Аннотация результатов, полученных в 2020 году
В 2020 г. проведен первый этап изучения различных характеристик иммуноглобулинов, в том числе абзимов, а также специфических аутоантител, для решения одной из задач проекта: исследование цитокинов, участвующих в регуляции образования каталитически активных аутоантител при рассеянном склерозе (РС), системной красной волчанке (СКВ) и шизофрении. Проведен предварительный анализ концентрации цитокинов, участвующих в регуляции антителообразования (IL-2, IL-6), а также про- (IL-1β, INF-γ) и противовоспалительных цитокинов (IL-10) в сыворотке крови здоровых доноров и больных шизофренией методом иммуноферментного анализа (ИФА). Согласно полученным результатам, концентрация IL-2, одного из ключевых цитокинов в регуляции антителообразования, у больных шизофренией оказалась достоверно ниже, чем в сыворотке здоровых доноров. Кроме того, у больных шизофренией наблюдалось достоверное увеличение уровня противовоспалительного цитокина IL-10, по сравнению со здоровыми донорами. В дальнейшем планируется использовать мультиплексные технологии для анализа цитокинов. Методом ИФА показано, что концентрации всех подклассов IgG, общего IgG, IgA и IgM у пациентов с шизофренией (35 человек) и здоровых доноров (20 человек) находились в пределах референсных значений. Однако, согласно предварительным данным, у больных шизофренией выявлено изменение соотношения подклассов IgG с уменьшением процентного содержания IgG1 и IgG2 и увеличением IgG3 и IgG4. Следует отметить, что изучаемые параметры положительно коррелировали между собой (коэффициент корреляции Спирмена (R) составил от 0,343 до 0,746; p<0,05). Изменения соотношения подклассов IgG могут отражать эффекты нейролептической терапии, либо гетерогенность анализируемой группы. Показано, что титры антител к гистонам в сыворотке больных СКВ, РС и шизофренией оказались достоверно (p<0.013) значительно выше, чем у здоровых доноров. Также обнаружены значимые (p=0.002) отличия между уровнем антител у больных СКВ и шизофренией. Показано, что титр аутоантител к основному белку миелина (ОБМ) в группах больных РС и СКВ значимо (p<0.028) выше, по сравнению со здоровыми донорами. Также выявлены отличия в уровне антител у больных РС и СКВ. Однако других отличий не обнаружено. Проведен анализ каталитической активности препаратов IgG, выделенных из сыворотки крови, в реакции гидролиза ДНК, ОБМ и различных гистонов (H1, H2a, H2b, H3, H4). Показано, что уровень активности IgG больных РС и СКВ во всех случаях значительно выше, чем у здоровых доноров. Согласно предварительному анализу корреляции между титрами аутоантител к гистонам и ОБМ у больных РС с уровнем каталитической активности IgG в гидролизе гистонов и ОБМ не обнаружено. Выявлена отрицательная корреляция между титрами аутоантител к гистонам и к ОБМ (R= –0.44). Кроме того, обнаружена положительная корреляция между уровнями гидролиза гистонов и ОБМ (R от 0,36 до 0,51, в зависимости от гистона). При анализе корреляции в группе больных СКВ значимых закономерностей не обнаружено. Обнаруженные закономерности в дальнейшем необходимо подтвердить на больших выборках пациентов и здоровых доноров. Дополнительно проанализирована способность каталитических антител гидролизовать микроРНК. Показано, что препараты IgG при СКВ (IgG-СКВ, 31 препарат) и при РС (IgG-РС, 21 препарат) эффективно гидролизуют четыре нейрорегуляторных микроРНК (miR-219-2-3p, miR-137, miR-219-5p и miR-9-5p) и четыре иммунорегуляторных микроРНК (miR-326, miR-21-3p, miR-155-5p и miR-146a-3p). Средняя активность IgG-СКВ по медианным значениям статистически значимо в 84,8 раза выше, чем у здоровых доноров. Отмечалась тенденция к снижению эффективности гидролиза всех восьми микроРНК во время ремиссии по сравнению с обострением заболевания. Сравнение гидролиза 4-х нейрорегуляторных микроРНК препаратами IgG при СКВ, РС и шизофрении (результаты опубликованы нами ранее) показало, что в случае здоровых доноров активность гидролиза микроРНК в 1,2–5 раз ниже (р<0,05), чем у больных шизофренией, РС и СКВ. При этом уровень активности IgG при шизофрении оказался сопоставимым с уровнем при РС и СКВ. Поскольку воспалительные процессы при СКВ и РС связаны с изменением экспрессии микроРНК, снижение их концентрации за счет гидролиза аутоантителами-абзимами может иметь значение для патогенеза этих заболеваний. Сравнение нуклеазных активностей IgG при РС, СКВ и шизофрении показало высокий и сопоставимый уровень ДНК- и РНК-гидролизирующих активностей IgG при шизофрении, РС и СКВ, что свидетельствует о глубоких изменениях в иммунной системе при этих заболеваниях. Полученные данные позволяют предположить, что образование каталитических антител помогает удалять из кровотока молекулярные фрагменты, ассоциированные с повреждением (DAMPs), к которым относятся ДНК и РНК, и тем самым минимизировать воспалительные реакции. Поскольку каталитическая активность IgG отражает степень нарушений в иммунной системе, этот показатель, наряду с другими, можно использовать для иммунофенотипирования и стратификации пациентов с РС, СКВ и шизофренией. Кроме того, в 2020 г. нами написан и опубликован обзор «Immunoglobulins with Non-Canonical Functions in Inflammatory and Autoimmune Disease States», в котором детально проанализированы актуальные данные о каталитических антителах при нормальных и патологических состояниях. Полученные результаты широко освещены в средствах массовой информации.

Аннотация результатов, полученных в 2021 году
Основной задачей второго этапа проекта являлось комплексное исследование изменений концентраций цитокинов, участвующих в регуляции образования антител, титров иммуноглобулинов классов G, A, и M, концентраций аутоантител, а также каталитических активностей IgG в крови больных рассеянным склерозом, системной красной волчанкой и шизофренией по сравнению со здоровыми донорами. Для анализа концентраций цитокинов мультиплексным методом использовались два типа наборов для двух выборок пациентов. С помощью набора из 12 цитокинов показано, что сывороточные уровни всех проанализированных цитокинов в анализируемых группах значимо различаются, кроме уровня цитокина PBEF и IL-1b. Оказалось, что при шизофрении по сравнению со здоровыми донорами статистически значимо изменяются уровни следующих цитокинов: IL-6, IL-4, APRIL, BAFF, IL-1b. Важно отметить, что IL-6, APRIL и BAFF участвуют в регуляции образования иммуноглобулинов. Поэтому эти данные могут указывать на нарушение процесса антителообразования В-клетками при шизофрении. Ранее в наших работах показано, что при шизофрении образуются легкие цепи IgG с уменьшенной молекулярной массой (17,3 кДа) (Ermakov E.A. et al. Open Biology, 2015), что также согласуется с этими данными. В то же время IL-1b и IL-4 – это известные провоспалительные цитокины. При шизофрении во множестве работ показано увеличение этих цитокинов (Momtazmanesh S. et al. Frontiers in Psychiatry, 2019), поэтому эти данные согласуются с литературными. В группе больных РС статистически значимые изменения в концентрациях цитокинов обнаружены только для TNF-a и APRIL. Как указывалось ранее, APRIL участвует в регуляции образования антител. Обнаруженное снижение концентрации этого цитокина может быть связано с нарушениями в антителообразовании при РС. Снижение TNF-a, который модулирует созревание В-клеток и продукцию антител, также может приводить к нарушениям в генерации антител. В группе больных СКВ уровни IL-4, IL-6 и IL-10 статистически значимо повышались, а уровень APRIL снижался по сравнению со здоровыми донорами. Цитокины IL-6 и APRIL участвуют в регуляции антителообразования, IL-4 – это провоспалительный цитокин, а IL-10 является известным противовоспалительным цитокином. Разнонаправленные изменения в концентрациях цитокинов, регулирующих образование антител (IL-6 и APRIL) могут указывать на дисрегуляцию этого процесса. Повышение противовоспалительного IL-10 может являться компенсаторной реакцией на повышение провоспалительного IL-4 и общее провоспалительное состояние при СКВ. Для более детального анализа изменений цитокиновых профилей при РС и СКВ использовали набор из 41 цитокина. Методом анализа главных компонент и дискриминантным анализом методом наименьших квадратов показано, что комбинированные мультицитокиновые профили изучаемых групп отличаются. Основной вывод из полученных данных заключается в том, что цитокиновые профили при СКВ и РС значимо отличаются, как при сравнении со здоровыми донорами, так и при сравнении двух этих заболеваний. Полученные данные позволят более точно характеризовать изменения цитокиновых профилей при РС и СКВ, а также могут открыть на новые направления исследований нарушений в цитокиновой регуляции при этих патологиях. Анализ данных, полученных методом ИФА, показал, что концентрации общего IgG, IgA, IgM, а также титр IgG к основному белку миелина (ОБМ) в сыворотке крови при РС, СКВ и шизофрении достоверно не отличаются по сравнению со здоровыми донорами. Таким образом, результаты, полученные в 2020 г. не подтвердились на большей группе пациентов. Уровень IgG к гистонам в сыворотке больных СКВ оказался достоверно выше, чем у больных РС и у здоровых доноров. У больных шизофренией уровень антител к гистонам оказался значимо выше, чем у здоровых доноров. Кроме того, показано, что уровень IgG как к одноцепочечной, так и двухцепочечной ДНК в сыворотке крови больных СКВ достоверно выше, чем у здоровых доноров. Концентрации IgG как к одноцепочечной, так и двухцепочечной ДНК в сыворотке больных СКВ оказались достоверно выше, чем у больных РС. Титр IgG к одноцепочечной ДНК в сыворотке больных РС и у здоровых доноров достоверно не отличался, в то время как концентрация IgG к двухцепочечной ДНК у здоровых доноров достоверно выше, чем у больных РС. Анализ каталитической активности полученных электрофоретически гомогенных препаратов IgG в реакции гидролиза ДНК, ОБМ и различных гистонов показал, что уровень активности IgG больных РС, СКВ и шизофрении во всех случаях значительно выше, чем у здоровых доноров. Изучение РНКазной активности препаратов IgG пациентов с РС показало, что антитела эффективно распознают и гидролизуют четыре нейрорегуляторных микроРНК (miR-137, miR-9-5p, miR-219-2-3p и miR-219-5p) и четыре иммунорегуляторных микроРНК (miR-21-3p, miR-146a-3p, miR-155-5p и miR-326). Гидролиз всех микроРНК оказался в основном сайт-специфичным. Максимальная средняя относительная активность наблюдалась при гидролизе miR-155-5p для IgG пациентов с двумя типами РС – клинически изолированным синдромом и ремиттирующим РС, но также была высокой для пациентов с первично прогрессирующим и вторично прогрессирующим РС. Различия между относительной активностью IgG четырех групп пациентов с РС и здоровых доноров оказались статистически значимыми (p <0,015). Наблюдалась тенденция к снижению эффективности гидролиза всех восьми микроРНК в период ремиссии по сравнению с обострением заболевания. В результате проведенного обширного корреляционного анализа концентраций 12-ти и 41-го цитокина, титров IgG, IgA и IgM, концентрации аутоАТ в группах здоровых доноров, больных СКВ, РС и шизофренией получено большое количество корреляционных зависимостей уровней цитокинов как друг с другом, так и с концентрацией антител. Важно отметить, что корреляционные паттерны (наиболее выраженные и значимые корреляции) при различных заболеваниях изменяются, но ряд паттернов сохраняется. Эти данные могут указывать на существование регуляторных связей между наработкой этих цитокинов. Кроме того, обнаружена корреляция уровня ДНК-гидролизующей активности с уровнем следующих цитокинов: IL-17A, MDC (положит.) и sCD40L (отриц.). Можно предположить, что эти цитокины могут принимать участие в регуляции образования каталитических антител. Однако наличие корреляционной связи не означает наличие биологической связи, поэтому требуются дальнейшие исследования. В целом полученные данные об изменении паттернов корреляции свидетельствуют о нарушении регуляции цитокиновых сетей при изучаемых патологиях. Проанализировано влияние наличия сопутствующих заболеваний сердечно-сосудистой системы (ССЗ) на уровень ряда цитокинов при СКВ. Уровни TNFα, BAFF и IL-4 оказались значительно изменены при СКВ с сопутствующими ССЗ по сравнению с СКВ без ССЗ. Концентрация IL-4 увеличивалась в общей группе больных СКВ лишь за счет вклада больных с ССЗ. На основании этого можно предположить, что наличие сопутствующих ССЗ при СКВ способствует изменению цитокинового профиля, а также может привести к неправильной интерпретации результатов, когда не учитывается фактор сопутствующего ССЗ. Помимо этого показана принципиальная возможность использования иммунных показателей для стратификации больных шизофренией. Использование 4-х иммунных показателей позволило выделить среди больных шизофренией подгруппу с высокими концентрациями цитокинов. Данным пациентам может быть рекомендована персонифицированная противовоспалительная терапия. Полученный большой массив данных о концентрации множества цитокинов при СКВ, РС, шизофрении и у здоровых доноров и ассоциации изменений цитокиновых профилей с клиническими особенностями заболеваний позволил нам сформировать и отправить на регистрацию в Роспатент базу данных (БД) «Цитокиновые профили и клинические параметры пациентов с системной красной волчанкой, рассеянным склерозом и здоровых лиц». Опубликована 1 статья (Q1), одна статья отправлена в печать, результаты представлены на 3 Конференциях.

Аннотация результатов, полученных в 2022 году
Одной из основных задач проекта в этом году являлся поиск биологических ассоциаций изменений концентраций цитокинов, титров иммуноглобулинов (IgG, IgA, и IgM), титров аутоантител, а также уровней каталитических активностей IgG с клиническими особенностями заболеваний при рассеянном склерозе, системной красной волчанке и шизофрении по сравнению со здоровыми донорами. При анализе мультиплексным методом на основе магнитных частиц с использованием технологии Luminex xMAP (Luminex Corporation, США) изменений концентрации цитокинов у больных шизофренией показано, что у пациентов с шизофренией статистически значимо повышались концентрации цитокинов: IL-6, IL-2, IL-4, BAFF, IL-1β, IFNα. Концентрации IL-10, APRIL и IL-21 остались без изменений. В группах пациентов с выраженной позитивной и негативной симптоматикой отличались концентрации только цитокина IL-6. Увеличение концентраций IL-1β, IL-2, IL-4, IL-6 и IFNα у больных шизофренией укладывается в картину воспалительных процессов в организме человека. Увеличение концентрации BAFF скорее всего связано с увеличением пролиферации B-клеток у больных шизофренией, так как функция этого цитокина является ключевой для развития, дифференцировки и продукции антител в этих клетках. Уменьшение TNFα у пациентов с шизофренией, принимающих антипсихотические препараты, известно и связывается с общим иммуносупрессивным влиянием антипсихотиков, которые влияют на TNFα, являющимся одним из ключевых цитокинов в организации воспалительных процессов. Сильная статистически значимая положительная корреляция (р = 3,5x10-16) между цитокинами IL-1β и IL-2 сохраняется и для шизофрении, ранее нами показано наличие этой ярко выраженной корреляционной пары у больных системной красной волчанкой и у здоровых доноров. Статистически значимая корреляция между шкалами PANSS и некоторыми цитокинами (IL-1β, IL-2, IL-21, IFNα) указывает на их непосредственное влияние в развитии положительной или негативной симптоматики при шизофрении. Важно отметить, что отношение IL-10/IL-6 оказалось ниже у больных шизофренией, что указывает на преобладание провоспалительных процессов. Уровень IL-6 оказался выше у больных с выраженной негативной симптоматикой, чем у больных с позитивной симптоматикой. Таким образом, показано увеличение концентрации провоспалительных цитокинов IL-1β, IL-2, IL-4, IL- 6 и IFNα у пациентов с длительностью шизофрении более 5 лет, что указывает на преобладание хронических системных вялотекущих воспалительных процессов у этих пациентов. Снижение соотношения IL-10/IL-6 у больных шизофренией также указывает на провоспалительное состояние. Известно, что системная красная волчанка (СКВ) связана с повышенным риском сердечно-сосудистых заболеваний (ССЗ). Больные СКВ страдают ССЗ в 3,5 раза чаще, чем здоровые люди. Цитокин-опосредованное воспаление активно участвует в развитии сердечно-сосудистой патологии. Проанализировано влияние наличия сопутствующих заболеваний сердечно-сосудистой системы (ССЗ) на уровень ряда цитокинов при СКВ. Уровни TNFα, BAFF и IL-4 оказались значительно изменены при СКВ с сопутствующими ССЗ по сравнению с СКВ без ССЗ. Концентрация IL-4 увеличивалась в общей группе больных СКВ лишь за счет вклада больных с ССЗ. На основании этого можно предположить, что наличие сопутствующих ССЗ при СКВ способствует изменению цитокинового профиля, а также может привести к неправильной интерпретации результатов, когда не учитывается фактор сопутствующего ССЗ. Известно, что изменения профилей цитокинов и сетей цитокинов являются отличительной чертой аутоиммунных заболеваний, включая системную красную волчанку и рассеянный склероз (РС). Однако исследования профилей цитокинов обычно основаны на анализе небольшого числа цитокинов и дают противоречивые результаты. В данной работе мы проанализировали цитокиновые профили 41 цитокина у пациентов с СКВ и РС по сравнению со здоровыми донорами с помощью мультиплексного иммуноанализа. Уровни 11 цитокинов, IL-1b, IL-1RA, IL-6, IL-9, IL-10, IL-15, MCP-1/CCL2, фракталкин/CX3CL1, MIP-1a/CCL3, MIP-1b/CCL4 , а также TNFα были повышены, но уровни sCD40L, PDGF-AA и MDC/CCL22 были снижены у пациентов с СКВ. Таким образом, изменения цитокинового профиля при СКВ связаны с нарушением регуляции интерлейкинов, членов суперсемейства TNF и хемокинов. В случае РС снижались уровни 10 цитокинов, sCD40L, CCL2, CCL3, CCL22, PDGF-AA, PDGF-AB/BB, EGF, IL-8, TGF-a и VEGF достоверно по сравнению с контрольной группой. Следовательно, нарушение регуляции цитокиновой сети при РС характеризуется аномальными уровнями факторов роста и хемокинов. Перекрестный анализ уровней цитокинов при РС и СКВ показал значительные различия между 22 цитокинами. Сетевой анализ белковых взаимодействий показал, что все значительно измененные цитокины как при СКВ, так и при РС функционально взаимосвязаны. Таким образом, РС и СКВ могут быть связаны с нарушением функциональных взаимоотношений в цитокиновой сети. Анализ корреляционных сетей цитокинов выявил изменения корреляционных кластеров при СКВ и РС. Эти данные расширяют понимание аномальных регуляторных взаимодействий в профилях цитокинов, связанных с аутоиммунными заболеваниями. В результате проведенных исследований получен большой массив данных о концентрации множества цитокинов при СКВ, РС, шизофрении и здоровых доноров, а также данных об изменении цитокиновых спектров при этих патологиях и ассоциации этих изменений с клиническими особенностями заболевания. Такой объем данных позволил нам сформировать базу данных «Цитокиновые профили и клинические параметры пациентов с системной красной волчанкой, рассеянным склерозом и здоровых лиц» и получить в Роспатенте Свидетельство о государственной регистрации. Помимо этого, нами опубликован (в журнале Q1) обзор «Immune System Abnormalities in Schizophrenia: An Integrative View and Translational Perspectives», в котором систематически обобщены имеющиеся данные о нарушениях иммунной системы при шизофрении. Кроме того, разработана методика выделения субпопуляций В-лимфоцитов из селезенки мышей. Сортинг клеток был проведен на клеточном сортере Sony SH800 в центре коллективного пользования ИХБФМ СО РАН. Получены следующие популяции В клеток: B1 лимфоциты (CD19+ CD43+, продуцирующие низкоаффинные антитела), B1a лимфоциты (CD19+ CD43+ CD5+, продуцирующие низкоаффинные антитела) и B2 лимфоциты (CD19+ CD43¬, продуцирующие высокоаффинные антитела). Выявлено увеличение продукции IgG, IgA, и IgM после стимуляции В лимфоцитов CpG олигонуклеотидом (ODN 2006, активатор TLR9). Не выявлено продукции интерлейкина 10 (IL-10) и гранулоцитарно-макрофагального колониестимулирующего фактора (GM-CSF) субпопуляциями выделенных клеток. Впервые проведено хроматографическое выделение продуцируемых субпопуляциями В клеток иммуноглобулинов, но полученного количества антител оказалось мало, чтобы детально проанализировать каталитическую активность. По полученным в 2022 г. результатам нами опубликовано 3 экспериментальные статьи, 1 обзор, данные доложены на 5 Конференциях.