Аннотация результатов, полученных в 2020 году
В 2020 году были получены данные о цитотоксической активности синтезированных нами пирролл-сожержащих гетероциклических соединений в отношении ряда опухолевых клеточных линии сарком мягких тканей (RD рабломиосаркома, SK-LMS-1 лейомиосаркома, HT-1080 фибросаркомы и др.) и гастроинтестинальных стромальных опухолей ( GIST T-1, 882, 430 и T-1R). Были выявлены 4 наиболее активных соединения, проявлявшие свою активность, в том числе, для опухолевых клеток с генотипическими и фентопическими признаками устойчивости к действию известных лекарственных химиопрепаратов, например, доксорубицину и паклитакселу. Изучение молекулярного механизма действия вышеуказанных соединений показало их способность влиять на динамическое состояние микротрубочек веретена деления, вызывать полимерихацию тубулина и способствовать накоплению опухолевых клеток в M-фазе клеточного цикла. Результатом вызванных нарушений являлось последующее ослабление процессов пролиферации опухолевых клеток и усиление их гибели по механимзу апоптоза. Было обнаружено, что про-апоптотический эффект пирролл-сожержащих гетероциклических соединений напрямую коррелирует с их способностью вызывать нарушения полимеризации тубулина, где соединение 2-APCA-III, обладавшее наибольшей проапоптотической активностью в отношении большинства исследованных опухолевых клеточных линий обладало наибольшей способностью вызывать полимеризацию тубулина in vitro. Было также обнаружено, что данные соединения не обладают способностью индуцировать повреждения ДНК, о чем свидетельствовали отрицательные результаты теста одноклеточного электрофореза (теста-комет). Помимо изучения цитотоксической активности вышеуказанных соединений в отношении сарком мягких тканей и ГИСО, была также показана их активность в отношении опухолевых клеточных линий других солидных опухолей - например, немелкоклеточного рака легкого H1299, тройного негативного рака молочной железы НСС1806 и MDA-MB-231, рака предстательной железы РС-3 и др. Важным также явился тот факт, что высокая цитотоксическая активность данных соединений была доказана в отношении опухолевых клеточных линий с фенотипическими и генотипическими признаками множественной лекарственной устоучивости (МЛУ) и резистентности к химиопрепаратам (таксанам и ингибиторам топоизомеразы II типа). Примечательно, что половинная ингибирующая доза (IC50) вышеукзанных соединений в отношении резистентных к действию химиопрепаратов опухолевых клеточных линий была сопоставима с таковыми показателями для опухолевых клеток, чувстивительным к действию таксанов и ингибиторов топоизомеразы II типа. Этот факт свидетельствует как о безусловной высокой клинической перспективности синтезированных соединений, так и о наличии новой молекулярной мишений их действия. Было обнаружено, что наиболее активное соединение 2-APCA-III обладает способностью существенным образом снижать уровень экспрессии рекомбиназы Rad51 в опухолевых клетках различного происхождения. Данны факт создает предпосылки для его потенциального использования в качестве препарата, способного вызывать сенситизацию опухолевых клеток к действию ДНК-повреждающих факторов (химиотерапия, лучевая терапия). По результатам проведенных исследований по изучению цитотоксической активности пирролл-содержащих гетероциклических соединений были поданы 3 заявки в Федеральную службу интеллектуальной собственности и института промышленной собственности (ФИПС) (регистрационные номера 2020130076 от 14.09.2020, 2020133367 от 12.10. 2020, 2020133666 от 14.10.2020. Также были обнаружены признаки активации AKT-сигнального пути в клетках ГИСО и сарком мягких тканей, что явилось предпосылкой для проведения исследований по изучению воможности сенситизации данных опухолевых клеток к действию химиопрепаратов. Результаты последущих исследований показали, что ингибирование АКТ-сигнального пути в значительной степени снижает эффективность процессов репарации повреждений ДНК по механизму гомологичнной рекомбинации, в результате чего происходит сенситизации опухолевых клеток к действию ингибиторов топоизомеразы II типа, доксорубицину.

Аннотация результатов, полученных в 2021 году
В результате проведенных в 2021 году исследований были получены данные о выраженной цитотоксической и противоопухолевой активности у 12 пиррол-содержащих гетероциклических соединений (всего было проанализировано 42 соединения). Была показана высокая активность вышеуказанных соединений в отношении опухолевых клеточных линий рака молочной железы, легкого, предстательной железы, а также сарком мягких тканей и гастроинтестинальных стромальных опухолей. Важно отметить, что данная активность также была получена и в отношении опухолевых клеток, резистентных к действию химиопрепаратов (например, паклитаксела и доксорубицина), а также таргетных препаратов (например, иматиниба мезилата). Основным молекулярным механизмом действия данных соединений являлась их способность нарушать процессы полимеризации тубулина, что, в свою очередь, нарушало сборку микротрубочек веретена деления и, в конечном счете, приводило к остановке клеточного цикла в М-фазе. Результатом вышеописанных событий явилась гибель опухолевых клеток по механизму апоптоза. Результаты проведенного молекулярного докинга наиболее активных соединений показали, что наиболее вероятным сайтом их связывания является так называемый колхициновый сайт белка тубулина. Проведенный структурно-функциональный анализ показал,что наличие аминогруппы в положении 3 пиррольного кольца является одним из основных факторов, обеспечивающих минимальную энергию связывания лигандов в тубулином и их наибольшую цитотоксическую активность, находившую в диапазоне 0.5-10 ммоль/л. Таким образом, в результате проведенных исследований была показана максимальная аффинность у наиболее активных соединений к колхициновому сайту связывания в тубулине, что коррелировало с полученными нами ранее данными о способности соединений нарушать процессы полимеризации тубулина и сборки микротрубочек веретена деления. Основные результаты данного исследования представлены в статье Boichuk S., et al. "The Design, Synthesis, and Biological Activities of Pyrrole-Based Carboxamides: The Novel Tubulin Inhibitors Targeting the Colchicine-Binding Site", опубликованной в журнале Molecules в 2021 году (https://www.mdpi.com/1420-3049/26/19/5780/htm). Данные о высокой цитотоксической активности вышеуказанных пиррол-содержащих гетероциклических соединений in vitro нашли свое подтверждение и в исследованиях in vivo на моделях ксенографтных опухолей. Было показано статистически значимое уменьшение размеров ксенографтных опухолей уже спустя 5 суток после начала введения их экспериментальным животным. На конечном сроке эксперимента (21 день) размеры опухолей уменьшались почти 20-кратно для ряда вводимых соединений, что превышало значения контрольной группы животных, получавших химиопрепараты (например, паклитаксел). Изменение размеров ксенографтных опухолей во всех экспериментальных группах коррелировало с их гистологическими и иммуногистохимическими показателями. Так, в опухолях животных, которым вводили пиррол-содержащие гетероциклические соединения, отмечалось значительно уменьшение количеств пролиферирующих клеток (оценивалось по экспрессии маркера Ki-67). Кроме этого, в опухолях данных экспериментальных групп животных отмечалось значительное усиление гибели клеток по механизму апоптоза, о чем свидетельствовало повышение количеств каспаза-3-позитивных клеток. Важно отметить, что выраженных противоопухолевый эффект был также отмечен в отношении ксенографтных опухолей, возникших в результате инокуляции лабораторным животным клеток рака молочной железы с фенотипическими признаками множественной лекарственной устойчивости (клеточная сублиния НСС1806-Tx-R, полученная в нашей лаборатории путем длительно культивирования клеток линии НCC 1806 с постепенно увеличивающимися концентрациями паклитаксела). Также было обнаружена способность вышеуказанных соединений снижать уровень экспрессии ряда белков, участвующих в процессах репарации повреждений ДНК. Это, в первую очередь, касалось рекомбиназы Rad51, координирующей эффективность процессов гомологичной рекомбинации ДНК. Дальнейшие исследования показали, что пиррол-содержащие гетероциклические соединения способствуют ее ускоренной протеасом-зависимой деградации. В пользу этого свидетельствовало как усиление уровня экспрессии в опухолевых клетках, культивированных с ингибитором протеасом MG-132, так и положительные результаты ко-иммунопреципитации Rad51 и убиквитина в опухолевых клетках культивированных с исследуемыми соединениями. Были также получены данные о способности пиррол-содержащих гетероциклических соединений нарушать процесс "сборки" репаративного комплекса в местах двунитевых разрывов ДНК. Помимо снижения фокального распределения рекомбиназы Rad51, аналогичная закономерность была выявлена в отношении белков RPA и BRCA1. Полученные данные свидетельствуют о возможности проведения сенситизации опухолевых клеток к действию химиопрепаратов, инкубированных в присутствии пиррол-содержащих соединений. Часть описанных выше результатов отражено в статье Boichuk S., et.al. "2-APCAs, the Novel Microtubule Targeting Agents Active against Distinct Cancer Cell Lines", опубликованной в журнале Molecules в 2021 году (https://www.mdpi.com/1420-3049/26/3/616).

Аннотация результатов, полученных в 2022 году
За отчетный период было синтезировано 28 пиррол-содержащих гетероциклических соединения и проведена оценка их цитотоксических свойств против опухолевых клеточных линий различного происхождения, а именно: сарком мягких тканей (фибросаркома HT-1080, лейомиосаркома SK-LMS-1, рабдосаркома RD), остеосарком (U2-OS, SaOS-2), гастроинтестинальных стромальных опухолей (GIST T-1), а также рака легких (H1299), рака молочной железы (HCC1806, MDA-MB-231). В исследование были включены первичные опухолевые клетки (лейомиосаркомы, n=3). Было показано, что некоторые из указанных соединений (n=6) обладают цитотоксическим действием на большинство вышеуказанных линий опухолевых клеток, причем их цитотоксический эффект был дозо- и времязависимым, а значения их половинных ингибирующих концентраций (IC50) варьировали в пределах 0.7 – 12.2 мкМ. Основным механизм действия этих соединений являлась их способность вызывать гибель опухолевых клеток по механизму апоптоза, что подтверждалось повышенной экспрессией соответствующих маркеров (расщепленные форм PARP и каспазы-3), а также кведисение числа аннексин V-позитивных клеток. Была обнаружена способность данных соединений вызывать нарушения регуляции клеточного цикла в опухолевых клетках, а именно приводить к накоплению клеток в М-фазе клеточного цикла, что подтверждалось изменением формы клеток (накопление клеток круглой формы) и повышенным уровнем экспрессии специфических маркеров (гистона 3, фосфорилированного по остаткам серина в положении 10). Эти изменения явились результатом нарушения динамического состояния микротрубочек в результате ингибирования процессов полимеризации тубулина, что подтверждалось результатами исследований по динамической оценке полимеризации тубулина, а также результатами иммунофлуоресцентного окрашивания белков цитоскелета в опухолевых клетках. Таким образом было показано, что пиррол-содержащие соединения проявляют цитотоксическую и анти-пролиферативную активность в отношении опухолевых клеток благодаря своей способности нарушать процессы полимеризации тубулина и динамического состояния микротрубочек веретена деления (патент 2777209). Дальнейшие исследования были направлены на поиск возможных мест связывания пирролсодержащих гетероциклических соединений с тубулином. Для решения этой научной задачи был использован последовательный алгоритм для выявления неизвестных сайтов связывания: слепой докинг в двух режимах Glide SP (стандартный протокол) и Glide XP (экстремальный протокол). Основываясь на результатах компьютерного моделирования мы получили данные об "идеальных" кандидатах in silico, имеющих минимальные значения энергии связывания в слепом докинге, в методе MM-GBSA, и имеющих низкие значения энергии связывания. Это позволило выявить 3 лидерных соединения - Этил-2-Амино-1-бензамидо-5-(3,3-диметил-2-оксобутилиден)-4-оксо-4,5- дигидро-1Н-пиррол-3-карбоксамида (соединение 36), 2-Амино-1-бензамидо-5-[2-нафталин-2-ил)-2-оксобутилиден)-4-оксо-4,5- дигидро-1Н-пиррол-3-карбоксамид (соединение 61) и 2-Амино-1-бензамидо-5-(3,3-диметил-2-оксобутилиден)-4-оксо-4,5- дигидро-1Н-пиррол-3-карбоксамид (соединение 84), как наиболее эффективные (среди всех изученных пирролсодержащих гетероциклических соединений) лиганды, связывающиеся с тубулином. Важно отметить, что данные, полученные in silico, коррелировали с их функциональной активностью, которые показали их максимальную активность в отношении полимеризации тубулина, что, в свою очередь, коррелировало с результатами цитотоксической, проапототической и противоопухолевой активности пирролсодержащих гетероциклических соединений. В дальнейшем метод компьютерного моделирования был дополнен методом индуцированного докинга, который учитывал изменения конформации обеих взаимодействующих структур (рецептор линад) при их связывании друг с другом. Это позволило получить данные о связывании лиганда с рецептором на основе параметра IDF score. На основании максимального значения IFD были отобраны конформации лиганд-белкового комплекса для следующих этапов молекулярного моделирования, которые включали метадинамический анализ для оценки стабильности изучаемых взаимодействий. В данном случае, согласно исследуемому параметру RMSD (Root-mean-square deviation of atomic positions), отражающему среднее физическое расстояние между всеми эквивалентными атомами одного лиганда, соединение 36 оказалось наиболее стабильным, что свидетельствовало о его максимальной способности связываться с лигандом (тубулином)(Boichuk S., at al. Molecules, 2022; https://www.mdpi.com/1420-3049/27/9/2873/htm). Был также проведен анализ генотоксичности 5 пирролсодержащих гетероциклических соединений, обладающих наибольшей цитотоксической активностью в отношении опухолевых клеток. Результаты теста ДНК-комет показали отсутствие способности указанных соединений вызывать повреждение ДНК как в опухолевых, так и в неопухолевых клетках, что коррелировало с отсутствием экспрессии маркеров повреждения ДНК, выявленных методами иммуноблоттинга и иммунофлуоресценции (в частности, гистона 2А, фосфорилированного по остаткам серина в положении 139). Это подтверждалось отсутствием активации путей репарации повреждений ДНК в опухолевых клетках, подвергшихся воздействию указанных соединений. В частности, уровень экспрессии фосфорилированных (т.е. активированных) форм сенсорных (ATM, ATR и DNA-PK), а также эффекторных (Chk1/2) киназ не превышал фоновых значений и был значительно ниже, чем в опухолевых клетках, подвергшихся воздействию ДНК-повреждающих факторов (химиотерапевтических препаратов, включая доксорубицин, этопозид, цисплатин). Мы также обнаружили способность соединения 36 ингибировать процессы гомологичной рекомбинации ДНК в опухолевых клетках различного происхождения. Эти данные были получены с использованием клеточных линий, содержащих репортерные конструкции GFP для оценки эффективности процессов гомологичной рекомбинации и негомологичного связывания концов ДНК. Последующие исследования показали, что основным молекулярным механизмом, приводящим к ослаблению процессов гомологичной рекомбинации в опухолевых клетках, является способность соединения усиливать протеасомно-опосредованную деградацию рекомбиназы Rad51, что приводило к значительному снижению уровня ее экспрессии (Бойчук С.В. и др., 2022; https://sciencejournals.ru/view-article/?j=biokhsm&y=2022&v=87&n=4&a=BioKhsm_2204006Boichuk). Следствием этого явилась способность соединения 36 потенцировать действие некоторых химиопрепаратов (например, доксорубицина) на опухолевые клетки и вызывать их гибель по механизму апоптоза. Важно отметить, что этот механизм был впервые обнаружен и для химиопрепаратов, влияющих на динамическое состояние микротрубочек веретена деления (например, паклитаксел), что свидетельствует об общих биологических механизмах сенсибилизации опухолевых клеток этими веществами к действию ДНК-повреждающих агентов (Boichuk S., et.al., 2022; https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/35790377/ ). Кроме того, мы изучили противоопухолевую активность вышеуказанных лидерных соединений, которые проявили наиболее сильную цитотоксическую активность in vitro. Существенная противоопухолевая активность была обнаружена для соединений 36 и 84. Важно, что данная активность была онаружена в отношении ксенотрансплантатов опухолей с фенотипическими признаками устойчивости в действию некоторых химиопрепаратов (паклитаксел, доксорубицин), о чем свидетельствовало значительное снижение скорости роста опухолей, увеличение признаков миксоидной дегенерации и количества апоптотических (каспаза-3 положительных) клеток.