенегале было отмечено четыре вспышки лихорадки Денге. Две из них в Россо на границе с Мавританией, где единственным циркулирующим серотипом был DENV-2, еще одна в г. Тиес, где выявлена циркуляция двух серотипов DENV-2 и DENV-3, с преобладанием последнего. В этой связи было принято решение исследовать вирусные детерминанты, которые могли способствовать преимущественному распространению DENV-2 во время вышеупомянутых эпидемий. В нашей работе мы исследовали образцы, собранные от больных с подозрением на лихорадку Денге в 2018 году и хранящиеся в биобанке Института Пастера в Дакаре. В образцах из Россо (n = 7) (Северный Сенегал), Дакара (n = 2) (Западный Сенегал) и Тиеса (n = 1) (Западный Сенегал) было подтверждено наличие вируса DENV-2. Проведенный филогенетический анализ показал, что все сенегальские штаммы DENV-2 относятся к генотипу Cosmopolitan и тесно связаны с западноафриканскими изолятами из выборки в период с 2016 по 2019 год. В весенний период 2022г был проведен сбор полевого материала (клещей) на территории Северо-Западного Федерального округа. В частности, сбор был проведен В г. Санкт-Петербург, в Ленинградской, Псковской, Архангельской областях и в Республике Карелия. Всего с указанных территорий собрано 1356 клещей. Клещи были исследованы индивидуально методом ОТ-ПЦР на наличие генетических маркеров вируса клещевого энцефалита. Всего было выявлено 9 положительных образцов, которые далее были исследованы методом высокопроизводительного секвенирования. Проводится филогенетический. В 2022 году была организована одна командировка двух сотрудников в Республику Сенегал. В ходе командировки были согласованы протоколы проведения исследований клещей, проведено обучение местного персонала особенностям пробоподготовки образцов после проведения родоспецифической ОТ-ПЦР, апробированы на музейных штаммах из коллекции Института Пастера в Дакаре разработанные методики молекулярной детекции вирусов Крымской-Конго геморрагической лихорадки, Нгари, Батаи, Буньямвера, Баньдия. В рамках запланированных исследований были проведены работы по изучению генетического разнообразия ортобуньявирусов серологической группы буньямвера. На момент начала исследований видовая принадлежность многих вирусов этой группы имела спорные позиции, что приводило к некоторой путанице в публикуемых научных трудах и затрудняло дальнейшее их изуxение и классификацию вновь открываемых представителей. В настоящее время в базе данных GenBank NCBI представлено шестьдесят четыре полногеномных последовательности членов серогруппы Bunyamwera. В соответствии с текущими демаркационными критериями ICTV видовую принадлежность многих штаммов следует пересмотреть. В частности, из шестнадцати последовательностей, обозначенных как Bunyamwera orthobunyavirus sp., три штамма следует отнести к виду Fort Sherman orthobunyavirus sp.: SFCrEq231 (KP063892-KP063894), SFBzEq232 (KP063895-KP063897) и SFAbCrEq238 (KP063898-KP063900). Два изолята из шестнадцати относятся к разным видам вирусов: NORV (MH484312-MH484314) и SHOV (MH484330-MH484332). Кроме того, три из них следует отнести к виду Main Drain orthobunyavirus sp.: изолят LOKV A10391 (MH484303-MH484305), изолят LOKV FMS 4332 (MG820264, MG828823 и MG696865) и изолят SARV M2.-1493 (MH484324-MH484326). Из пятнадцати последовательностей, классифицированных как Batai orthobunyavirus sp., две следует отнести к другим, отдельным, видам вируса: изолят BATV K10441 (KU661980, KU661984 и KU661991) и штамм BATV MS50 (NC_043579-NC_043581). Штамм BATV М150 считается эталонным штаммом вида, однако, в соответствии с текущими критериями ICTV, он к этому виду не принадлежит. Поскольку с исторической точки зрения штамм М50 не был первым обнаруженным штаммом BATV, было бы логично оставить название Batai orthobunyavirus sp. Для основной группы вирусов и дать новое видовое название штамму М50. Это предположение подтверждается Groseth et al., которые определили, что штамм MS50 на самом деле не связан с BATV и, вероятно, представляет собой новый генотип в роде Orthobunyavirus (DOI: 10.1128/JVI.02641-12). Штамм BATV К10441 также не может быть отнесен к виду Batai orthobunyavirus sp. Этот штамм был выделен в Западной Австралии недалеко от деревни Вилларе. Возможно, его следует обозначить как Willare orthobunyavirus sp. Данное название было утверждено совместно с коллективом авторов, открывших вирус (DOI: 10.1371/journal.pone.0164868). Среди последовательностей, классифицированных как Maguari orthobunyavirus sp., три требуют реклассификации: штамм PLAV 75V5938 (KX100124-KX100126), штамм MAGV CoAr 3363 (KX100109-KX100111) и штамм MAGV AG83-1746 (KX100112-KX100114). Первые два следует отнести к виду Cache Valley orthobunyavirus sp., третий должен принадлежать виду Fort Sherman orthobunyavirus sp. При анализе нами также было выявлено явление реассортации М-сегмента между штаммом FSV 86MSP18 (MH484294-MH484296) и CVV. Реассортация M сегмента была также обнаружена между MDV и POTV: MDV штамм 72V2567 (MH484306-MH484308) или MDV штамм R4680 (MH484309-MH484311) со штаммом POTV 89-3380 (MH484321-MH484323). или штамм POTV IL94-1899 (NC_043645-NC_043647). Более того, мы обнаружили признаки реассортации LOKV и SARV или MDV с неизвестным вирусом. По результатам работ опубликована научная статья. В дополнение к запланированным исследованиям было проведено изучение разнообразия вирусов в летучих мышах Подмосковья. В результате исследования был выявлен новых МЕРС-подобный коронавирус, анализ структуры которого позволяет говорить о его способности инфицировать человека. Новый вирус был секвенирован и назван MOW-BatCoV штамм 15-22, его полногеномная нуклеотидная последовательность депонирована в базу данных GenBank (ON325306). По результатам исследования подготовлена публикация в International Journal of Environmental Research and Public Health, препринт можно посмотреть по ссылке https://www.biorxiv.org/content/10.1101/2022.06.09.495421v1. По результатам исследования в 2022 году опубликовано 3 статьи в изданиях, входящих в базу Web of Science core collection. Две из них опубликованы в изданиях первого квартиля (Q1).