КАРТОЧКА
ПРОЕКТА ФУНДАМЕНТАЛЬНЫХ И ПОИСКОВЫХ НАУЧНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ,
ПОДДЕРЖАННОГО РОССИЙСКИМ НАУЧНЫМ ФОНДОМ
Информация подготовлена на основании данных из Информационно-аналитической системы РНФ, содержательная часть представлена в авторской редакции. Все права принадлежат авторам, использование или перепечатка материалов допустима только с предварительного согласия авторов.
ОБЩИЕ СВЕДЕНИЯ
Номер 20-15-00120
НазваниеМитохондриальные транспортные системы как фармакологические мишени для коррекции сахарного диабета II типа
РуководительБелослудцев Константин Николаевич, Доктор биологических наук
Организация финансирования, регион федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Марийский государственный университет", Республика Марий Эл
Период выполнения при поддержке РНФ | 2020 г. - 2022 г. | , продлен на 2023 - 2024. Карточка проекта продления (ссылка) |
Конкурс№45 - Конкурс 2020 года «Проведение фундаментальных научных исследований и поисковых научных исследований отдельными научными группами».
Область знания, основной код классификатора 05 - Фундаментальные исследования для медицины, 05-207 - Эндокринология и обмен веществ
Ключевые словамитохондрии, сахарный диабет, порин, митохондриальная пора, митохондриальный АТФ-чувствительный К+ канал, кальций
Код ГРНТИ76.03.29; 76.03.31; 34.17.27
СтатусУспешно завершен
ИНФОРМАЦИЯ ИЗ ЗАЯВКИ
Аннотация
Сахарный диабет II типа – одно из самых распространенных заболеваний, которое в настоящее время представляет собой важнейшую медико-социальную проблему, обусловленную хроническим течением, высокой инвалидизацией больных и смертностью из-за сопутствующих осложнений. В основе развития данной патологии лежит резистентность клеток организма человека и животных к гормону инсулину, что приводит к увеличению уровня глюкозы в плазме крови (гипергликемии) и сопутствующим нарушениям липидного и белкового обмена. В свою очередь, это вызывает патологические изменения структуры и функции многих органов и систем организма, в том числе может привести к развитию сердечно-сосудистых заболеваний, нефропатии, ретинопатии и других тяжелых патологий. Известно, что на внутриклеточном уровне, одной из основных мишеней сахарного диабета II типа являются митохондрии. Более того, установлено, что нарушение митохондриального биогенеза является одной из причин возникновение инсулинорезистентности клеток. Развитию сахарного диабета II типа также способствуют нарушения работы системы окислительного фосфорилирования митохондрий, гиперпродукция активных форм кислорода, ремоделирование митохондриальной сети и др. Таким образом, можно предположить, что фармакологическая или генетическая коррекция этих процессов будет приводить к клеточному перепрограммированию и ослаблению патологических последствий сахарного диабета и связанных с ним осложнений. В связи с этим основной целью данного проекта является изучение молекулярных механизмов дисфункции митохондрий сердечной и скелетной мускулатуры при развитии сахарного диабета II типа и исследование возможности коррекции этой патологии с помощью метаболических и фармакологических модуляторов митохондриальных каналов и пор. В качестве эффекторных структур, которые могут участвовать в развитии митохондриальной дисфункции при сахарном диабете II типа, будут рассмотрены пориновые каналы внешней митохондриальной мембраны (VDAC1-3), калиевые каналы митохондрий (Kv1.3 и АТФ-зависимый калиевый канал), а также такое патологическое явление как открытие MPT поры (Mitochondrial Permeability Transition pore). Как известно, эти митохондриальные системы участвуют в регуляции ионного гомеостаза клетки и скорости образования активных форм кислорода (митохондральный АТФ-зависимый К+ канал), транспорте метаболитов и растворенных соединений в митохондрии (VDAC 1-3) и активации клеточной гибели (MPT пора). Важно отметить, что в последнее время были идентифицированы некоторые из этих мембранных структур (в частности, в 2019г была определена молекулярная структура митохондриального АТФ-зависимого калиевого канала и установлены некоторые возможные компоненты порового комплекса МРТ), что позволяет по-новому оценить механизмы возникновения и развития многих патофизиологических процессов, связанных с митохондриями, и понять, как можно их можно регулировать. В настоящем проекте при моделировании сахарного диабета II типа у мышей линии C57BL/6 будет установлены функциональные особенности транспорта ионов К+ и Са2+, а также параметры открытия MPT поры в митохондриях сердца и скелетной мускулатуры. Параллельно будет проведен сравнительный анализ количества белков, входящих в состав калиевых каналов (АТФ-зависимый калиевый канал, Kv1.3), MPT поры (циклофилин Д, аденилаттранслокатор 1 и 2, с-субъединица АТФ-синтазы) и VDAC1-3 в тканях сердца и скелетных мышц у контрольных и диабетических животных, а также определен уровень экспрессии генов, кодирующих эти белки. Важной задачей данного проекта будет исследование того, как применение модуляторов данных структур in vivo влияет на развитие митохондриальной дисфункции и патологические изменения тканей сердца и скелетной мускулатуры при экспериментальном сахарном диабете II типа. Выполнение этой части проекта позволит ответить на вопрос о роли данных митохондриальных структур в развитии патологии сахарного диабета II типа. В рамках этой задачи будет оценено действие нового ингибитора MPT поры алиспоривира (обладающего кардиопротекторным эффектом), ингибиторов VDAC G3139 и DIDS, а также модуляторов митохондриальных калиевых каналов – уридина и 5-гидроксидеканоата. Будет определено, как эти соединения влияют на изменения в экспрессии генов PGC-1α (белка, ответственного за митохондриальный биогенез), митофузина 2 и DRP1 (белков, ответственных за процессы слияния и деления митохондрий) при индукции сахарного диабета II типа у мышей линии C57BL/6. С помощью электронной микроскопии будет установлено влияние этих модуляторов in vivo на ультраструктурные изменения митохондрий при данной патологии. Будет определено, как введение животным данных соединений влияет на основные параметры функционирования митохондрий сердца и скелетной мускулатуры диабетических мышей (процессы дыхания и окислительного фосфорилирования), а также степень резистентности митохондрий к открытию MPT поры, ионный транспорт и продукцию активных форм кислорода. В рамках проекта планируется также установить влияние этих соединений на показатели митохондриальной дисфункции (изменение мембранного потенциала, ионного транспорта, и др.) и выживаемость клеток при их экспозиции с глюкозой в высокой концентрации. Полученные в проекте данные позволят ответить на вопрос, способны ли данные соединения корректировать структурно-функциональные изменения митохондрий и клеток, наблюдаемые при развитии сахарного диабета II типа, и можно ли в дальнейшем использовать их в качестве терапевтических средств для комплексного лечения данной патологии.
Ожидаемые результаты
В результате выполнения проекта будут получены следующие значимые результаты:
1. На модели сахарного диабета II типа у мышей линии C57BL/6, будут установлены структурно-функциональные нарушения митохондрий сердца и скелетной мускулатуры, в том числе изменения в работе митохондриальных калиевых каналов (митохондриальный АТФ-зависимый калиевый канал, Kv1.3), пориновых каналов (VDAC1-3) и параметров образования MPT поры. Будут определены функциональные особенности этих систем, изменения содержания соответствующих белков (митохондриального АТФ-зависимого калиевого канала, Kv1.3, VDAC1-3, циклофилина Д, аденилаттранслокатора 1 и 2, с-субъединицы митохондриальной АТФ-синтазы) в митохондриях, а также уровень экспрессии генов, кодирующих данные белки, в условиях развития данной патологии. Выполнение этой задачи позволит установить, сопровождается ли сахарный диабет II типа нарушениями данных митохондриальных транспортных систем.
2. Будет установлено, как введение диабетическим мышам алиспоривира (новый ингибитор MPT поры и кардиопротектор) влияет на функционирование митохондрии сердца и скелетной мускулатуры этих животных. Будут изучены эффекты алиспоривира in vivo на параметры митохондриального дыхания и окислительного фосфорилирования, показатель кальциевой емкости и ультраструктуру органелл. Также будет изучено действие алиспоривира на уровень экспрессии генов PGC-1α (белка, ответственного за митохондриальный биогенез), митофузина 2 и DRP1 (белков, ответственных за процессы слияния и деления митохондрий) при индукции сахарного диабета II типа у мышей линии C57BL/6. Полученные данные позволят ответить на вопрос о роли образования MPT поры в патогенезе сахарного диабета II типа.
3. Будет установлено, как применение модуляторов митохондриального АТФ-зависимого калиевого канала (специфического ингибитора 5-гидроксидеканоата и уридина, предшественника активатора канала УДФ) влияет на функционирование митохондрии сердца и скелетной мускулатуры диабетических животных. Будут изучены эффекты данных соединений in vivo на параметры митохондриального дыхания и окислительного фосфорилирования, калиевый транспорт, продукцию активных форм кислорода и ультраструктуру органелл. Также будет исследовано влияние этих соединений на уровень экспрессии генов PGC-1α, митофузина 2 и DRP1 при развитии сахарного диабета II типа у мышей линии C57BL/6. Данные результаты позволят выяснить роль активации митохондриального АТФ-зависимого калиевого канала в механизмах защиты от митохондриальной дисфункции при развитии патологии сахарного диабета II типа.
4. Будет установлено, как введение диабетическим мышам ингибиторов VDAC (G3139 и DIDS) влияет на функционирование митохондрии сердца и скелетной мускулатуры этих животных. На культуре клеток HEK293 (или MEF), нокаутированных по одной из трех изоформ белка VDAC (VDAC1, VDAC2 и VDAC3), будут определены изменения функциональных параметров митохондрий (дыхание, скорость транспорта ионов кальция, мембранный потенциал, образование активных форм кислорода и др.) и выживаемость клеток при их экспозиции с глюкозой в высокой концентрации. Полученный результат позволит определить участие VDAC каналов в механизмах патогенеза сахарного диабета II типа.
5. На культуре клеток, подвергнутых экспозиции с глюкозой в высокой концентрации, будет установлено влияние перечисленных выше модуляторов митохондриальных каналов и MPT поры на выживаемость клеток и функциональные параметры митохондрий (изменение мембранного потенциала, скорости транспорта ионов кальция, продукции активных форм кислорода и др.).
Таким образом, выполнение всего проекта будет способствовать выяснению новых перспективных молекулярных мишеней для лечения сахарного диабета II типа. Важным результатом проекта будет являться рекомендация новых фармакологических модуляторов, которые будут способны корректировать митохондриальную дисфункцию при данной патологии. Поставленные в работе задачи могут быть выполнены на экспериментальной базе лаборатории и сравнимы с задачами, решаемыми в других ведущих лабораториях мира. Результаты работы будут опубликованы в форме 10 статей в высокорейтинговых зарубежных и ведущих российских журналах, индексируемых в базах данных WOS и Scopus.
ОТЧЁТНЫЕ МАТЕРИАЛЫ
Аннотация результатов, полученных в 2020 году
Согласно поставленным в проекте задачам, за отчетный период были исследованы структурно-функциональные особенности митохондрий скелетной мускулатуры и сердца при развитии сахарного диабета II типа. В задачи этапа входило определить роль MPT поры в данной патологии, а также возможность коррекции сахарного диабета II типа новым ингибитором MPT поры – алиспоривиром.
Моделирование сахарного диабета II типа (T2DM) у мышей линии C57BL/6 проводилось с посредством кормления их высокожировой диетой (в течение 1.5 месяца) с последующей многоразовой инъекцией низких доз стрептозотоцина (35 мг/кг в течение 5 дней). Развитие сахарного диабета регистрировали по глюкозо-толерантному тесту и инсулин-чувствительному тесту. Данные индексы были достоверно выше в группе T2DM (p<0.0001 по сравнению с контрольной группой). У диабетических животных наблюдалось снижение частоты сердечных сокращений по сравнению с контрольной группой и двукратное увеличение уровня малонового диальдегида в крови (p<0.01 по сравнению с контрольной группой).
Продемонстрировано, что в митохондриях скелетной мускулатуры диабетических мышей параметры дыхания и окислительного фосфорилирования (дыхательный контроль, АДФ/О) достоверно снижены (в 1.3 и 1.2 раза соответственно) по сравнению с контрольной группой, а время фосфорилирования увеличено (в 1.4 раза, p<0.05 по сравнению с контрольной группой). Подобная направленность изменений данных параметров наблюдалась и в митохондриях сердца диабетических животных (p<0.05 по сравнению с контрольной группой). Методом иммуноблоттинга было определено содержание белков, входящих в комплексы дыхательной цепи митохондрий (I-IV и АТФ-синтазы (V)). Установлено, что у диабетических животных в митохондриях скелетной мускулатуры наблюдается достоверное снижение белков, входящих в состав комплексов I и V (p<0.05 по сравнению с контрольными животными). Таким образом, подавление дыхания и окислительного фосфорилирования у диабетических животных может быть связано со снижением содержания комплексов дыхательной цепи в митохондриях.
Согласно поставленным в проекте задачам был оценен уровень малонового диальдегида в митохондриях контрольных и диабетических животных. Установлено, что в митохондриях скелетной мускулатуры и сердца диабетических животных происходит достоверное увеличение содержания малонового диальдегида в 2.6 и 1.8 раз соответственно.
В проекте исследовано, как изменяется скорость транспорта ионов Са2+ и К+ в митохондриях скелетной мускулатуры и сердца диабетических мышей. Установлено, что при развитии сахарного диабета наблюдается снижение скорости транспорта ионов К+ в митохондриях тканей (в 1.4 для митохондрий скелетной мускулатуры и в 1.6 раза для митохондрий сердца). В основе этого может лежать снижение в тканях диабетических животных белка митохондриального АТФ-зависимого К+ канала (MITOK). Вместе с тем, скорость входа ионов Са2+ в митохондрии диабетических животных, достоверно не отличалась от таковой контрольных животных. При этом не наблюдалось различий в уровне канальной субъединицы Ca2+ унипортера MCU.
В проекте исследовано, как изменяются параметры образования митохондриальной Са2+ зависимой поры (MPT) в митохондриях сердца и скелетной мускулатуры диабетических животных. Измерение Са2+ емкости показало, что у диабетических мышей данный параметр в митохондриях скелетной мускулатуры ниже на 1.2 раза, в митохондриях сердца в 1.4 раза. Таким образом, митохондрии диабетических животных обладают пониженной резистентностью к индукции MPT поры. Методом иммуноблоттинга был оценен уровень белков в митохондриях обоих тканей, участвующих в формировании MPT поры (ANT1, ANT2, VDAC1, циклофилин Д, АТФ-синтаза). Как было сказано выше в митохондриях диабетических животных наблюдается снижение уровня АТФ-синтазы (альфа субъединицы). Обнаружено, что в скелетной мускулатуре и сердце наблюдается достоверное увеличение уровня ANT2. Наблюдалось увеличение уровня VDAC2. Уровень остальных белков достоверно не изменялся.
Установлено, что в сердце и скелетной мускулатуре диабетических мышей наблюдается снижение уровня экспрессии гена митофузина2 (белка, отвечающего за слияние митохондрий) и увеличение уровня экспрессии гена Drp1 (ответственного за митохондриальное деление). Таким образом при развитии сахарного диабета нарушается митохондриальная динамика. Это также было отслежено с помощью электронной микроскопии по размеру митохондрий. Продемонстрировано, что при развитии сахарного диабета происходит набухание и гипертрофия органелл.
Таким образом, исходя из полученных данных можно заключить, что при развитии сахарного диабета в скелетной и сердечной мускулатуре происходит нарушение структуры и функции митохондрий, которые выражаются в изменении митохондриального размера, нарушении митохондриальной динамики, подавления параметров дыхания и окислительного фосфорилирования и гиперпродукции активных форм кислорода. Одним из важных патологических изменений при сахарном диабете является снижение резистентности митохондрий изучаемых тканей к открытию MPT поры.
В следующей части исследования было определено, как алиспоривир (неиммуносупрессорный аналог циклоспорина А) влияет на развитие сахарного диабета и митохондриальную дисфункцию. Установлено, что при внутрибрюшинном введении алиспоривира (2 мг/кг в день в течение 3 недель) диабетическим животным (группа T2DM+Ali) наблюдалась тенденция к восстановлению уровня сахара в крови (глюкозо-толерантный тест) и уровня малонового диальдегида в плазме.
Вместе с тем, у группы T2DM+Ali наблюдалось достоверное восстановление размера митохондрий до значений контрольной группы. В группе T2DM+Ali наблюдалось достоверное увеличение экспрессии гена митофузина 2 и снижение экспрессии гена Drp1 по сравнению с группой T2DM (p<0.05). Это говорит о том, что введение животным алиспоривира может приводить к восстановлению митохондриальной динамики.
Параллельно с этим функционирование митохондрий в группе T2DM+Ali также восстанавливалось до уровня контрольных животных. В первую очередь в митохондриях сердца и скелетной мускулатуры значительно увеличивалась резистентность к индукции MPT поры. Са2+ емкость обоих типов митохондрий в группе T2DM+Ali достоверно увеличивалась по сравнению с группой T2DM и не отличалась от контрольной группы (p<0.01). Сравнение параметров дыхания и окислительного фосфорилирования в исследуемых группах продемонстрировало, что параметр дыхательного контроля достоверно увеличивался в группе T2DM+Ali по сравнению с группой T2DM (p<0.05) и приближался к значению контрольной группы. Показано, что в группе T2DM+Ali достоверно снижается уровень малонового диальдегида в митохондриях скелетной и сердечной мускулатуры по сравнению с уровнем в митохондриях диабетических мышей (T2DM) (p<0.05 в митохондриях скелетной мускулатуры и p<0.01 в митохондриях сердца).
Таким образом, исходя из полученных в работе результатов можно заключить, что алиспоривир является агентом, способным облегчить митохондриальную дисфункцию при развитии сахарного диабета.
Публикации
1. Белослудцев К.Н., Белослудцева Н.В., Дубинин М.В. Diabetes Mellitus, Mitochondrial Dysfunction and Ca2+-Dependent Permeability Transition Pore International Journal of Molecular Sciences, 21(18), 6559 (год публикации - 2020) https://doi.org/10.3390/ijms21186559
2. Белослудцев К.Н., Белослудцева Н.В., Старинец В.С., Таланов Е.Ю., Дубинин М.В. Митохондриальная дисфункция при сахарном диабете Актуальные вопросы биологической физики и химии. БФФХ-2020: материалы XV международной научной конференции, с. 99-100 (год публикации - 2020)
Аннотация результатов, полученных в 2021 году
Согласно поставленным в проекте задачам, в отчетный период было изучено влияние уридина и ингибитора митохондриального АТФ-зависимого калиевого канала – 5 гидроксидеканоата на развитие митохондриальной дисфункции в тканях сердца и скелетной мускулатуры мышей при экспериментальном сахарном диабете. Также было продолжено исследование механизмов протекторного действия селективного ингибитора митохондриальной поры алиспоривира при гипергликемии в культивируемых эндотелиальных клетках. Кроме того, было выяснено влияние нового ингибитора митохондриального кальциевого унипортера DS16570511 на основные параметры функционирования митохондрий, и определены эффекты свободных жирных кислот (в частности, a,w-гексадекандикарбоновой кислоты) на активность дыхательных комплексов и системы окислительного фосфорилирования митохондрий.
Для решения первой задачей была воспроизведена модель сахарного диабета у мышей линии C57BL/6NCrl посредством кормления их высоко-жировой диетой (корма Envigo, содержание жира около 60%) в течение 28 дней с последующей многоразовой инъекцией низких доз стрептозотоцина (30 мг/кг, в течение 5 дней). Развитие сахарного диабета регистрировали с помощью глюкозо-толерантного теста. В дальнейшем, диабетическим и контрольным животным в течение 3 недель внутрибрюшинно вводили раствор уридина (U, 30 мг/кг) и 5-гидроксидеканоата (5HD, 5 мг/кг). Дозы вводимых соединений были выбраны на основе результатов ранее проведенных нами исследований. Таким образом, было сформировано 6 экпериментальных групп животных: 1) контроль (CTR), 2) контроль + уридин (CTR+U), 3) контроль + 5HD (CTR+5HD), 4) диабет (DM), 5) диабет + уридин (DM+U), и 6) диабет + 5-HD (DM+5HD).
Согласно результатам глюкозо-толерантного теста, применение уридина достоверно увеличивало скорость утилизации глюкозы из крови (p < 0.05, по сравнению с группой DM), тогда как введение животным 5HD не оказывало статистически значимого эффекта на параметры IPGTT и AUC IPGTT. Важно отметить, что введение 5-гидроксидеканоата достоверно увеличивало уровень инсулина в крови как у мышей контрольной группы (CTR+5HD), так и у диабетических животных (DM+5HD) (приблизительно на 30% в обоих случаях). Можно предположить, что введение контрольным животным 5-гидроксидеканоата стимулировало развитие инсулинорезистентности.
Установлено, что введение как уридина, так и 5-HD диабетическим животным (группы DM+U и DM+5HD) приводило к достоверному увеличению скоростей дыхания митохондрий сердца и скелетной мускулатуры в фосфорилирующем состоянии (V3) и параметра дыхательного контроля, по сравнению с данными показателями у диабетических животных (группа DM). При этом введение здоровым животным 5HD приводило к достоверному снижению скоростей дыхания в состоянии 3, однако не влияло на параметр дыхательного контроля.
Поскольку уридин может являться предшественником уридин-5’-дифосфата (УДФ) в клетке, который в свою очередь является активатором митохондриального АТФ-зависимого калиевого канала, а 5-гидроксидеканоат способен блокировать работу этого канала в митохондриях, в задачи работы входила оценка скорости транспорта ионов калия в митохондриях скелетной мускулатуры и сердца животных исследуемых экспериментальных групп. Обнаружено, что развитие сахарного диабета сопровождается снижением скорости 2,4-динитрофенол-индуцированного выхода калия из митохондрий скелетной мускулатуры и сердечной мускулатуры мышей в 1,6 и 1.7 раза, соответственно. Однако применение уридина и 5HD в исследуемых дозах не приводило к статистически значимому изменению ни скорости митохондриального транспорта ионов калия, ни содержания белка АТФ-зависимого калиевого канала (MITOK) в митохондриях.
При развитии сахарного диабета наблюдалось увеличение содержания продуктов перекисного окисления липидов в митохондриях скелетной и сердечной мускулатуры, определенного по уровню малонового диальдегида (p<0.05, по сравнению с группой CTR). Введение уридина диабетическим животным приводило к достоверному снижению содержания МДА как в митохондриях сердца (p<0.05), так и митохондриях скелетной мускулатуры (p<0.01, по сравнению с группой DM). Применение 5-гидроксидеканоата не влияло на повышенный уровень МДА у диабетических животных.
Продемонстрировано, что сахарный диабет сопровождается нарушением ультраструктуры митохондрий и повреждениям митохондриальной сети, в частности наблюдаются гипертрофические изменения органелл и снижается их общее число в клетках сердца и скелетной мускулатуры мышей. Введение уридина диабетическим животным приводило к частичному восстановлению ультраструктуры, количества и размера митохондрий. Введение 5HD диабетическим мышам не влияло на изменение числа и размера митохондрий в кардиомиоцитах, по сравнению с группой DM.
Установлено, что в сердце и скелетной мускулатуре мышей группы DM наблюдается увеличение экспрессии гена Drp1 и снижение экспрессии Ppargc1a, что может свидетельствовать о нарушениях процессов митохондриальной динамики и биогенеза. Введение уридина диабетическим животным (группа DM+U) приводило к увеличению экспрессии Ppargc1a до уровня контрольных животных, что говорит о стимуляции митохондриального биогенеза. В данной группе наблюдалось также увеличение экспрессии Pink1, что может косвенно свидетельствовать об активации митофагии. Экспрессия генов Drp1, Mfn2 и Ppargc1a в группе DM+5HD не отличалась от таковых показателей в группе DM.
На основе полученных результатов можно сделать вывод о том, что введение уридина диабетическим животным приводит к увеличению скорости утилизации глюкозы и в значительной степени предупреждает развитие митохондриальной дисфункции в тканях сердца и скелетной мускулатуры. Вполне вероятно, что терапевтическое действие уридина связано с перепрограммированием клеточного метаболизма и снижением уровня окислительного стресса в митохондриях сердечной и скелетной мускулатуры диабетических мышей, что способствует сохранению структуры и функции этих органелл. Вместе с тем, 5-гидроксидеканоат, широко использующийся как ингибитор АТФ-зависимого калиевого канала и бета-окисления жирных кислот в митохондриях, в исследуемых концентрациях не влияет как на процесс утилизации глюкозы из крови, так и на развитие структурных и функциональных нарушений митохондрий сердца и скелетной мускулатуры мышей при диабете. Более того, введение 5-гидроксидеканоата контрольным животным может привести к таким негативным последствиям для организма, как развитие инсулинорезистентности.
В следующей части работы были изучены антидиабетические свойства алиспоривира на первичной культуре эндотелиоцитов легких мышей при гипергликемическом стрессе. Для индукции гипергликемического стресса эндотелиальные клетки инкубировали в присутствии высокой концентрации глюкозы (30 мМ) в течение 24 часов. Показано, что гипергликемия сопровождалась достоверным снижением числа клеток и нарушением функций митохондрий, которое проявлялось в снижении митохондриального мембранного потенциала и повышении чувствительности органелл к индукции митохондриальной MPT поры. Также наблюдалось усиление митофагии, которая была определена по локализации флуоресцентных красителей MitoTracker DeepRed FM и LysoTracker Green. Добавление 5 мкМ алиспоривира к клеткам, инкубируемым в условиях гипергликемии, приводило к восстановлению всех исследуемых параметров до контрольного уровня.
Таким образом, алиспоривир оказывает протекторное действие в отношении развития митохондриальной дисфункции в первичной культуре эндотелиоцитов легких мышей при гипергликемии. Инкубация клеток в условии гипергликемии с алиспоривиром устраняет деполяризацию внутренней мембраны митохондрий и увеличивает процент выживших клеток. Настоящие результаты согласуются с данными об антидиабетическом действии алиспоривира in vivo, полученными на предыдущем этапе проекта.
В проекте проведено изучение влияния нового ингибитора митохондриального кальциевого унипортера DS16570511 (DS) на параметры функционирования митохондрий печени и мозга крыс. Установлено, что DS в концентрациях 15-60 мкМ ингибирует электрофоретический вход ионов Са2+ в митохондрии мозга и печени крыс. Исследование влияния DS на параметры дыхания и окислительного фосфорилирования продемонстрировало, что данное соединение подавляет скорость дыхания митохондрий в состоянии 3. Установлено, что DS ингибирует активность комплекса II (на 41%) и суммарную активность комплексов II+III (на 78%). Обнаружено, что DS в высоких концентрациях (45 мкМ) в присутствии ионов кальция вызывает коллапс мембранного потенциала митохондрий. Полученные данные указывают на то, что DS не является специфическим блокатором митохондриального кальциевого унипортера, как предполагалось ранее в литературе, а обладает достаточно широким спектром действия на митохондрии. Вследствие этого, DS16570511 достаточно проблематично использовать в качестве инструмента для изучения кальциевого гомеостаза в митохондриях и клетках.
Согласно поставленным в проекте задачам, было исследовано влияние свободных жирных кислот, в частности, пальмитиновой кислоты и a,w-гексадекандикарбоновой кислоты (ГДК), на функционирование системы окислительного функционирования митохондрий печени крыс. Установлено, что пальмитиновая кислота и ее дикарбоновой аналог ГДК способны стимулировать дыхание митохондрий и подавлять продукцию пероксида водорода. Вместе с тем, ингибирование генерации пероксида водорода с помощью ГДК и пальмитиновой кислоты осуществляется в результате активации разных механизмов. Установлено, что стимуляция дыхания ГДК, в отличие от классических разобщителей-протонофоров (2,4-динитрофенола) и пальмитиновой кислоты, не связана с пассивной утечкой протонов и с повреждением внутренней мембраны митохондрий. Сделано заключение о том, что ГДК является естественным десопрягающим агентом. Продемонстрировано, что специфические ингибиторы bc1-комплекса антимицин А и миксотиазол снижают десопрягающую активность ГДК. Дитионитробензоат, действующий на уровне железо-серного кластера белка Риске, усиливал активность ГДК. Предположено, что при окислении сукцината в митохондриях печени десопрягающий эффект ГДК осуществляется в основном на уровне комплекса bc1. Учитывая возможное накопление ГДК в условиях развития сахарного диабета, можно предположить, что индукция свободного дыхания в митохондриях печени с помощью ГДК на уровне bc1-комплекса может рассматриваться как один из «путей спасения» гепатоцитов при этой патологии и других состояниях, сопровождающихся нарушениями углеводного и липидного обмена, а также усилением окислительного стресса.
Публикации
1. Белослудцев К.Н., Старинец В.С., Белослудцев М.Н., Михеева В.С., Дубинин М.В., Белослудцева Н.В. Chronic treatment with dapagliflozin protects against mitochondrial dysfunction in the liver of C57BL/6NCrl mice with high-fat diet/streptozotocin-induced diabetes mellitus Mitochondrion, т. 59, с. 246-254 (год публикации - 2021) https://doi.org/10.1016/j.mito.2021.06.008
2. Белослудцев К.Н., Старинец В.С., Таланов Е.Ю., Дубинин М.В., Белослудцева Н.В. Alisporivir Treatment Alleviates Mitochondrial Dysfunction in the Skeletal Muscles of C57BL/6NCrl Mice with High-Fat Diet/Streptozotocin-Induced Diabetes Mellitus International Journal of Molecular Sciences, т. 22 (17), с. 9524 (год публикации - 2021) https://doi.org/10.3390/ijms22179524
3. Белослудцев К.Н., Шарипов Р.Р., Бояркин Д.П., Белослудцева Н.В., Дубинин М.В., Красильникова И.А., Бакаева З.В., Згодова А.Е., Пинелис, В.Г., Сурин А.М. The effect of DS16570511, a new inhibitor of mitochondrial calcium uniporter, on calcium homeostasis, metabolism, and functional state of cultured cortical neurons and isolated brain mitochondria Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - General Subjects, V. 1865(5), 129847 (год публикации - 2021) https://doi.org/10.1016/j.bbagen.2021.129847
4. Белослудцева Н.В., Старинец В.С., Михеева И.Б., Серов Д.А., Асташев М.Е., Белослудцев М.Н., Дубинин М.В., Белослудцев К.Н. Effect of the MPT Pore Inhibitor Alisporivir on the Development of Mitochondrial Dysfunction in the Heart Tissue of Diabetic Mice Biology, т. 10(9), с. 839 (год публикации - 2021) https://doi.org/10.3390/biology10090839
5. Лебедева Е.А., Дробот Г.П., Дробот В.В., Белослудцев К.Н. Effect of the trimetazidine derivative S-15176 difumarate salt on the leukocyte formula and cytochemical indices of the peripheral blood neutrophils of C57BL/6 mice in experimental type II diabetes mellitus Opera Medica et Physiologica, V 8(2), 25-34 (год публикации - 2021) https://doi.org/10.24412/2500-2295-2021-2-25-34
6. Семенова А.А., Самарцев В.Н., Дубинин М.В. The stimulation of succinate-fueled respiration of rat liver mitochondria in state 4 by a,u-hexadecanedioic acid without induction of proton conductivity of the inner membrane. Intrinsic uncoupling of the bc1 complex Biochimie, V. 181, p 215-225 (год публикации - 2021) https://doi.org/10.1016/j.biochi.2020.12.021
7. Белослудцев К.Н., Старинец В.С., Дубинин М.В., Белослудцева Н.В. Влияние алиспоривира in vivo на Сa2+-зависимую пору и перекисное окисление липидов в митохондриях сердца при индуцированном сахарном диабете ii типа у мышей Рецепторы и внутриклеточная сигнализация. Сборник статей, т.1, с. 286-290. (год публикации - 2021)
Аннотация результатов, полученных в 2022 году
Согласно поставленным в проекте задачам в отчетный период было исследовано влияние ингибиторов VDAC – VBIT-4 и DIDS на развитие сахарного диабета и сопутствующей ему дисфункции митохондрий сердца и скелетной мускулатуры. Кроме того, планировалось исследовать действие ингибиторов VDAC DIDS, TRO 19622, VBIT-4 и ингибитора митохондриальной поры S-15176 на функциональную активность изолированных митохондрий. В рамках заключительного этапа проекта было исследовано влияние VBIT-4 на выживаемость первичной культуры эндотелиоцитов в норме и в условиях гипергликемии. Также планировалось исследовать как влияет снижение экспрессии VDAC1 в фибробластах кожи человека на развитие митохондриальной дисфункции при гипергликемическом стрессе.
Для решения первой задачей проводилось моделирование сахарного диабета у мышей линии 57BL/6NCrl посредством их кормления высоко-жировой диетой (корма “Envigo”, содержание жира около 60%) в течение месяца с последующей инъекцией низких доз стрептозотоцина (30 мг/кг в течение 5 дней). Развитие патологии сахарного диабета у мышей подтверждали с помощью глюкозотолерантного теста. Ингибиторы VDAC канала VBIT-4 (10 мг/кг/день) и DIDS (10 мг/кг/день) вводили диабетическим и контрольным животным внутрибрюшинно в течение 3-х недель, через день. Таким образом, было сформировано 6 экспериментальных групп (по 9-10 мышей в каждой группе): контроль (CTR), контроль+VBIT-4 (CTR+V), контроль+DIDS (CTR+D), диабет (DM), диабет+VBIT-4 (DM+V) и диабет+DIDS (DM+D). Результаты глюкозо-толерантного теста показали, что оба исследуемых ингибитора не оказывали достоверного влияния на скорость утилизации глюкозы из крови диабетических животных. Установлено, что при моделировании патологии у животных наблюдается развитие диабетической кардиомиопатии, сопровождающейся снижением массы сердца и нарушением его функциональных параметров (снижение частоты сердечных сокращений и удлинение интервала QT). Обнаружено, что введение диабетическим животным VBIT-4 восстанавливало интервал QT (но не частоту сердечных сокращений). Это говорит о том, что данное соединение может частично снижать риск развития нарушений ритма сердца при диабете. Введение DIDS не оказывало влияние на исследуемые параметры сердца.
Показано, что экспериментальный сахарный диабет (группа DM) сопровождается развитием митохондриальной дисфункции в миокарде и скелетной мускулатуре. Наблюдалось нарушение ультраструктуры органелл, подавление скорости АДФ-стимулированного дыхания и параметра дыхательного контроля, снижение резистентности митохондрий к индукции кальций-зависимой MPT поры и увеличение уровня перекисного окисления липидов в митохондриях. Курсовое введение DIDS диабетическим животным не оказывало существенного влияния на исследуемые параметры. Введение VBIT-4 диабетическим мышам приводило к достоверному снижению уровня малонового диальдегида в митохондриях сердца, но не влияло на скорость АДФ-стимулированного дыхания, параметр кальциевой емкости. Стоит отметить, что VBIT-4 оказывал негативное влияние на функционирование митохондрий контрольных животных. Установлено, что введение DIDS и VBIT-4 диабетическим животным не влияло на уровень экспрессии генов, ответственных за митохондриальный биогенез, митохондриальную динамику и митофагию.
Полученные результаты свидетельствуют о том, что курсовое введение диабетическим животным ингибиторов пориновых каналов VBIT-4 и DIDS не приводило к нормализации митохондриальной функции и показателей развития сахарного диабета. В тоже время, VBIT-4 был способен предотвращать нарушение сердечного ритма за счет восстановления интервала QT у диабетических мышей.
В экспериментах in vitro установлено, что ингибиторы VDAC каналов DIDS, TRO-19622, VBIT-4 (30 мкМ) снижали скорость митохондриального дыхания в состоянии 3 в 1.3, 1.2 и 1.7 раза, соответственно. VBIT-4 достоверно снижал активность дыхательных комплексов I, III и IV, показатель кальциевой емкости, мембранный потенциал, а также стимулировал продукцию H2O2 в митохондриях. Соединения TRO-19622 и DIDS не обладали подобными эффектами. Установлено, что производное триметазидина S-15176 (30 мкМ) стимулирует дыхание митохондрий в состоянии 4, снижает скорость дыхания в состоянии 3, мембранный потенциал и активность комплекса III дыхательной цепи митохондрий. 10 мкМ S-15176 ингибирует открытие MPT поры. В то же время 30 мкМ S-15176 вызывает набухание органелл и снижение параметра Ca2+ емкости.
На первичной культуре эндотелиоцитов легких мышей было показано, что экспозиция клеток в течение 24ч с 30 мМ глюкозой приводит к существенному снижению их жизнеспособности. Инкубация клеток с 5 мкМ VBIT-4 приводила к восстановлению показателя жизнеспособности эндотелиоцитов в условиях гипергликемии до контрольных значений. Продемонстрировано, что гипергликемия приводит к усилению спонтанного образования MPT поры в митохондриях, падению митохондриального мембранного потенциала, а также увеличению колокализации митохондрий и лизосом, свидетельствующее об активации митофагии. Инкубация клеток в этих условиях с 5 мкМ VBIT-4 приводила к нормализации степени колокализации митохондрий и лизосом и восстановлению устойчивости митохондрий к индукции MPT поры.
На основании полученных данных можно сделать вывод, что VBIT-4 обладает широким спектром действия и может иметь несколько внутриклеточных и митохондриальных мишеней. В низких концентрациях VBIT-4 предупреждает развитие гипергликемического стресса в первичной культуре эндотелиоцитов, однако повышение концентрации данного соединения приводит к нарушению функционирования митохондрий. Курсовое применение VBIT-4 не влияет на прогрессирование сахарного диабета у мышей и сопутствующую ему митохондриальную дисфункцию. Кроме того, VBIT-4 оказывал негативное действие на основные параметры функционирования митохондрий у контрольных животных.
С целью оценки роли пориновых каналов в развитии гипергликемического стресса, в проекте была получена культура фибробластов кожи человека с пониженной экспрессией гена VDAC1. Продемонстрировано, что клетки со сниженной по VDAC1 экспрессией были практически не чувствительны к цитотоксическому действию высоких (30 мМ) концентраций глюкозы в среде. Установлено, в условиях гипергликемии в фибробластах наблюдается увеличение уровня супероксид аниона, регистрируемого с помощью зонда DCF. При снижении экспрессии VDAC1 в фибробластах это увеличение становится менее выраженным по сравнению с контролем (1,97 против 1,67 раз, соответственно). Полученные данные могут указывать на то, снижение экспрессии VDAC1 является защитным механизмом при развитии гипергликемического и окислительного стресса. Продемонстрировано, что относительное снижение флуоресценции кальцеина в присутствии кобальта, индуцированное гипергликемией, в клетках с пониженной экспрессией VDAC1 менее выражено (в 1.18 раза) чем в случае немодифицированных клеток (в 1.35 раза). Это может говорить о снижении спонтанной активности открытия MPT поры в модифицированных фибробластах по сравнению с контролем. Установлено, что сниженная экспрессия VDAC1 не приводит к восстановлению уровня колокализации митохондрий и лизосом, отражающей интенсивность процесса митофагии.
На основании результатов текущего этапа проекта можно сделать вывод о том, что фармакологическое ингибирование VDAC, либо снижение экспрессии VDAC1 являются механизмами, предотвращающими развитие гипергликемического стресса в первичных культурах клеток. Однако в экспериментах in vivo на модели сахарного диабета у 57BL/6NCrl мышей, используемые в проекте ингибиторы пориновых каналов VBIT-4 и DIDS не обладали ярким терапевтическим действием. В связи с этим, необходим дальнейший скрининг антидиабетического действия других ингибиторов пориновых каналов в экспериментах на животных и клеточных культурах.
Все поставленные в отчетный период задачи выполнены в полном объеме. По результатам работы опубликованы 3 статьи (две из которых в журналах Q1, и одна – в журнале Q2) и представлены 2 устных доклада на конференциях.
Публикации
1. Белослудцева Н.В., Старинец В.С., Михеева И.Б., Белослудцев М.Н., Дубинин М.В., Миронова Г.Д., Белослудцев К.Н. Effect of Chronic Treatment with Uridine on Cardiac Mitochondrial Dysfunction in the C57BL/6 Mouse Model of High-Fat Diet–Streptozotocin-Induced Diabetes International Journal of Molecular Sciences, 23, 18, 10633 (год публикации - 2022) https://doi.org/10.3390/ijms231810633
2. Белослудцева Н.В., Старинец В.С., Семенова А.А., Игошкина А.Д., Дубинин М.В., Белослудцев К.Н. S-15176 Difumarate salt can impair mitochondrial function through inhibition of the respiratory complex III and permea-bilization of the inner mitochondrial membrane Biology, 11, 3, 380 (год публикации - 2022) https://doi.org/10.3390/biology11030380
3. Старинец В.С., Серов Д.А., Пеньков Н.В., Белослудцева Н.В., Дубинин М.В., Белослудцев К.Н. Алиспоривир нормализует митохондриальную функцию в первичной культуре эндотелиоцитов легких мышей в условиях гипергликемии Биохимия, 87, 7, 851-864 (год публикации - 2022) https://doi.org/10.31857/S0320972522070028
4. Белослудцев К.Н., Старинец В.С., Дубинин М.В., Белослудцева Н.В. Алиспоривир ослабляет митохондриальную дисфункцию в клетках скелетной мускулатуры при экспериментальном сахарном диабете у мышей Motor control 2022: Сборник тезисов IX Российской, с международным участием, конференции по управлению движением, посвященной 95-летию со дня рождения И. Б. Козловской, с. 55 (год публикации - 2022)
5. Белослудцев К.Н., Старинец В.С., Дубинин М.В., Белослудцева Н.В. Влияние алиспоривира на развитие митохондриальной дисфункции при сахарном диабете в экспериментах in vivo и in vitro Современные проблемы естественных наук и фармации. Сборник статей всероссийской научной конференции, вып. 11, с.16-19 (год публикации - 2022)
6. - Родственник нуклеотида в РНК вылечил сердце мышей-диабетиков и облегчил последствия мышечной дистрофии сайт РНФ, - (год публикации - )
7. - Сердца мышей-диабетиков вылечил «родственник» нуклеотида в РНК, облегчив последствия мышечной дистрофии Сайт РАН, - (год публикации - )
8. - оссийские ученые выяснили, как можно восстановить клетки сердца у больных диабетом Газета.ру, - (год публикации - )
9. - Российские учёные выяснили, как можно восстановить клетки сердца у больных диабетом HABR, - (год публикации - )
10. - https://politnews.net/284195 Polit News, - (год публикации - )
11. - УЧЁНЫЕ ОПОРНОГО ВУЗА МАРИЙ ЭЛ И ПУЩИНО РАБОТАЮТ НАД СОЗДАНИЕМ ЛЕКАРСТВА ОТ ТЯЖЕЛЫХ ПАТОЛОГИЙ Марийская правда, - (год публикации - )
12. - Родственник нуклеотида в РНК вылечил сердце мышей-диабетиков и облегчил последствия мышечной дистрофии Indicator, - (год публикации - )
Возможность практического использования результатов
Сахарный диабет (СД) относится к категории социально-значимых хронических заболеваний с эпидемическими темпами роста распространенности. Согласно данным официальной статистики, в 2021 г. в России насчитывалось 5,2 миллиона больных сахарным диабетом. По данным Федерального бюро медико-социальной экспертизы, общая численность инвалидов, страдающих диабетом, составила 326,7 тыс. человек среди взрослых и 41,1 тыс. среди детей. По сравнению с 2018 годом инвалидность выросла у взрослых на 3,6%, у детей - на 8,8%. Кроме того, известно, что пациенты с диабетом относятся к группе высокого риска развития пневмонии COVID-19. Современный образ жизни общества и постоянный рост числа больных диабетом позволяет говорить о том, что несмотря на достаточно широкий спектр стратегий для лечения этого заболевания, необходим дальнейших поиск новых лекарственных средств. Полученные в проекте результаты позволяют говорить о том, что митохондриальный-направленная терапия может быть новым научным подходом для лечения сахарного диабета. Согласно полученным в настоящем проекте, уридин может являться компонентом комплексной терапии, которая может быть использована не только для усиления утилизации глюкозы клетками человека, но и при патологиях сердца, в том числе инфаркте и диабетической кардиомиопатии.