КАРТОЧКА ПРОЕКТА,
ПОДДЕРЖАННОГО РОССИЙСКИМ НАУЧНЫМ ФОНДОМ

Информация подготовлена на основании данных из Информационно-аналитической системы РНФ, содержательная часть представлена в авторской редакции. Все права принадлежат авторам, использование или перепечатка материалов допустима только с предварительного согласия авторов.

 

ОБЩИЕ СВЕДЕНИЯ


Номер 17-16-01100

НазваниеПротеомный скрининг амилоидных белков у посевного гороха (Pisum sativum L.) и клубеньковой бактерии (Rhizobium leguminosarum)

РуководительНижников Антон Александрович, Кандидат биологических наук

Организация финансирования, регионФедеральное государственное бюджетное научное учреждение "Всероссийский научно-исследовательский институт сельскохозяйственной микробиологии", г Санкт-Петербург

Года выполнения при поддержке РНФ 2020 - 2021 

КонкурсКонкурс на продление сроков выполнения проектов, поддержанных грантами Российского научного фонда по приоритетному направлению деятельности Российского научного фонда «Проведение фундаментальных научных исследований и поисковых научных исследований отдельными научными группами» (18)

Область знания, основной код классификатора 06 - Сельскохозяйственные науки, 06-104 - Агробиотехнологии

Ключевые словаАмилоид, белковая фибрилла, горох посевной, агробиотехнология, клубеньковая бактерия, бактероид, запасные белки, sym31, Pisum sativum, Rhizobium, протеомика, транскриптомика

Код ГРНТИ68.03.03


 

ИНФОРМАЦИЯ ИЗ ЗАЯВКИ


Аннотация
В рамках выполнения Проекта в 2017-2019 гг. получены приоритетные данные о белках растений и клубеньковых бактерий, обладающих амилоидными свойствами, то есть способностью формировать фибриллы с особой упорядоченной пространственной структурой. Впервые в мировой практике идентифицирован белок растений, образующий амилоиды в физиологических условиях – вицилин посевного гороха Pisum sativum L., являющийся одним из основных запасных белков семян. Впервые идентифицированы амилоидные белки клубеньковой бактерии R. leguminosarum, RopA и RopB, показано формирование этими белками фибрилл в капсуле – особой экстраклеточной структуре, образуемой этим микроорганизмом и играющей важную роль в вирулентности и формировании начальных стадий растительно-микробных взаимодействий. В рамках Проекта 2020-2021 предполагается проведение дальнейших исследований функционального амилоидогенеза у растений и клубеньковых бактерий, выяснение его физиологической роли в запасании белка в семенах и защите от патогенов у растений, а также растительно-микробных взаимодействиях. Первое направление работы будет продолжать исследование амилоидных свойств белка семян гороха вицилина. Согласно современным представлениям, некоторые запасные белки семян, включая купины, к которым принадлежит и вицилин, являются бифункциональными, выполняя не только запасную, но и защитную функцию. Это связано с наличием у них лектиновых доменов, связывающих углеводы и обладающих токсическим эффектом на различные патогенные микроорганизмы. В рамках Проекта будет проверено формирование вицилином амилоидных агрегатов в разных органах гороха (листьях, побегах, корнях) и проведена оценка токсичности этих агрегатов для ряда патогенных грибов и бактерий. Второе направление работы будет включать исследование амилоидных свойств других запасных белков семян гороха – легумина и конвицилина, ранее выявленных в качестве кандидатов на роль новых амилоидов в ходе протеомного и биоинформатического скринингов. Будет проверена способность формирования этими белками фибрилл in vitro и соответствие этих фибрилл основным свойствам амилоидов: устойчивость к обработке ионными детергентами и протеазами, обогащенность бета-слоями, связывание амилоид-специфичных красителей Тиофлавина Т и Конго красного. В случае если легумин и конвицилин образуют амилоиды in vitro, их амилоидные свойства будут также исследованы in vivo путем анализа формирования ими детергент-устойчивых агрегатов в семенах гороха и связывания этими агрегатами амилоид-специфичных красителей. Третье направление работы будет посвящено анализу роли ранее выявленных амилоидных белков RopA и RopB клубеньковой бактерии R. leguminosarum в формировании растительно-микробного симбиоза. В его рамках будет проведен анализ формирования амилоидов RopA и RopB на стадии связывания бактериальных клеток с корнями растения, а также у бактероидов, то есть дифференцированной азотфиксирующей формы R. leguminosarum, находящейся в клубеньках гороха. Также будет изучено влияние делеций генов, кодирующих RopA и RopB, влекущих за собой невозможность формирования этими белками амилоидных фибрилл, на взаимодействие R. leguminosarum с растением-хозяином, дифференцировку в бактероиды и формирование клубеньков. В рамках четвертого направления будет проведен анализ взаимодействия идентифицированных нами амилоидных белков растений с другими амилоидными белками в системе in vitro. В проведенных ранее исследованиях нами показано, что амилоиды вицилина являются крайне устойчивыми и выдерживают обработку ферментами пищеварительного тракта в физиологических условиях, а также сохраняются в консервированных пищевых продуктах из гороха. Кроме того, структура вицилина сходна со структурами белков наружной мембраны грамотрицательных бактерий, имея в своей основе домены типа «бета-баррель». На основании этого можно предположить, что амилоиды вицилина, попадающие в пищеварительный тракт при употреблении в пищу семян гороха, потенциально могут индуцировать амилоидогенез у сходных по структуре белков бактерий кишечника, а также вызывать агрегацию некоторых белков человека. Потенциальная возможность такого действия амилоидов вицилина будет проверена путем анализа их влияния in vitro на эффективность образования амилоидов белками наружной мембраны грамотрицательных бактерий, а также некоторыми амилоидогенными белками и пептидами человека, включая патологические (амилоид-бета, лизоцим, инсулин и альфа-синуклеин). В целом, выполнение настоящего Проекта позволит впервые ответить на фундаментальные вопросы о роли амилоидогенеза у растений в защите от патогенов, вовлеченности различных групп запасных белков в формирование комплексов амилоидных агрегатов в семенах растений, роли амилоидогенеза в контроле растительно-микробных взаимодействий, а также возможном влиянии амилоидов запасных белков семян растений на индукцию амилоидогенеза белков человека и бактерий.

Ожидаемые результаты
Ожидаемые результаты Проекта 2020-2021 гг. будут обладать новизной и значимостью мирового уровня. В качестве основных объектов исследования будут использованы посевной горох Pisum sativum L. и клубеньковая бактерия Rhizobium leguminosarum. Будет продолжена характеристика амилоидов, идентифицированных в рамках Проекта 2017-2019 гг., прежде всего, с позиций детального анализа физиологической роли амилоидогенеза у растений и клубеньковых бактерий, а также проведено выявление новых амилоидов. Бифункциональность запасных белков семян растений является предметом оживленных дискуссий, поскольку в последнее время становится ясным, что многие из этих белков выполняют не только запасную, но и защитную функцию, выступая в качестве связывающих углеводы белков-лектинов, вызывающих агглютинацию патогенных микроорганизмов. В рамках Проекта будет продолжено исследование амилоидных свойств запасного белка семян гороха вицилина. Будут получены приоритетные результаты по анализу образования этим белком амилоидных агрегатов в различных органах растений (листья, стебли, корни), а также токсичности этих агрегатов для ряда патогенных грибов и бактерий. Эти данные позволят более широко оценить роль амилоидогенеза запасных белков не только в контексте формирования амилоидов как стабильных структур для долговременного запасания и хранения в семенах, но также как защитных структур, токсичных для патогенов. Одним из важнейших вопросов настоящего исследования является то, какие группы запасных белков семян образуют амилоиды. В ранее проведенном протеомном скрининге был выявлен не только вицилин, амилоидные свойства которого были полностью охарактеризованы нами in vivo и in vitro, но и представители двух других ключевых групп запасных белков: легумин и конвицилин. Для этих белков будут получены результаты полной характеристики амилоидных свойств in vitro (образование фибрилл, проверка их устойчивости к обработке детергентами и протеазами, связывание амилоид-специфичного красителя Тиофлавина Т, двойное лучепреломление зеленого цвета при связывании красителя Конго красный, обогащенность бета-слоями). В случае если легумин и конвицилин образуют амилоиды in vitro, будут получены результаты характеристики их амилоидных свойств in vivo, включая анализ детергент- и протеазоустойчивости их агрегатов в лизатах семян, а также колокализацию антител к этим белкам с амилоид-специфичными красителями на гистологических препаратах. Значимость исследования роли амилоидогенеза в контроле растительно-микробных взаимодействий трудно переоценить, так как, фактически, это явление может представлять собой принципиально новых механизм взаимодействия в системе «симбионт-хозяин». В рамках настоящего Проекта будет продолжено исследование роли идентифицированных нами амилоидных белков RopA и RopB клубеньковой бактерии R. leguminosarum во взаимодействии с растением-хозяином P. sativum L. При помощи вестерн-блот гибридизации, оптической и электронной микроскопии будут получены сравнительные данные о наличии и количестве амилоидов этих белков на различных фазах жизненного цикла бактерии (свободноживущая культура; клетки, взаимодействующие с корнями растения-хозяина; бактероиды). Также будут изучены эффекты делеций этих генов (в случае, если они не будут иметь летальных последствий) на способность бактерии взаимодействовать с корнями растения и образовывать бактероиды. Полученные результаты позволят сделать вывод о физиологической роли амилоидогенеза RopA и RopB в контроле растительно-микробных взаимодействий. Взаимодействие амилоидов друг с другом является фактором развития некоторых неизлечимых болезней человека. Хорошо известно, что амилоиды одних белков могут специфично индуцировать амилоидогенез других. Амилоиды идентифицированного нами растительного белка вицилина обладают устойчивостью к действию ферментов пищеварительного тракта, следовательно, они потенциально могут взаимодействовать в пищеварительном тракте со сходными по структуре белками бактерий кишечного микробиома, а также и белками клеток человека. В связи с этим, важной задачей является проверка возможного влияния амилоидов вицилина на индукцию амилоидогенеза бактериальных белков и белков человека, в том числе, образующих патогенные амилоиды. В рамках Проекта будут получены результаты по оценке влияния амилоидов вицилина на индукцию амилоидогенеза бактериальных белков (прежде всего, поринов наружной мембраны грамотрицательных бактерий, вовлеченных в патогенез целого ряда заболеваний), а также амилоидогенных белков и пептидов человека (инсулин, лизоцим, амилоид-бета, альфа-синуклеин). В случае если амилоиды вицилина будут индуцировать амилоидогенез этих белков, это можно будет считать первым свидетельством в пользу влияния пищи растительного происхождения на потенциальную возможность возникновения амилоидозов и других заболеваний с амилоидной агрегацией белков. В целом, ожидается, что в рамках Проекта 2020-2021 гг. будут получены обладающие новизной и приоритетом на мировом уровне данные о многообразии биологических ролей амилоидогенеза запасных белков растений в контексте его возможного влияния не только на формирование и поддержание резервуара питательных веществ, но и на защиту растений от патогенов; разнообразии запасных белков семян, формирующих амилоиды in vitro и in vivo; роли амилоидогенеза белков клубеньковых бактерий в контроле растительно-микробных взаимодействий, а также влиянии амилоидных белков растений на амилоидогенез белков бактерий и человека.


 

ОТЧЁТНЫЕ МАТЕРИАЛЫ


Аннотация результатов, полученных в 2020 году
Исследования в рамках Проекта в 2020 г. были посвящены расширению знаний о разнообразии амилоидных белков растений и их функций. Нами впервые было проведено исследование амилоидных свойств запасных белков семян посевного гороха P. sativum L. легумина А2 и конвицилина. Эти белки ранее были идентифицированы в протеомном скрининге белков, формирующих амилоидоподобные детергент-устойчивые агрегаты в семенах гороха. Полученные в рамках настоящего этапа работы данные впервые показали, что в определенных условиях оба этих белка формируют фибриллы, обладающие устойчивостью к обработке холодными ионными детергентами, связывающие амилоид-специфичный краситель Тиофлавин-Т и демонстрирующие двойное лучепреломление при связывании красителя Конго красный. Эти результаты свидетельствуют в пользу наличия амилоидогенных свойств у легумина А2 и конвицилина in vitro. Связывание конго красного и формирование двойного лучепреломления клетками бактерий, секретирующих легумин А2 и конвицилин в системе C-DAG, показывает, что эти белки могут формировать амилоидоподобные агрегаты и в условиях, приближенных к in vivo. Амилоидные свойства этих белков in vivo планируется проверить в рамках следующего этапа работ. Эти результаты представляют значительный интерес, так как свидетельствуют в пользу того, что разные запасные белки могут быть представлены в амилоидной форме в семенах и, потенциально, образовывать сложные агрегаты, состоящие из белков разных групп. Взаимодействие различных амилоидов растений друг с другом и с амилоидами человека и бактерий планируется изучить в 2021 году, для чего в рамках данного этапа проекта получены в препаративных количествах фибриллы требуемых белков. Необходимо отметить, что легумины, конвицилин и вицилин, амилоидные свойства которого были показаны нами [Antonets et al., PLOS Biology, 2020], относятся к глобулинам семян, имеющим домены древнего суперсемейства Cupin, представленные в белках как прокариот, так и эукариот, и обладающие структурой бета-баррель. Основываясь на полученных нами данных можно предположить, что именно эти домены являются ключевыми детерминантами амилоидных свойств глобулинов семян, а также потенциально могли бы обуславливать их взаимодействие в амилоидной форме. Другим аспектом функциональных свойств амилоидов запасных белков семян растений, который был изучен в рамках настоящего исследования, было возможное участие этих белков в защите растений от патогенов. Хорошо известно, что купиновые белки, к которым относятся и глобулины семян, играют важную роль в защите растений от патогенов, прежде всего, благодаря своей лектиновой активности. Мы изучили особенности продукции белка вицилина в различных органах растения гороха и выяснили, что если в листьях и стебле наблюдается достаточно низкая продукция этого белка, то в корне вицилин продуцируется на значительно более высоком уровне и образует хорошо детектируемые при помощи флуоресцентной микроскопии агрегаты. Более того, особенно высокий уровень продукции вицилина наблюдался в корневых клубеньках гороха, где было отмечено как диффузное свечение, которое может свидетельствовать в пользу наличия вицилина в растворимой или олигомерной форме, так и крупных агрегатов. Данные о естественной сверхпродукции вицилина в корнях и клубеньках гороха свидетельствуют в пользу его возможной вовлеченности в надорганизменные растительно-микробные взаимодействия. Несмотря на то, что взаимодействия растений с клубеньковыми бактериями являются мутуалистическими, молекулярные системы, обуславливающие взаимодействия «патоген-хозяин» и «симбионт-хозяин», обладают существенным сходством [см., например, обзор Kosolapova et al., Int. J. Mol. Sci., 2020], поэтому взаимодействие вицилина с бактериями в клубеньках может потенциально свидетельствовать и о его взаимодействии с патогенами. Мы проанализировали влияние амилоидных фибрилл вицилина на рост патогенных бактерий Rhodococcus fascians и гриба Fusarium solani, в результате чего было обнаружено, что амилоиды вицилина подавляют рост этих видов, хотя эффекты в отношении F. solani были выражены слабее, что может быть связано с конкретными особенностями использованных сред и режимов культивирования. Более того, с использованием дрожжей S. cerevisiae нами было показано, что дизрупция фибрилл вицилина при помощи ультразвука приводит к элиминации токсичности, то есть именно фибриллярное амилоидное состояние вицилина вызывает ингибирование роста грибов. Таким образом, данные, полученные нами в рамках выполнения настоящего этапа Проекта, показывают, что фибриллы вицилина оказывают существенное ингибирующее влияние на рост патогенных микроорганизмов, что свидетельствует в пользу возможного участия этого белка в амилоидной форме в защите от патогенов. В целом, в рамках выполнения данного этапа Проекта впервые получены приоритетные данные об амилоидных свойствах запасных белков семян гороха P. sativum L. легумина А2 и конвицилина in vitro, а также показано что вицилин продуцируется и агрегирует в различных органах этого растений, причем максимальная продукция этого белка достигается в корне и корневых клубеньках, а его амилоиды токсичны для патогенных для растения грибов и бактерий. Публикации по результатам выполнения Проекта в 2020 году: 1. Kosolapova A.O., Antonets K.S., Belousov M.V., Nizhnikov A.A. Biological functions of prokaryotic amyloids in the interspecies interactions: facts and assumptions // International Journal of Molecular Sciences, 2020, V.21, e7240. 2. Antonets K.S., Belousov M.V., Sulatskaya A.I., Belousova M.E., Kosolapova A.O., Sulatsky M.I., Andreeva E.A., Zykin P.A., Malovichko Y.V., Shtark O.Y., Lykholay A.N., Volkov K.V., Kuznetsova I.M., Turoverov K.K., Kochetkova E.Y., Bobylev A.G., Usachev K.S., Demidov O.N., Tikhonovich I.A., Nizhnikov A.A. Accumulation of storage proteins in plant seeds is mediated by amyloid formation // PLOS Biology, 2020, V.18(7), e3000564.

 

Публикации

1. - Амилоиды помогут улучшить качество и питательную ценность семян: исследование ГлавАгроном, Исследование поддержано грантом Российского научного фонда № 17-16-01100. (год публикации - ).

2. - Открытие амилоидов у растений может помочь создать сорта с более питательными и гипоаллергенными семенами Поиск, Исследование поддержано грантом Российского научного фонда № 17-16-01100. (год публикации - ).

3. - Открытие амилоидов у растений может помочь создать сорта с более питательными и гипоаллергенными семенами Научная Россия, Исследование поддержано грантом Российского научного фонда № 17-16-01100. (год публикации - ).

4. Антонец К.С., Белоусов М.В., Сулацкая А.И., Белоусова М.Е., Косолапова А.О., Сулацкий М.И., Андреева Е.А., Зыкин П.А., Маловичко Ю.В. и соавторы, Нижников А.А. Accumulation of storage proteins in plant seeds is mediated by amyloid formation PLOS Biology, V.18(7), e3000564 (год публикации - 2020).

5. Косолапова А.О., Антонец К.С., Белоусов М.В., Нижников А.А. Biological functions of prokaryotic amyloids in the interspecies interactions: facts and assumptions International Journal of Molecular Sciences, V.21, e7240 (год публикации - 2020).